Summary
Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.
Abstract
Filamenteuze schimmels zijn succesvolle bewoners van de bodem en spelen een belangrijke rol in bodemecosystemen, zoals bij de afbraak van organische en anorganische stoffen, evenals de regulering van nutriëntenniveaus. Daar vinden ze ook tal van mogelijkheden om te communiceren met een verscheidenheid aan andere microben zoals bacteriën of andere schimmels. Het bestuderen van schimmelinteracties op cellulair niveau kan echter een uitdaging zijn vanwege de black box-achtige aard van de bodem. Nieuwe microfluïdische hulpmiddelen worden ontwikkeld voor de studie van schimmelinteracties; twee platforms die zijn ontworpen om bacteriële-schimmel- en schimmel-schimmelinteracties te bestuderen, worden benadrukt. Binnen deze microkanalen kunnen schimmel-microbiële interacties worden gemonitord in gecontroleerde fysisch-chemische omgevingen met een hogere temporele en ruimtelijke resolutie dan voorheen mogelijk was. Toepassing van deze hulpmiddelen heeft tal van nieuwe biologische inzichten opgeleverd, zoals de observatie van bacteriële polaire aanhechting aan schimmeldraden of het onthullen van niet-gekarakteriseerde schimmel-schimmelantagonismen. Een belangrijk kenmerk van deze methodologieën betreft het gebruiksgemak van deze tool door niet-experts, wat zeer vertaalbare technologieën oplevert voor gebruik in microbiologische laboratoria.
Introduction
De bodem is een uitzonderlijk diverse omgeving met een overvloed aan micro-organismen die een belangrijke rol spelen voor koolstof- en fosforcycli 1,2. Filamenteuze schimmels zijn een belangrijk onderdeel van talrijke ecosystemen als afbrekers van organische en anorganische materie en kunnen de voeding van planten verbeteren door de vorming van symbiotische relaties 3,4. In de bodem interageren schimmels dynamisch met een veelheid aan microben zoals andere schimmels5, bacteriën6, virussen7 en nematoden8. Deze interacties hebben aanzienlijke gevolgen voor de bodem- en plantgezondheid. Maar als gevolg van een gebrek aan geschikte experimentele systemen die in staat zijn om interagerende micro-organismen met hoge resolutie in beeld te brengen, blijven velen ongedefinieerd.
Onderzoeken met betrekking tot bacteriële-schimmelinteracties (BFI's) en schimmel-schimmelinteracties (FFI's) hebben waardevolle toepassingen op verschillende gebieden, waaronder antimicrobiële stoffen in de geneeskunde en biologische bestrijders in de landbouw. De schimmel Coprinopsis cinerea produceert bijvoorbeeld het peptide copsine, waarvan is aangetoond dat het antibacteriële activiteit vertoont tegen de menselijke ziekteverwekker Listeria monocytogenes9. Evenzo wordt de van schimmel afgeleide verbinding, griseofulvine, veel gebruikt als behandeling voor menselijke schimmelinfecties en is bovendien in staat om de groei van de plantpathogene schimmel Alternaria solani10,11 te remmen. Verschillende stammen van de bodembewonende bacterie Bacillus subtilis zijn ook effectieve biocontrolemiddelen gebleken van de schimmelplantpathogeen Rhizoctonia solani12,13. Niettemin, als gevolg van beperkingen in verband met traditionele methodologieën, worden BFI's en FFI's slecht begrepen op het niveau van enkele cellen.
Conventionele studies onderzoeken meestal BFI's en FFI's op macroschaal met behulp van agarplaten met twee of meer soorten in confrontatie. Hun interactie wordt beoordeeld door het meten van groeisnelheden en metabolietproductie van de confronterende soort 14,15,16; deze methodologie wordt echter alleen opgelost tot op kolonieniveau. Om interacties op cellulair niveau te bestuderen, kunnen bacteriële en schimmelinoculanten worden gekweekt op glazen microscoopglaasjes bedekt met agar die vervolgens worden afgebeeld onder een microscoop17. Niettemin kan het moeilijk zijn om een enkele hypha te volgen met behulp van microscoopglaasjes vanwege een gebrek aan opsluiting, wat betekent dat time-lapse-beelden moeilijker te verkrijgen zijn. Verder is de mogelijkheid om andere micro-organismen ruimtelijk op te sluiten binnen gedefinieerde gebieden van het schimmelmycelium of gedefinieerde chemische omgevingen te creëren die bijvoorbeeld kunnen worden verstoord, niet mogelijk in dergelijke opstellingen. De "black box" aard van de bodem draagt ook bij aan de complexiteit van het bestuderen van schimmel-microbiële interacties op het niveau van enkele cellen18. Door interagerende soorten te observeren, weg van de ongelooflijke diversiteit van het bodemmicrobioom, kan de exacte manier waarop individuele leden met elkaar omgaan worden beoordeeld. Er is dus een voortdurende behoefte aan veelzijdige platforms die hoge-resolutie, single-cell imaging van BFI's en FFI's mogelijk maken.
Microfluïdische technologieën, zogenaamde lab-on-a-chip-systemen, bieden een ideaal platform voor de studie van BFI's en FFI's op het niveau van enkele cellen. Het gebied van microfluïdica, afkomstig van technologieën die zijn ontwikkeld voor chemische analyse en micro-elektronica, is overgenomen door de biologische wetenschappen19. Microfluïdische technologieën reguleren kleine hoeveelheden vloeistoffen binnen een op maat gemaakt netwerk van geminiaturiseerde kanalen, met ten minste één dimensie op micrometerschaal, en hun gebruik in biologisch onderzoek breidt zich uit20. In het bijzonder zijn microfluïdische apparaten ontwikkeld om de groei van filamenteuze schimmels 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 te onderzoeken. Een voordeel van het gebruik van deze technologie is dat de opsluiting van schimmeldraden en de verdeling van voedingsstoffen in microkanalen meer lijkt op de structuur van het bodemmilieu dan conventionele agarmethoden31. Onlangs zijn microfluïdische platforms gebruikt om interacties tussen menselijke neutrofielen en schimmelpathogenen32, bacteriën en plantenwortels33, evenals schimmels en nematoden34,35 te onderzoeken.
