Summary
土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。
Abstract
糸状菌類は土壌の成功した住人であり、有機物や無機物の分解、栄養レベルの調節など、土壌生態系において大きな役割を果たしています。彼らはまた、細菌や他の真菌のような様々な他の微生物と相互作用する機会を数多く見つけます。しかし、細胞レベルで真菌の相互作用を研究することは、土壌のブラックボックスのような性質のために困難な場合があります。真菌相互作用の研究のために新しいマイクロ流体ツールが開発されています。細菌 - 真菌および真菌 - 真菌相互作用を研究するために設計された2つのプラットフォームが強調表示されています。これらのマイクロチャネル内では、真菌 - 微生物相互作用は、制御された物理化学的環境において、以前よりも高い時間的および空間的分解能で監視することができる。これらのツールの適用は、菌糸への細菌極性付着の観察や、特徴のない真菌 - 真菌拮抗作用の暴露など、多数の新しい生物学的洞察をもたらしてきた。これらの方法論の主な特徴は、非専門家によるこのツールの使いやすさであり、微生物学ラボで使用するための高度に翻訳可能な技術を生み出していることです。
Introduction
土壌は、炭素とリンのサイクルに不可欠な微生物を豊富に含む非常に多様な環境です1,2。糸状菌は、有機物および無機物の分解剤として多数の生態系の主要な構成要素であり、共生関係の形成を通じて植物の栄養を高めることができる3,4。土壌内では、真菌は、他の真菌5、細菌6、ウイルス7および線虫8などの多数の微生物と動的に相互作用する。これらの相互作用は、土壌と植物の健康に重大な影響を及ぼします。しかし、相互作用する微生物を高解像度でイメージングできる適切な実験システムがないため、多くは未定義のままです。
細菌-真菌相互作用(BFI)および真菌-真菌相互作用(FFI)に関する研究は、医学における抗菌剤および農業における生物学的防除剤を含む幅広い分野で貴重な用途を有する。例えば、真菌コプリノプシス・シネレアはペプチドコプシンを産生し、これはヒト病原体リステリア・モノサイトゲネス9に対して抗菌活性を示すことが示されている。同様に、真菌由来化合物であるグリセオフルビンは、ヒト真菌感染症の治療薬として広く使用されており、植物病原性真菌Alternaria solani10,11の増殖をさらに阻害することができる。土壌に生息する細菌バチルス・サチルスのいくつかの菌株もまた、真菌性植物病原菌リゾクトニア・ソラニ12、13の有効な生物防除剤であることが実証されている。それにもかかわらず、従来の方法論に関連する制限のために、BFIおよびFFIは単一細胞レベルではあまり理解されていない。
従来の研究では、通常、2種以上の種が対立する寒天プレートを使用して、マクロスケールでBFIおよびFFIを探索します。それらの相互作用は、対峙する種の増殖速度および代謝産物産生を測定することによって評価される14,15,16;しかし、この方法論はコロニーレベルにのみ解決されています。細胞レベルでの相互作用を研究するために、細菌および真菌接種剤を、寒天でコーティングしたガラス顕微鏡スライド上で培養し、次いで顕微鏡17下で画像化することができる。それにもかかわらず、閉じ込められていないため、顕微鏡スライドを使用して単一の菌糸をたどることは困難であり、タイムラプス画像を得るのが難しくなることを意味する。さらに、真菌菌糸体の定義された領域内に他の微生物を空間的に閉じ込めたり、摂動し得る定義された化学的環境を作り出す機会は、例えば、そのようなセットアップでは不可能である。土壌の「ブラックボックス」の性質はまた、単一細胞レベルでの真菌 - 微生物相互作用の研究の複雑さを増す18。土壌マイクロバイオームの信じられないほどの多様性から離れて相互作用する種を観察することによって、個々のメンバーが相互作用する正確な方法を評価することができます。したがって、BFIおよびFFIの高解像度、単一細胞イメージングを可能にする汎用性の高いプラットフォームが引き続き必要とされています。