Een van de vele voordelen van het gebruik van microfluïdica voor het bestuderen van microbiële interacties omvat de specifieke controle van de microkanaalomgeving. Laminaire stromingsregimes kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om gedefinieerde concentratiegradiënten te genereren, wat vooral handig is bij het onderzoeken van bacteriële chemotaxis36. Een ander voordeel is dat de transparante aard van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS), een goedkoop, biocompatibel elastomeerpolymeer dat vaak wordt gebruikt bij de vervaardiging van microfluïdische apparaten, beeldvorming met hoge resolutie van afzonderlijke cellen met behulp van brightfield- en fluorescentiemicroscopiemogelijk maakt 37. Evenzo betekent de opsluiting van microben in microkanalen dat time-lapse-experimenten kunnen worden uitgevoerd die afzonderlijke cellen volgen, waardoor individuele cellulaire reacties kunnen worden geregistreerd en gekwantificeerd37. Ten slotte, aangezien microfluïdische apparaten kunnen worden ontworpen om gebruiksvriendelijk te zijn, kunnen ze gemakkelijk worden gebruikt door niet-experts38.
Het bevorderen van de kennis van de interacties tussen bodembewonende micro-organismen is belangrijk voor het verbeteren van duurzame ecosysteembeheerpraktijken die de biodiversiteit in stand houden en om de gevolgen van klimaatverandering voor terrestrische milieus te beperken39. De ontwikkeling van nieuwe microfluïdische hulpmiddelen is dus van fundamenteel belang om het begrip van schimmels en hun interacties op cellulair niveau uit te breiden. Het protocol hier zal zich richten op twee microfluïdische apparaten die zijn geproduceerd voor de studie van BFI's40 en FFI's41 zoals weergegeven in figuur 1.
Figuur 1: Visuele en schematische weergave van de bacteriële-schimmelinteractie (BFI) en schimmel-schimmelinteractie (FFI) apparaten. (A) Afbeelding van het BFI-apparaat. Een myceliale plug wordt geplaatst bij de ingang van het ene uiteinde van de microkanalen om hyphale groei in het apparaat mogelijk te maken. De bacteriële inlaat bevindt zich aan de andere kant. Schaalbalk = 5 mm. (B) Schematisch overzicht van het BFI-apparaat, met de positionering van de bacteriële inlaten en de richting van de hyphale groei door de interactiemicrokanalen. De kanalen zijn 10 μm diep, 100 μm breed en 7 mm lang, met in totaal 28 observatiekanalen. (C) Confrontatietest op agarplaat tussen Coprinopsis cinerea en Bacillus subtilis NCIB 3610, schaalbalk = 20 mm (links). Microscopiebeelden die de interactie tonen tussen C. cinerea en B. subtilis NCIB 3610 binnen het microkanaal (midden en rechts), d.w.z. polaire aanhechting van bacteriën aan schimmeldraden. Schaalbalk = 25 μm (midden) en 10 μm (rechts). (D) Afbeelding van het FFI-apparaat dat is verbonden met een petrischaal met glazen bodem, dubbel ingeënt met myceliale pluggen. Schaalbalk = 1 cm. (E) Schematisch overzicht van het FFI-apparaat. Twee schimmelinoculante pluggen worden in de inlaten aan beide uiteinden van het apparaat gebracht, waardoor hyphale exploratie van de microkanalen mogelijk is. Controlekanalen zijn slechts verbonden met één schimmelinlaat en hebben een doodlopend kanaal, waardoor interacties tussen de testschimmels worden voorkomen. Interactiekanalen verbinden beide schimmelinlaten en maken hyphale interacties tussen de proefpersonen in het microkanaal mogelijk. Elk interactiekanaal bestaat uit 18 diamantvormige secties, met een totale lengte van 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm diep en met een verbindingsgebied tussen elke diamant van 20 μm. Kanaaltypen worden gedupliceerd, schaalbalken = 1 mm. (F) Interactiezone tussen twee naderende hyphale fronten, groeiend uit tegenovergestelde uiteinden van het onderling verbonden interactiekanaal. Fasecontrastmicroscopiebeeld, schaalbalk = 250 μm. De panelen in deze figuur zijn aangepast van Stanley et al., 2014 (A-C)40 en Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een samenvatting van de procedures die in dit protocol worden beschreven, wordt visueel weergegeven in figuur 2.
Figuur 2: Schematische weergave van de gepresenteerde methodologie bestaande uit vijf belangrijke secties die in dit protocol worden beschreven. Apparaatontwerpen worden gemaakt met behulp van CAD-software (Computer Aided Design) en een hoofdmal vervaardigd met behulp van fotolithografie (1). Dit wordt gebruikt om poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) te gieten, dat vervolgens in blokjes wordt gesneden en aan petrischalen met glazen bodem wordt gebonden om de microfluïdische apparaten te vormen (2). Microben die in het onderzoek moeten worden opgenomen, worden gekweekt (3) en gebruikt om de apparaten in te enten (4). Interacties worden bestudeerd met behulp van microscopie en gekwantificeerd met behulp van beeldanalysetechnieken (5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Master mold fabricage
- Productie van fotomaskers
- Genereer microfluïdische apparaatontwerpen met behulp van CAD-software (Computer Aided Design). De afmetingen van de gepresenteerde apparaten worden gegeven in figuur 1 en meer details over de specifieke ontwerpkenmerken worden uitgebreid vermeld in de respectieve publicaties40,41.
- Exporteer het CAD-ontwerpbestand met een geschikt formaat (bijvoorbeeld .dwg, .dxf). Druk een filmfotolithografiemasker af door het geëxporteerde CAD-ontwerpbestand naar een commerciële leverancier te sturen om af te drukken.
- Fotolithografie
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een stofvrije en lichtgestuurde omgeving, zoals een laminaire stromingskap of cleanroomfaciliteit. De experimentele omstandigheden die hier worden geboden, worden als leidraad gegeven en moeten intern worden geoptimaliseerd. De auteurs bevelen aan om specifieke training te zoeken en de vastgestelde protocollente raadplegen 42.- Bereid een 100 mm siliciumwafer door 2 uur in een oven op 200 °C te bakken. Spin-coat de silicium wafer met SU-8 2010 fotoresist, gericht op een doeldikte van 10 μm, onder de volgende omstandigheden: 500 rpm voor 10 s (acceleratie 100 rpm /s) en 3.000 rpm voor 45 s (acceleratie 300 rpm / s).
LET OP: SU-8 fotoresist is gevaarlijk, wees voorzichtig bij het hanteren en voorkom inademing en contact met de huid. Het is ontvlambaar, potentieel kankerverwekkend en giftig voor het milieu. - Bak de gecoate siliciumwafel op 95 °C gedurende 2,5 min (zacht bakken). Stel de fotoresist bloot aan ultraviolet (UV) licht, met behulp van het filmfotolithografiemasker en een energiedosis van 140 mJ /cm2 bij een golflengte van 365 nm met behulp van een masker aligner.
- Bak de gecoate siliciumwafel op 95 °C gedurende 3,5 min (bak na blootstelling). Dompel de siliciumwafer gedurende 3 minuten onder en roer deze in de ontwikkelaarsoplossing om de microgefabriceerde structuren te onthullen door de onbelichte fotoresist te verwijderen.
LET OP: De ontwikkelaarsoplossing kan ontvlambaar zijn, neem de juiste voorzorgsmaatregelen bij het hanteren en opslaan. - Spoel 10 s af met verse developer solution. Spoel 10 s af met isopropylalcohol en droog aan de lucht. Gebruik gefilterde perslucht om ervoor te zorgen dat structuren grondig droog zijn. Meet de hoogte van de SU-8 structuren, bijvoorbeeld met behulp van een profilometer.
- Silaniseer elke mastermal met 50 μL chlorotrimethylsilaan door gedurende 2 uur een vacuümdruk van 50 mbar toe te passen. De auteurs merken op dat het opnieuw silaniseren van de mastermal niet nodig werd geacht.
LET OP: Chlorotrimethylsilaan is een gevaarlijke stof. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en behandel deze met zorg. Vermijd contact met huid en ogen en voorkom inademing. Uit de buurt van ontstekingsbronnen houden en gebruiken in een goed geventileerde ruimte.
- Bereid een 100 mm siliciumwafer door 2 uur in een oven op 200 °C te bakken. Spin-coat de silicium wafer met SU-8 2010 fotoresist, gericht op een doeldikte van 10 μm, onder de volgende omstandigheden: 500 rpm voor 10 s (acceleratie 100 rpm /s) en 3.000 rpm voor 45 s (acceleratie 300 rpm / s).
2. Fabricage van apparaten
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een stofvrije omgeving, zoals een laminaire stromingskap.
- Bereiding van poly(dimethylsiloxaan) (PDMS) platen
- Bereid ongeveer 40 g PDMS door de basis en het uithardingsmiddel grondig te mengen in een verhouding van 10:1 met behulp van een spatel in een schone plastic beker. Ontgas het mengsel om alle luchtbellen te verwijderen door de plastic beker met het PDMS gedurende 1 uur in een vacuümkamer (vacuümdruk = 50 mbar) te plaatsen.
- Bevestig de hoofdvorm in een plastic houder met behulp van doorzichtige tape. Reinig met perslucht om eventuele stofdeeltjes te verwijderen.
OPMERKING: Als alternatief kan aluminiumfolie worden gevormd rond een glazen petrischaal en vervolgens worden gebruikt om de hoofdmal te huisvesten en de PDMS43 te bevatten. - Giet het PDMS-mengsel op het midden van de hoofdmal, zorg ervoor dat het zich op een vlak oppervlak bevindt en laat bezinken.
OPMERKING: Het PDMS-mengsel moet zo dicht mogelijk bij het oppervlak van de hoofdmal worden gegoten en een continue stroom worden gehandhaafd om de introductie van luchtbellen te minimaliseren. Luchtbellen kunnen worden verwijderd door perslucht over de bel te leiden of door ze eruit te scheppen met een fijne naald. - Bedek de hoofdvorm losjes met een plastic deksel om te voorkomen dat stofdeeltjes zich op het oppervlak van het PDMS nestelen. Breng de hoofdvorm over in een oven en laat een nacht uitharden op 70 °C.
- Haal de hoofdvorm uit de oven en laat afkoelen. Verwijder de uitgeharde PDMS weg van de hoofdmal en het plastic frame en zorg ervoor dat de hoofdmal / PDMS niet wordt beschadigd.
- Plaats doorzichtige tape over de microkanalen in reliëf in het PDMS om een stofvrij oppervlak te behouden. Zorg ervoor dat de tape is verwijderd voordat u deze verlijmt.
- Snijd het PDMS in platen (d.w.z. als er meerdere apparaten zijn opgenomen in het ontwerp op de hoofdvorm, kunnen er veel worden vervaardigd uit een enkel gietstuk) zoals aangegeven door het ontwerp met behulp van een gemonteerd guillotine- of scheermesje. Zorg er bij het snijden van de laterale opening van de BFI PDMS-plaat voor dat de microkanalen volledig open zijn (figuur 1A). Zorg er voor de FFI PDMS-plaat voor dat elke hoek is bijgesneden zodat deze in de petrischaal met glazen bodem in figuur 1D past.
- Pons de gewenste inlaat-/uitlaatgaten volgens het ontwerp van het apparaat. Gebruik een precisiesnijder om inlaatgaten van respectievelijk 3,18 mm en 4,75 mm te ponsen voor de exemplaren BFI- en FFI-apparaten.
- Verlijming van PDMS-platen om apparaten te maken
OPMERKING: De volgende wasstappen (2.2.1-2.2.2) gebruiken een ultrasone reiniger gevuld met gezuiverd water (ddH2O) bij 37 kHz. Het wassen van de PDMS-platen helpt om de succesvolle hechting44 te verbeteren en het risico op besmetting te verminderen. Om de PDMS-platen te manipuleren, gebruikt u een schone tang en tilt u op met behulp van de inlaatgaten om schade aan de microkanalen of het apparaatoppervlak te voorkomen.- Dompel de PDMS-platen onder in 0,5 M NaOH en soniceer gedurende 5 minuten. Spoel af met steriele ddH2O. Breng PDMS-platen over in 70% ethanoloplossing en soniceer gedurende 5 minuten. Spoel af met steriele ddH20.