マイクロ流体技術、いわゆるラボオンチップシステムは、単一細胞レベルでのBFIおよびFFIの研究に理想的なプラットフォームを提供します。マイクロ流体学の分野は、化学分析やマイクロエレクトロニクスのために開発された技術に由来し、生物科学19によって採用されています。マイクロ流体技術は、マイクロメートルスケールで少なくとも1つの次元を有する、小型化されたチャネルのオーダーメイドネットワーク内で少量の流体を調節し、生物学的研究におけるそれらの使用は20拡大している。特に、糸状菌21、22、23、24、25、26、27、28、29、30の生育を調べるためにマイクロ流体デバイスが開発されている。この技術を使用する利点の1つは、菌糸の閉じ込めおよびマイクロチャネル内の栄養素の分布が、従来の寒天法31よりも土壌環境の構造によく似ていることである。最近、マイクロ流体プラットフォームは、ヒト好中球と真菌病原体32、細菌と植物の根33、ならびに真菌と線虫34、35との間の相互作用を調査するために使用されている。
微生物相互作用を研究するためにマイクロ流体学を使用することの多くの利点の1つは、マイクロ流路環境の特定の制御を含む。例えば、層流レジームを利用して、定義された濃度勾配を生成することができ、これは、細菌の走化性36を調べる際に特に有用である。別の利点は、マイクロ流体装置の製造に一般的に使用される安価で生体適合性のエラストマーポリマーであるポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)の透明な性質が、明視野および蛍光顕微鏡を用いた単一細胞の高解像度イメージングを容易にすることである37。同様に、マイクロチャネル内に微生物が閉じ込められるということは、単一細胞を追跡するタイムラプス実験を実施できることを意味し、個々の細胞応答を記録し、定量化することができる37。最後に、マイクロ流体デバイスは、ユーザーフレンドリーであるように設計することができるので、非専門家38によって容易に使用することができる。
土壌に生息する微生物間の相互作用に関する知識を深めることは、生物多様性を維持し、気候変動が陸域環境に与える影響を緩和する持続可能な生態系管理慣行を改善するために重要である39。したがって、新しいマイクロ流体ツールの開発は、真菌とその相互作用の細胞レベルでの理解を広げるための基本です。ここでのプロトコルは、図1に示すように、BFIs40およびFFI41の研究のために製造された2つのマイクロ流体デバイスに焦点を当てます。
図1:細菌 - 真菌相互作用(BFI)および真菌 - 真菌相互作用(FFI)デバイスの視覚的および概略図。菌糸プラグは、マイクロチャネルの一端への入り口に配置され、装置への菌糸の成長を可能にする。細菌入口は反対側の端にある。(B)BFI装置の概略概要、相互作用マイクロチャネルを通る細菌入口の位置決めおよび菌糸増殖の方向を描写する。チャンネルは深さ10μm、幅100μm、長さ7mmで、合計28の観測チャンネルがあります。(c)コプリノプシス・シネレアと枯草菌NCIB 3610との間の寒天プレート上での対決アッセイ、スケールバー=20mm(左)。マイクロ流路内(中央および右)内のC.シネレアと枯草菌NCIB 3610との間の相互作用、すなわち真菌菌糸への細菌の極性付着を示す顕微鏡観察画像。スケールバー = 25 μm (中央) と 10 μm (右)。(d)FFI装置をガラス底のシャーレに貼り合わせ、菌糸栓を二重接種した画像。スケールバー = 1 cm. (E) FFIデバイスの概略概要。2つの真菌接種プラグが装置の両端の入口に導入され、マイクロチャネルの菌糸探索を可能にする。制御チャネルは、1つの真菌入口にのみ接続され、デッドエンドチャネルを有し、試験真菌間の相互作用を防止する。相互作用チャネルは、両方の真菌入口を接続し、マイクロチャネル内の試験対象間の菌糸相互作用を可能にする。各相互作用チャネルは、18個のダイヤモンド状のセクションで構成され、全長8.8mm(ダイヤモンドあたり490 x 430 μm)、深さ10 μm、各ダイヤモンド間の接続領域は20 μmです。チャネルタイプは複製され、スケールバー = 1 mm. (F) 相互接続された相互作用チャネルの両端から成長する、接近する2つの菌糸前部間の相互作用ゾーン。位相差顕微鏡観察像は、スケールバー=250μmである。この図のパネルは、Stanley et al., 2014 (A-C)40 および Gimeno et al., 2021 (D-F)41 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
メモ: このプロトコルで概説されている手順の概要を 図 2 に視覚的に示します。