- Dompel PDMS-platen onder in steriele ddH2O en soniceer gedurende 5 minuten. Verwijder de PDMS-platen uit de steriele ddH2O, droog met gefilterde perslucht en plaats ze in een steriele vierkante petrischaal.
- Plaats de vierkante petrischaal met de PDMS-platen in een oven op 70 °C gedurende 1 uur te drogen. Haal uit de oven en laat afkoelen in een stofvrije omgeving. Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS-platen met tape en/of gefilterde perslucht.
- Activeer de oppervlakken van de PDMS-platen en petrischalen met glazen bodem om te worden verlijmd met behulp van een plasmareiniger met de volgende instellingen: vacuümdruk 0,75 mbar, vermogen 50%, coatingtijd 1 min. Plaats de te activeren (en vervolgens te verlijmen) oppervlakken naar boven gericht in de plasmareiniger.
- Verwijder de PDMS-platen en petrischalen met glazen bodem uit de plasmareiniger en hecht door de geactiveerde oppervlakken voorzichtig in hoekgetrouw contact met elkaar te plaatsen. Verlijm de BFI- en FFI PDMS-platen op respectievelijk de petrischalen met een glazen bodem van 35 mm en 50 mm (glasdikte 0,17 mm).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te veel druk uitoefent tijdens het verlijmen, omdat dit kan leiden tot het instorten van de microkanalen. - Controleer op succesvolle verlijming door simpelweg te proberen de PDMS-plaat met een pincet van de petrischaal met glazen bodem te trekken. Visualiseer de apparaten met het oog of met behulp van generieke microscopie om ervoor te zorgen dat de inentingsinlaten of microkanalen niet instorten.
OPMERKING: Voor verzadigde omstandigheden (d.w.z. met water verzadigde en/of voedingsrijke omstandigheden), neem stap 2.2.7 van het protocol op. Als water-onverzadigde omstandigheden nodig zijn, gaat u verder met stap 2.2.8. Apparaten kunnen worden gevuld met water of media. - Vul de apparaten onmiddellijk na het verlijmen door 100 μL van de gewenste oplossing voor het BFI-apparaat (bacteriële inlaat en laterale opening) of 30 μL media in elke inlaat (60 μL totaal) voor het FFI-apparaat te pipetteren. Als er luchtbellen aanwezig zijn, zullen deze ongeveer 10 minuten na het vullen verdwijnen, omdat PDMS poreus is.
- Voeg steriele ddH2O (~100-200 μL) toe aan de petrischaal om de luchtvochtigheid op peil te houden.
3. Microbiële cultuur
OPMERKING: De volgende stappen bieden een algemene microbiologische procedure voor schimmel- en bacteriekweek en moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden (d.w.z. met behulp van een vlam of microbiologische veiligheidskast) die geschikt is voor het niveau van insluiting dat vereist is voor de gewenste microben. Aan het einde van elke sectie worden specifieke voorbeelden gegeven voor een interessante soort.
- Schimmelcultuur
- Bereid het gewenste kweekmedium aangevuld met agar. Autoclaaf het medium bij 121 °C gedurende 15 min. Laat het medium afkoelen tot 50 °C en giet in petrischalen met een diameter van 9 cm, met behoud van steriele omstandigheden.
- Gebruik een kurkboorder om een plug met een diameter van 4 mm agar met mycelium uit een koelkastkolonie van de gewenste schimmelstam te verwijderen om het isolaat te activeren. Dit wordt uitgevoerd om gestandaardiseerde en krachtige groei van de schimmel te garanderen voorafgaand aan de inenting van het apparaat.
OPMERKING: De microben kunnen ook worden geactiveerd uit een glycerolvoorraad, d.w.z. schimmelisolaten die zijn opgeslagen op agarpluggen in 50% glyceroloplossing bij -70 °C41. - Plaats de zijkant van de plug met mycelium in contact met het agaroppervlak in het midden van de niet-geinoculeerde petrischaal. Vervang het deksel op de petrischaal en sluit af voordat u het incubeert op de juiste temperatuur voor de gewenste stam gedurende de vereiste hoeveelheid tijd, meestal ongeveer 3 tot 4 dagen.
OPMERKING: Voorbeeld kweekomstandigheden voor Trichoderma rossicum: Moutextract agar, geïncubeerd bij 25 °C in het donker gedurende 48 uur.
- Bacteriecultuur
- Strooi het gewenste bacteriële isolaat uit de bronvoorraad (bijv. glycerolvoorraad of enkele kolonie uit de agarplaat) op een agarplaat om enkele bacteriekolonies te bereiken en geen besmetting te garanderen45. Sluit de plaat af met folie.
- Incubeer bij een temperatuur en duur die specifiek zijn voor het isolaat van belang totdat individuele kolonies worden waargenomen.
- Bereid de gewenste kweekbouillon. Voeg bijvoorbeeld 10 g trypton, 10 g NaCl en 5 g gistextract per 1 L ddH2O toe om LB-medium te bereiden voor de kweek van B. subtilis. Autoclaaf het medium bij 121 °C gedurende 15 min.
- Laat het medium afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg het medium toe aan een steriele kweekkolf in een steriele omgeving.
- Raak een enkele bacteriekolonie van de agarplaat aan met behulp van een steriele inentingslus. Breng de geënte lus over in het steriele kweekmedium door de vloeistof kort aan te raken met de lus.
- Sluit de kolf af met een steriel deksel of folie en plaats deze 's nachts in een schudinmachine met behulp van de instellingen die geschikt zijn voor de geselecteerde soort.
OPMERKING: Voorbeeldkweekomstandigheden voor B. subtilis: i) vloeistofcultuur - aerobe groei bij 37 °C bij 200 tpm in LB-medium en ii) plaatcultuur - kamertemperatuur op LB-agarplaat. Raadpleeg de FFI/BFI papers40,41 voor meer informatie over het kweken van verschillende schimmelstammen.
4. Inenting van het apparaat
OPMERKING: De volgende stappen moeten plaatsvinden in een laminaire stromingskap met behulp van steriele apparatuur.
- Schimmelinenting
- Gebruik een gesteriliseerde kurkboorder (ø = 4 mm) om een agarplug uit de kolonie aan de rand van een 3 dagen oude cultuur te verwijderen (stap 3.1). Zorg ervoor dat het groeiende hyphalfront intact blijft.
- Breng de plug in de schimmelinlaat, mycelium met de zijkant naar beneden, met de groeirichting van het hyphalfront gericht op de microkanaalopeningen om hyphale infiltratie van de kanalen aan te moedigen.
- Herhaal stap 4.1.1-4.1.2 voor de tweede schimmelsoort (bij gebruik van het FFI-apparaat) en breng de stekker in de tegenoverliggende inlaat. Als u het BFI-apparaat gebruikt, laat u deze stap achterwege en gaat u verder met stap 4.1.4.
- Sluit de petrischaal af met transparante folie en incubeer bij 25-28 °C in het donker totdat de beeldvorming begint. Bepaal de pre-imaging incubatietijd afhankelijk van de beoogde biologische gebeurtenis die moet worden waargenomen, bijvoorbeeld schimmel-schimmelconfrontaties en de groeisnelheid van opgenomen soorten in het apparaat.
- Bacteriële inenting
- Verdun de bacteriën uit een nachtkweek (stap 3.2) in een verhouding van 1:25 met behulp van hetzelfde kweekmedium als beschreven in stap 3.2.3. Cultuur gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Was de bacteriën door korrelcultuur met behulp van een centrifuge op 2000 x g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in het gewenste volume van 0,9% w/v natriumchlorideoplossing.
- Centrifugeer opnieuw om een pellet te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in vloeibaar medium (bijv . C. cinerea minimaal medium tot een OD600 van 1). Optimaliseer de OD600-waarde voor de bacteriestam in kwestie.
- Verwijder het BFI-apparaat uit de incubator en open het in een steriele omgeving. Pipetteer 10 μL suspensie in de bacteriële inlaat.
OPMERKING: Optimaliseer de exacte inentingstijden voor de bacteriële-schimmelinteracties in kwestie. Introduceer bijvoorbeeld bacteriën in het BFI-apparaat 18 uur na schimmelinenting bij gebruik van C. cinerea. - Sluit de petrischaal af met een transparante film en incubeer bij 25 °C in het donker totdat de beeldvorming begint. Berg het apparaat rechtop op.
5. Microscopie en beeldanalyse
- Microscopie
OPMERKING: De onderzoeker moet de juiste beeldvormingsmethode kiezen die in overeenstemming is met de aard van het uit te voeren experiment, bijvoorbeeld een omgekeerde breedveldeposexcentie of confocale microscopie. Hier is een algemeen overzicht gegeven, omdat specifieke details afhankelijk zijn van de kenmerken van de gekozen microscopie-opstelling.- Schakel de microscoopcomputer, het hoofdlichaam van de microscoop (indien van toepassing), de camera, de temperatuurgestuurde incubator en de lichtbron(nen) in. Zorg ervoor dat de microscoop correct is ingesteld, bijvoorbeeld dat de Köhler-verlichting correct is toegepast voor een gelijkmatige verlichting van het monster. Start het imaging softwarepakket.
OPMERKING: Bij gebruik van een temperatuurgecontroleerde incubator is het belangrijk om de microscooptemperatuur enkele uren in evenwicht te laten zijn voordat u een experiment start. - Monteer het microfluïdische apparaat in het toneelelement. Zorg ervoor dat het apparaat goed is beveiligd, d.w.z. met tape, om te voorkomen dat het apparaat ontwricht tijdens actieve fasebeweging.
- Verkrijg afbeeldingen van de ingeënte apparaten, bijvoorbeeld single-point of time-lapse experimenten. Uitgebreide beeldspecificaties die relevant zijn voor de experimenten die zijn uitgevoerd met de BFI- en FFI-apparaten worden verstrekt in de respectieve bovengenoemde publicaties40,41.
OPMERKING: Brightfield-beelden werden verkregen met behulp van fasecontrastmicroscopie om hyphale proliferatie door de groeikanalen te visualiseren met behulp van autofocussoftware en 10x vergroting, 0,30 NA (numeriek diafragma) of 20x vergroting, 0,45 NA objectieve lenzen. Excitatie van fluorescerende reportereiwitten werd bereikt met behulp van een krachtige lichtgevende diodelichtmotor met golflengten die specifiek zijn voor de fluorofoor. - Exporteer afbeeldingen naar een geschikt formaat voor latere beeldverwerking. Bijvoorbeeld .tiff.
- Schakel de microscoopcomputer, het hoofdlichaam van de microscoop (indien van toepassing), de camera, de temperatuurgestuurde incubator en de lichtbron(nen) in. Zorg ervoor dat de microscoop correct is ingesteld, bijvoorbeeld dat de Köhler-verlichting correct is toegepast voor een gelijkmatige verlichting van het monster. Start het imaging softwarepakket.
- Beeldanalyse
OPMERKING: De auteurs bevelen Fiji aan46 als hulpmiddel voor beeldanalyse, maar er zijn andere softwarepakketten beschikbaar. Hieronder volgen voorbeelden van beeldanalyses die zijn uitgevoerd met Fiji uit de gepresenteerde BFI- en FFI-apparaatpublicaties. Deze stappen zijn specifiek voor een Mac en kunnen enigszins verschillen als u een pc gebruikt.- Hyphal groeisnelheid metingen
OPMERKING: Deze methode werd gebruikt in het BFI-manuscript40 om de groeisnelheden van individuele schimmeldraden te meten.- Download, installeer en start Fiji. Importeer de afbeeldingsreeks uit een time-lapse-experiment door Bestand > > afbeeldingsreeks importeren te selecteren. Zoek de map waarin de gegevens zijn opgeslagen en selecteer Openen. Selecteer in het venster Volgordeopties de optie Voorkeuren en vervolgens OK.
- Selecteer het pictogram Rechte lijn in de hoofdwerkbalk. Plaats het begin van de rechte lijn aan de punt van de groeiende hyphale punt door te klikken en vervolgens tegelijkertijd de cursor naar een ander punt in het venster te slepen. Er verschijnt een gele lijn met drie vakken die het begin, het midden en het einde van de regel aangeven.