図2:このプロトコルで詳述されている5つの主要なセクションからなる提示された方法論の概略図。 デバイス設計は、コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアとフォトリソグラフィー(1)を使用して製造されたマスターモールドを使用して作成されます。これは、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)を鋳造するために使用され、その後、スラブにダイシングされ、ガラス底のペトリ皿に接着されてマイクロ流体デバイス(2)を形成する。研究に含まれる微生物は培養され(3)、装置を接種するために使用される(4)。相互作用は顕微鏡法を用いて研究され、画像解析技術を用いて定量化される(5)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. マスターモールド製作
- フォトマスク製造
- コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイス設計を生成します。提示された装置の寸法は 図1 に与えられ、特定の設計特徴に関するより詳細な詳細は、それぞれの刊行物40、41に包括的に列挙されている。
- CAD 設計ファイルを適切な形式 (.dwg、.dxf など) を使用してエクスポートします。エクスポートしたCADデザインファイルを印刷用の商用プロバイダーに送信して、フィルムフォトリソグラフィマスクを印刷します。
- 写真石版
メモ: 次の手順は、層流フードやクリーンルーム設備など、ほこりがなく、光が制御された環境で実行する必要があります。ここで提供する実験条件は目安であり、社内で最適化する必要があります。著者らは、確立されたプロトコル42に特定のトレーニングとコンサルティングを求めることを推奨している。- 200°Cのオーブンで2時間焼成することにより100mmシリコンウェーハを作製した。シリコンウエハーをSU-8 2010フォトレジストでスピンコートし、目標膜厚10μmを目指し、500rpmで10秒(加速100rpm/s)、3,000rpmで45秒(加速度300rpm/s)の条件で塗布します。
警告: SU-8フォトレジストは危険ですので、取り扱いには注意し、吸入や皮膚への接触を防止してください。それは可燃性であり、潜在的に発癌性であり、環境に有毒である。 - コーティングされたシリコンウェーハを95°Cで2.5分間ベイクする(ソフトベーク)。フィルムフォトリソグラフィーマスクを使用し、マスクアライナーを使用して365nm波長で140mJ/cm2 のエネルギー線量でフォトレジストを紫外線(UV)光に露光する。
- 塗布したシリコンウェーハを95°Cで3.5分間ベークする(露光後ベーク)。シリコンウェーハを現像液に3分間浸漬して攪拌し、未露光のフォトレジストを除去することにより微細加工構造を明らかにする。
警告: 現像液は可燃性になる場合があり、取り扱いや保管の際は適切な注意を払ってください。 - 新鮮な現像液で10秒間すすいでください。イソプロピルアルコールで10秒間すすぎ、風乾します。ろ過された圧縮空気を使用して、構造物が完全に乾燥していることを確認してください。SU−8構造の高さを、例えば、プロフィロメーターを用いて測定する。
- 各マスターモールドを50 μLのクロロトリメチルシランでシラン化し、50 mbarの真空圧力を2時間印加します。著者らは、マスターモールドの再サイラナイゼーションは必要ではないと指摘している。
警告: クロロトリメチルシランは有害物質です。適切な個人用保護具(PPE)を着用し、取り扱いには注意してください。皮膚や目との接触を避け、吸入を防ぎます。発火源から遠ざけ、換気の良い場所で使用してください。
- 200°Cのオーブンで2時間焼成することにより100mmシリコンウェーハを作製した。シリコンウエハーをSU-8 2010フォトレジストでスピンコートし、目標膜厚10μmを目指し、500rpmで10秒(加速100rpm/s)、3,000rpmで45秒(加速度300rpm/s)の条件で塗布します。
2. デバイス製造
メモ: 次の手順は、層流フードなど、ほこりのない環境で実行する必要があります。
- ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)スラブの調製