- Ga naar het volgende frame in de afbeeldingsreeks door Ctrl ingedrukt te houden en >. Plaats het einde van de rechte lijn aan de punt van de groeiende hypha door het vierkante vak naar de juiste positie te selecteren en te slepen.
- Houd Ctrl en M ingedrukt om de lengte van de lijn in pixels te meten. Er verschijnt een venster Resultaten met de gemeten gegevens. Definieer de gegevens die in het venster Resultaten worden weergegeven als volgt: klik op het venster Resultaten en selecteer vervolgens Resultaten > Metingen instellen.
- Ga naar het volgende frame in de afbeeldingsreeks door Ctrl ingedrukt te houden en vervolgens >. Plaats het begin van de rechte lijn aan de punt van de groeiende hypha door het vierkante vak naar de juiste positie te selecteren en te slepen.
- Houd Ctrl en vervolgens M ingedrukt om de lengte van de lijn in pixels te meten. Er verschijnt een venster Resultaten met de gemeten gegevens.
- Herhaal stap 5.2.1.5-5.2.1.6 totdat u klaar bent met het meten van de groei van de hypha in pixels.
- Selecteer alle gegevens in het venster Resultaten . Kopieer en plak in een ander softwareprogramma, bijvoorbeeld een spreadsheet, om de gegevens te verwerken. Plot de hyphale groei (in pixels of micrometers) als functie van de tijd en bereken de gemiddelde groeisnelheden. Voer ten minste drie biologische replicaties per experiment uit.
- Fluorescentie intensiteit metingen
OPMERKING: Deze methode werd gebruikt in de FFI-publicatie41 om de verandering in fluorescentie-intensiteit in schimmeldraden van Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP bij contact met Clonostachys rosea 016 te beoordelen als functie van de tijd.- Download, installeer en start Fiji. Importeer de afbeeldingsreeks uit een time-lapse-experiment door Bestand > > afbeeldingsreeks importeren te selecteren. Zoek de map waarin de gegevens zijn opgeslagen en selecteer Openen. Selecteer in het venster Volgorde-opties de optie Voorkeuren en vervolgens OK.
- Geef een interessante regio (ROI) op om de absolute fluorescentie-intensiteit van een schimmeldraden te meten met behulp van het rechthoekige gereedschap, dat zich in de hoofdwerkbalk bevindt. De grootte van het vierkant kan precies als volgt worden gedefinieerd: > Selectie bewerken > Opgeven; de ROI kan ook worden opgeslagen voor toekomstig gebruik in de ROI Manager door > Selectie bewerken > Toevoegen aan manager te selecteren.
- Meet de absolute fluorescentie-intensiteit (gemiddelde grijswaarde) binnen de gedefinieerde ROI voor elke afbeelding in de hele afbeeldingsreeks of stapel als volgt: Afbeeldings- > stacks > meetstack. Het venster Resultaten wordt automatisch geopend zodra alle afbeeldingen in de stapel zijn verwerkt.
OPMERKING: De gegevens die in het venster Resultaten worden weergegeven, kunnen als volgt worden gedefinieerd: klik op het venster Resultaten en selecteer vervolgens Resultaten > Metingen instellen. Zorg ervoor dat Gemiddelde grijswaarde is geselecteerd. - Selecteer alle gegevens in het venster Resultaten . Kopieer en plak in een ander softwareprogramma, bijvoorbeeld een spreadsheet, om de absolute fluorescentie-intensiteiten van de opgegeven ROI in functie van de tijd te plotten.
- Herhaal stap 5.2.2.2-5.2.2.4 om absolute fluorescentie-intensiteitsmetingen te verzamelen voor elke ROI, d.w.z. op de hyfen van belang, naast de betreffende hypha of binnen het overeenkomstige controlekanaal.
- Bereken de juiste relatieve fluorescentie-intensiteiten in willekeurige eenheden (AU), bijvoorbeeld door de absolute fluorescentie-intensiteit van de ROI [hypha of interest] te delen door de absolute fluorescentie-intensiteit van de ROI [controlekanaal]. Raadpleeg de FFI-publicatie41 voor meer specifieke details.
- Voer ten minste drie biologische replicaties per experiment uit en plot de relatieve fluorescentie-intensiteiten als functie van de tijd.
- Hyphal groeisnelheid metingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten worden gepresenteerd van de voorbeeldige BFI40- en FFI41-apparaten. Hyphal groeisnelheidsmetingen kunnen eenvoudig worden verkregen met behulp van deze apparaten in combinatie met basismicroscopietechnieken. Figuur 3A-B illustreert bacteriële-schimmelinteracties tussen C. cinerea-schimmeldraden en B. subtilis NCIB 3610. De aanwezigheid van B. subtilis stopt de groei van C. cinerea na ca. 5 uur na co-inenting (figuur 3B). Pijlen geven de gelijktijdige morfologische waarneming van dunnere en transparantere schimmeldraden aan (figuur 3A). Er werd ook opgemerkt dat niet-aangetaste hyphale cellen zich bleven vermenigvuldigen. Figuur 3C-D toont het sterke remmende effect van F. graminearum PH1-dsRed op T. rossicum NEU135 na hyphale interactie, resulterend in een volledige arrestatie van T. rossicum hyphal groei.
Figuur 3: Voorbeelden van groeisnelheid kwantificering en observatie van de BFI- en FFI-apparaten. (A) Brightfield-microscopiebeelden van interacties tussen Coprinopsis cinerea en Bacillus subtilis NCIB 3610 in de microkanalen van het BFI-apparaat op de tijdstippen na co-inenting. Pijlen benadrukken een dunne hyphale morfologie, die optrad na interactie met B. subtilis NCIB 3610. Schaalbalk = 25 μm. (B) Hyphal groeisnelheid van toonaangevende hyphal tips gemeten gedurende 10 uur na co-inenting. Staven vertegenwoordigen standaardafwijkingen van drie biologische replicaties. (C) Boxplot (n = 6) met de relatieve groeisnelheid van Fusarium graminearum PH1-dsRed versus Trichoderma rossicum. Significantie wordt aangeduid met ** en vertegenwoordigt p < 0,01, berekend met behulp van de Mann-Witney U-test. Staven vertegenwoordigen de grootste of kleinste waarneming gelijk aan respectievelijk het bovenste en onderste percentiel (± 1,5 x interkwartielbereik). (D) F. graminearum PH1-dsRed (groeit van links naar rechts) vs T. rossicum NEU135 (groeit van rechts naar links) op 24 uur, 48 uur en 72 uur na co-inenting. Brightfield- en fluorescentiekanalen bedekt. Schaalbalk = 200 μm. De panelen in deze figuur zijn aangepast van Stanley et al., 2014 (A-B)40 en Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De morfologische veranderingen veroorzaakt door interactiegebeurtenissen kunnen op cellulair niveau worden waargenomen met behulp van de methodologieën die in dit artikel worden beschreven. Figuur 4 geeft voorbeelden van morfologische waarnemingen voor de gepresenteerde BFI- en FFI-apparaten. Figuur 4A toont het verlies van de polariteit van Verticillium longisporum hyphal growth bij het tegenkomen van de bacterie Pseudomonas synxantha (P_phen) of P. fluorescens (P_rhizo), vergeleken met de controleschimmels alleen (V1)47. Schimmel-bacteriële interacties resulteerden in het krullende uiterlijk van de schimmeldraden. Dit werd toegeschreven aan significante bacterieel geïnduceerde transcriptomische veranderingen in de schimmels en vermeend vermijdingsgedrag. Deze resultaten zijn significant omdat V. longisporum een plantpathogeen is, wat de Pseudomonas sp betekent. heeft potentieel om in dit geval als biocontrolemiddel te worden gebruikt47.
Figuur 4B toont een time-lapse-experiment waarin het dynamische verlies van hyphale cellulaire inhoud kan worden waargenomen, waarbij blebs worden gevormd die het rode fluorescerende eiwit dTomato vasthouden. Deze blebberende morfologie trad op na co-inenting met B. subtilis, maar werd alleen waargenomen in sommige apicale cellen. De ineenstorting van de schimmeldraden en de daaropvolgende blebbing-verschijnselen waren echter niet gecorreleerd met bacteriële aanhechting. Dit suggereerde dat er potentiële fungicide bacteriële activiteit optrad die niet afhankelijk was van hechting, verondersteld te wijten aan de afscheiding van lipopeptiden. Dynamische beeldvormingstechnieken met hoge resolutie hebben ook een vermeend verdedigingsmechanisme van F. graminearum onthuld, dat verhoogde septavorming vertoont wanneer het wordt tegengewerkt door C. rosea, zoals aangegeven door de pijlen in figuur 4C.
Figuur 4: Voorbeelden van veranderingen in morfologie waargenomen tijdens interactiegebeurtenissen in de BFI- en FFI-apparaten. (A) De krullende morfologische veranderingen in de plantpathogene schimmels Verticillium longisporum (V1) gelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP)48. Deze morfologie trad op als reactie op een fluorescerende Pseudomonas spp. met genen die coderen voor fenazinesynthese (P_phen; P. synxantha) en een bacterie geïsoleerd uit de rhizosfeer van koolzaad (P_rhizo; P. fluorescens). Schaalstaven = 20 μm. (B) dTomato-expresserende Coprinopsis cinerea40 gelijktijdig geïnoculeerd met Bacillus subtilis afgebeeld 5 uur na co-inenting. Cellen waren intact (links) na 5 uur, maar een schimmeldraden stortten 30 minuten later in (verlies van fluorescentie) en blebs met (fluorescerend) cellulair materiaal werden waargenomen. Schaalbalk = 25 μm. (C) Pijlen markeren septavorming in Fusarium graminearum hyphae waargenomen na interactie met Clonostachys rosea hyphae. Schaalbalk = 10 μm, tijdstempel = h na co-inenting. De panelen in deze figuur zijn aangepast van Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 en Gimeno et al., 2021 (C)41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gepresenteerde apparaten zijn ook geschikt voor het observeren van dynamische fysiologische veranderingen. Met behulp van het BFI-apparaat werd aangetoond dat de concentratie van schimmeldraden-geassocieerde bacteriën in de loop van de tijd veranderde en afnam na een lokale accumulatie van cellen (figuur 5A). Bacteriële mobilisatie langs microkanalen werd ook waargenomen in clusterachtige assemblages. In het FFI-apparaat maakte fluorescentielabeling de kwantificering van C. rosea hyphal proliferatie mogelijk wanneer het werd geconfronteerd met F. graminearum om de dynamiek van de antagonistische interactie te karakteriseren (figuur 5B). Deze metingen werden uitgevoerd over een periode van 20 uur en tonen het potentieel van deze apparaten voor het uitvoeren van langdurige time-lapse-experimenten.
Figuur 5: Voorbeeld van dynamische fysiologische karakteriseringsmetingen voor zowel de BFI- als de FFI-apparaten. (A) Timelapse-experiment in het BFI-apparaat dat de bevestiging door Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 aan de schimmeldraden van Coprinopsis cinerea pMA41240 gedurende 3 uur weergeeft. Schaalbalk = 50 μm. (B) Brightfield- en fluorescentiekanaalbeelden tonen kwantificering van groen fluorescerend eiwit (GFP) gedetecteerd met behulp van het FFI-apparaat tijdens de interactie tussen fluorescerend gelabelde Clonostachys rosea en Fusarium graminearum49. Schaalbalk = 50 μm. Grafiek (rechts) toont relatieve fluorescentie in willekeurige eenheden (AU) over 20 h, n = 6 en foutbalken geven de standaardfout aan. Oranje en grijze plots illustreren de fluorescentie-intensiteiten van (i) GFP gedetecteerd in C. rosea hyphal netwerk en (ii) het interactiekanaal in vergelijking met het C. rosea-bevattende controlekanaal, respectievelijk. De zwarte controleplot toont de fluorescentie-intensiteit van schimmeldraden in het C. rosea-controlekanaal in vergelijking met het controlekanaal. De panelen in deze figuur zijn aangepast van Stanley et al., 2014 (A)40 en Gimeno et al., 2021 (B)41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een protocol voor de studie van schimmel-microbiële interacties met behulp van kanaalmicrofluïdica. De auteurs willen de veelzijdigheid van deze apparaten aantonen en aanpassing aanmoedigen om aan de interesses van de onderzoeker te voldoen. Met behulp van de voorbeeld BFI- en FFI-apparaten kunnen schimmel-microbiële interacties in meer detail worden bestudeerd dan voorheen toegankelijk was. Door de achtergrondcomplexiteit en heterogeniteit van de bodem te verwijderen, de groei van schimmeldraden zodanig te matigen dat ze beperkt zijn tot een enkele monolaag en de omgevingsparameters strak te reguleren, is het mogelijk om beelden met hoge resolutie van deze biologische gebeurtenissen in de loop van de tijd vast te leggen. Met behulp van deze apparaten zijn de interacties tussen microbiële partners gekarakteriseerd met behulp van groeisnelheid, fluorescentiekwantificering en observationele bioimaging van morfologische eigenschappen.