- 清潔なプラスチックカップにヘラを入れて、主剤と硬化剤を10:1の比率で十分に混合して、約40gのPDMSを調製する。混合物を脱気し、PDMSを入れたプラスチックカップを真空チャンバ(真空圧力=50mbar)に1時間置いてすべての気泡を除去した。
- マスターモールドを透明なテープを使用してプラスチック製のマウントに固定します。圧縮ろ過された空気を使用して清掃し、ほこりの粒子を取り除きます。
注:あるいは、アルミニウム箔をガラスのペトリ皿の周りに成形し、マスターモールドを収容し、PDMS43を収容するために使用することもできます。 - PDMS混合物をマスターモールドの中央に注ぎ、平らな表面にあることを確認し、沈降させます。
メモ:PDMS混合物は、マスターモールドの表面にできるだけ近づけて注ぎ、気泡の導入を最小限に抑えるために連続的な流れを維持する必要があります。気泡は、圧縮空気を気泡の上に向けるか、細い針を使用してすくい取ることによって除去することができる。 - マスターモールドをプラスチック製の蓋でゆるやかに覆い、PDMSの表面にほこりの粒子が落ち着かないようにします。マスターモールドをオーブンに移し、70°Cで一晩硬化させた。
- オーブンからマスターモールドを取り外し、冷却します。硬化したPDMSをマスターモールドとプラスチックフレームから剥がし、マスターモールド/PDMSの損傷を防ぐように注意してください。
- PDMSにエンボス加工されたマイクロチャンネルの上に透明なテープを貼り、ほこりのない表面を維持します。接着する前にテープが取り外されていることを確認します。
- PDMSをスラブに切断する(すなわち、マスターモールド上の設計に複数の装置が含まれている場合、多くは単一の鋳造から製造できる)ように、取り付けられたギロチンまたはカミソリの刃を使用して設計によって指定される。BFI PDMSスラブの横方向の開口部を切断するときは、マイクロチャネルが完全に開いていることを確認してください(図1A)。FFI PDMSスラブの場合は、 図1Dに示すガラス底のペトリ皿に収まるように各コーナーがトリミングされていることを確認します。
- デバイスの設計に応じて、所望の入口/出口穴をパンチします。精密カッターを使用して、手本となるBFIおよびFFIデバイス用にそれぞれ3.18mmおよび4.75mmの入口穴をパンチします。
- デバイスを作成するためのPDMSスラブの接合
注:以下の洗浄ステップ(2.2.1-2.2.2)では、37kHzの精製水(ddH2O)で満たされた超音波洗浄機を使用します。PDMSスラブを洗浄することは、接合の成功44 を強化し、汚染のリスクを低減するのに役立つ。PDMSスラブを操作するには、マイクロチャネルまたはデバイス表面の損傷を避けるために、清潔な鉗子を使用し、入口穴を使用して持ち上げます。- PDMSスラブを0.5 M NaOHに浸し、5分間超音波処理します。滅菌ddH2O. PDMSスラブを70%エタノール溶液に移し、5分間超音波処理します。滅菌ddH2 0ですすいでください。
- PDMSスラブを滅菌ddH2Oに浸し、5分間超音波処理する。滅菌ddH2OからPDMSスラブを取り出し、濾過された圧縮空気を用いて乾燥させ、滅菌正方形のペトリ皿に入れる。
- PDMSスラブを入れた四角いシャーレを70°Cのオーブンに1時間置いて乾燥させる。オーブンから取り出し、ほこりのない環境で冷ましてください。PDMSスラブの表面からほこりを取り除き、テープやろ過された圧縮空気を使用します。
- プラズマクリーナーを使用して接着するPDMSスラブとガラス底ペトリ皿の表面を、真空圧力0.75mbar、電力50%、コーティング時間1分で活性化します。活性化する(そしてその後接着する)表面をプラズマクリーナーで上向きに置きます。
- PDMSスラブとガラス底のペトリ皿をプラズマクリーナーから取り外し、活性化された表面を互いにコンフォーマルに接触するように静かに配置して接着します。BFI および FFI PDMS スラブを、それぞれ直径 35 mm および 50 mm のガラス底シャーレ (ガラス厚 0.17 mm) に接着します。
メモ:接着時に圧力をかけすぎないように注意してください。これにより、マイクロチャネルが崩壊する可能性があるためです。 - ピンセットでガラス底のペトリ皿からPDMSスラブを引き抜くだけで、接合が成功したことを確認します。目または汎用顕微鏡を使用してデバイスを視覚化し、接種インレットまたはマイクロチャネルの崩壊がないようにします。
注:飽和条件(すなわち、水飽和および/または栄養が豊富な条件)の場合、プロトコルのステップ2.2.7を含めてください。水不飽和条件が必要な場合は、ステップ 2.2.8 に進みます。装置は水か媒体で満たすことができる。 - 接合直後に、BFIデバイス用の所望の溶液(細菌入口および側方開口部)100 μLまたはFFIデバイス用の各入口(合計60 μL)に30 μLの培地をピペッティングして充填する。気泡が存在する場合、PDMSは多孔質であるため、充填後約10分で消散します。
- 滅菌ddH2O(〜100〜200μL)をペトリ皿に加え、湿度を維持する。
3. 微生物培養
注:以下のステップは、真菌および細菌培養のための一般的な微生物学的手順を提供し、所望の微生物に必要な封じ込めのレベルに適した滅菌条件下(すなわち、火炎または微生物学的安全キャビネットを使用)で実施されるべきである。関心のある種について、各セクションの最後に具体例を示す。
- 真菌文化
- 寒天を添加した所望の培養液を調製する。培地を121°Cで15分間オートクレーブした。培地を50°Cまで冷却し、滅菌状態を維持しながら直径9cmのペトリ皿に注ぐ。
- コルクボーラーを使用して、菌糸体を含む寒天の直径4mmのプラグを所望の真菌株の冷蔵庫ストックコロニーから除去し、単離物を活性化する。これは、装置接種前に真菌の標準化された活発な増殖を確実にするために行われる。
注:微生物は、グリセロールストック、すなわち、-70°C41の50%グリセロール溶液中の寒天プラグ上に保存された真菌分離株から活性化することもできる。 - 菌糸体が寒天表面に接するプラグの側面を未接種ペトリ皿の中央に置く。シャーレの上部にある蓋を交換して密封してから、所望の株に適した温度で必要な時間(通常は約3〜4日間)インキュベートします。
注: トリコデルマ・ロシカムの培養条件例:麦芽エキス寒天培地、暗所にて25°Cで48時間インキュベートした。
- 細菌培養
- 所望の細菌単離物をソースストック(例えば、グリセロールストックまたは寒天プレートからの単一コロニー)から寒天プレート上にストリークアウトして、単一の細菌コロニーを達成し、汚染がないようにする45。プレートをフィルムでシールします。
- 個々のコロニーが観察されるまで、目的の単離物に固有の温度および期間でインキュベートする。
- 所望の培養液を調製する。例えば、ddH2O1Lあたり10gのトリプトン、10gのNaClおよび5gの酵母抽出物を加えて、枯草菌の培養のためのLB培地を調製する。培地を121°Cで15分間オートクレーブした。
- 培地を室温まで冷却します。培地を滅菌培養フラスコ内滅菌環境に加える。
- 滅菌接種ループを用いて寒天プレートから単一の細菌コロニーに触れる。接種したループを滅菌培養培地に移し、ループで液体に短時間触れる。
- 滅菌蓋またはホイルを使用してフラスコを密封し、選択した種に適した設定を使用して一晩振とう培養器内に置きます。
注:枯草菌の培養条件の例:i)液体培養-LB培地中で200rpmで37°Cで好気的増殖し、ii)プレート培養-LB寒天プレート上で室温。異なる真菌株の培養の詳細については、FFI/BFI論文40,41を参照されたい。
4. 装置接種
メモ: 次の手順は、滅菌装置を使用して層流フード内で実行する必要があります。
- 真菌接種
- 滅菌コルクボーラー(ø = 4mm)を使用して、3日齢の培養物の周囲にあるコロニーから寒天プラグを除去します(ステップ3.1)。成長する菌糸の前面が無傷のままであることを確認します。
- 真菌の注入口にプラグを導入し、菌糸体側を下にして、菌糸体前面の成長方向をマイクロチャネル開口部に向け、チャネルの菌糸浸潤を促す。
- 2番目の真菌種(FFIデバイスを使用している場合)に対して手順4.1.1-4.1.2を繰り返し、プラグを反対側の入口に導入します。BFI デバイスを使用している場合は、この手順を省略して、手順 4.1.4 に進みます。
- シャーレを透明フィルムで密封し、イメージングが開始されるまで暗闇の中で25〜28°Cでインキュベートする。観察される意図された生物学的事象、例えば、真菌と真菌の対立、および装置内に含まれる種の増殖速度に応じて、事前イメージングインキュベーション時間を決定する。
- 細菌接種
- 一晩培養(ステップ3.2)からの細菌を、ステップ3.2.3で詳述したのと同じ培養培地を用いて1:25の比率で希釈する。37°Cで3時間培養する。