Apparaten kunnen worden ontworpen om de karakterisering van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau mogelijk te maken. De veelzijdigheid en het ontwerpgemak voor niet-specialisten maken dit protocol geschikt voor aanpassing aan een breed scala aan onderzoeksvragen. De BFI- en FFI-apparaten zijn geschikt voor gebruik met een verscheidenheid aan microscopen om aan het experimentele doel te voldoen, vanwege hun transparante aard en glasgebonden oppervlak. De apparaten kunnen worden aangepast met betrekking tot zowel hun configuratie als fysisch-chemische parameters; vochtigheid, temperatuur of kanaalverzadiging kunnen bijvoorbeeld de omgevingservaring voor de proefpersoon veranderen. Vervolgens kan het apparaat zo worden ontworpen dat het fysiek de groei kan sturen of een bepaald gedrag kan uitlokken, zoals interactiegebeurtenissen of navigatiestrategieën, gecontroleerd door kanaalstructuur en -grootte of het opnemen van obstakels. Dit is niet mogelijk met de huidige methodologieën, zoals agar-plaat assays31.
Tot nu toe zijn microfluïdische apparaten ook gebruikt om schimmel-faag50 en schimmel-nematode35 interacties te onderzoeken. Het gebruik van kanaalmicrofluïdica maakt ook de controle en uitwisseling van vloeistoffen in het apparaat mogelijk. Dit belangrijke en voordelige kenmerk speelde een belangrijke rol in de studie van myceliale faagretentie50. Bovendien leverde het gebruik van microfluïdische technologieën voor transcriptomics-studies een grotere resolutie van differentieel tot expressie gebrachte genen op in vergelijking met een vergelijkbare op agar gebaseerde test. De methoden waren gelijktijdig in 24 van de 28 differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd door hetzelfde agarplaatexperiment, waarbij de microfluïdische apparaten veel andere genen identificeerden en een hogere relatieve expressie rapporteerden in vergelijking35.
De kritieke stappen van het protocol beginnen met het oorspronkelijke apparaatontwerp. Om tot een passend ontwerp te komen, moet aandacht worden besteed aan de levensstijl en groei/ mobiliteitsstrategie van de microben van belang. Bijvoorbeeld het opnemen van voldoende kanaaldiepte of -lengte om tegemoet te komen aan de fysiologische vereisten en de groeisnelheid van het micro-organisme van belang. De structurele kenmerken en componenten van de microkanalen kunnen worden ontworpen om specifiek gedrag te induceren of te manipuleren, zoals openingen voor interactiezones of obstakels om navigatiestrategieën te observeren. Bovendien moet de experimentele onderzoeksvraag beantwoord kunnen worden met het apparaatontwerp. Denk bijvoorbeeld aan: (i) hoe laminaire stromingsprofielen kunnen worden benut, (ii) het aanpassen en variëren van microkanaalhoogtes voor het te onderzoeken organisme, en (iii) vernauwing van microkanaalingangen om overproliferatie van schimmeldraden in het apparaat te voorkomen. De auteurs suggereren deze verdere bronnen voor microfluïdisch apparaatontwerp 51,52,53. Het is ook essentieel om de apparaten tijdens de productie stofvrij te houden. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat een stofvrije omgeving wordt gehandhaafd tijdens alle stadia van het fabricageproces, evenals door tape en gefilterde perslucht te gebruiken en de PDMS-oppervlakken bedekt te houden wanneer ze niet in gebruik zijn. Andere kritieke stappen van het protocol zijn het minimaliseren van het risico op verontreiniging door de apparaten te wassen in een 70% ethanoloplossing en te zorgen voor een adequate hechting tussen het glasoppervlak en de PDMS-plaat, door de geactiveerde oppervlakken voorzichtig met elkaar in contact te brengen en niet te veel druk uit te oefenen op de microkanalen. Controleer op voldoende hechting door te proberen de PDMS-plaat van het glas te verplaatsen voorafgaand aan de inenting. Een beperking van deze apparaten is dat ze niet kunnen worden hergebruikt tussen experimenten.
De opname van bodemmicroben in op maat gemaakte microfluïdische apparaten begint een opwindend nieuw tijdperk voor onderzoek naar microbiële interacties. Mogelijke toekomstige toepassingen van de gepresenteerde methodologie zijn breed, zoals de ontdekking van nieuwe biocontrolesoorten of antimicrobiële verbindingen, of de karakterisering van de zogenaamde schimmelsnelweg voor bacteriële mobilisatie. De BFI- en FFI-apparaten bieden een platform om dynamische morfologische en fysiologische veranderingen te visualiseren die zich voordoen voor- en na interactie op cellulair niveau. Nieuwe apparaten zijn eenvoudig te ontwerpen en te maken, vereisen eenvoudigweg vindingrijkheid, om aan de experimentele onderzoeksvraag te voldoen. Hun veelzijdigheid en gebruiksgemak betekent dat deze methode door niet-experts kan worden gebruikt om bodemmicrobioomonderzoek op cellulair niveau te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We erkennen financiële steun van het Department of Bioengineering van Imperial College London en The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
References
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
- Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
- Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
- Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33 (2021).
- Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
- Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
- Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
- Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
- Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
- Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
- Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
- Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
- Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
- Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572 (2020).
- Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
- Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
- Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
- Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
- Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
- Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
- Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
- Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
- Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163 (2019).
- Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
- Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535 (2020).
- Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
- Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
- Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154 (2017).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
- Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243 (2019).
- Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
- Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
- Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074 (2020).
- Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
- Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
- Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262 (2021).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010 (2018).
- Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468 (2021).
- Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
- Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