- 遠心分離機を用いてペレット培養物を2000 x g で10分間洗浄することによって細菌を洗浄する。上清を捨て、細胞を所望の量の0.9%w/v塩化ナトリウム溶液に再懸濁する。
- 再度遠心分離し、ペレットを得た。上清を捨て、細胞を液体培地(例えば、 C. cinerea 最小培地をOD600 of 1)に再懸濁する。問題の細菌株のOD600 値を最適化します。
- BFIデバイスをインキュベーターから取り外し、滅菌環境で開きます。細菌導入口への懸濁液10μLのピペット。
注:問題の細菌 - 真菌相互作用の正確な接種タイミングを最適化してください。例えば、 C. cinereaを使用する場合は真菌接種後18時間にBFI装置に細菌を導入する。 - シャーレを透明フィルムで密封し、イメージングが開始されるまで暗所で25°Cでインキュベートする。デバイスを直立して保管します。
5. 顕微鏡と画像解析
- 顕微鏡
注:研究者は、実施する実験の性質と一致する適切なイメージング方法、例えば、反転広視野落射蛍光または共焦点顕微鏡を選択する必要があります。ここでは、具体的な詳細が選択した顕微鏡のセットアップの属性に依存するため、一般的な概要が提供されています。- 顕微鏡コンピュータ、顕微鏡本体(該当する場合)、カメラ、温度制御インキュベーター、および光源の電源を入れます。顕微鏡が正しくセットアップされていること、例えば、Köhler照明がサンプルの均一な照明に対して正しく適用されていることを確認してください。イメージングソフトウェアパッケージを起動します。
注:温度制御されたインキュベーターを使用する場合、実験を開始する前に顕微鏡の温度を数時間平衡化させることが重要です。 - マイクロ流体デバイスをステージインサートに取り付けます。アクティブなステージの移動中にデバイスが外れないように、テープでデバイスが正しく固定されていることを確認します。
- 接種された装置の画像、例えば、シングルポイントまたはタイムラプス実験のいずれかを取得する。BFIおよびFFI装置を用いて実施された実験に関連する包括的な画像化仕様は、それぞれの前述の刊行物40、41に提供される。
注:明視野画像は、位相差顕微鏡を使用して取得し、オートフォーカスソフトウェアと10倍の倍率、0.30 NA(開口数)または20倍の倍率、0.45 NAの対物レンズを使用して、成長チャネルを通る菌糸の増殖を視覚化しました。蛍光レポータータンパク質の励起は、蛍光色素に特異的な波長を有する高出力発光ダイオード光エンジンを用いて達成された。 - 後続の画像処理に適した形式に画像をエクスポートします。たとえば、.tiffのようにします。
- 顕微鏡コンピュータ、顕微鏡本体(該当する場合)、カメラ、温度制御インキュベーター、および光源の電源を入れます。顕微鏡が正しくセットアップされていること、例えば、Köhler照明がサンプルの均一な照明に対して正しく適用されていることを確認してください。イメージングソフトウェアパッケージを起動します。
- 画像解析
注:著者はフィジーをお勧めします46 画像解析用のツールとして使用できますが、他のソフトウェアパッケージも利用できます。以下は、提示されたBFIおよびFFIデバイス出版物からフィジーを使用して実施された画像解析の例です。これらの手順はMacに固有のもので、PCを使用している場合は若干異なる場合があります。
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Representative Results
代表的な結果は、手本BFI40およびFFI41デバイスから提示される。菌糸増殖速度の測定は、基本的な顕微鏡技術と組み合わせてこれらの装置を使用して容易に得ることができる。図3A−Bは、C.シネレア菌糸と枯草菌NCIB 3610との間の細菌−真菌相互作用を示す。枯草菌の存在は、同時接種後約5時間後にC.シネレアの成長を停止する(図3B)。矢印は、より薄く、より透明な菌糸の同時形態観察を示す(図3A)。また、影響を受けていない菌糸細胞が増殖し続けたことも注目された。図3C−Dは、菌糸相互作用に続くT.ロシカムNEU135に対するF. graminearum PH1−dsRedの強力な阻害効果を示し、その結果、T. rossicum菌糸増殖の完全な停止をもたらす。
図3:BFIおよびFFIデバイスからの増殖速度の定量化および観察の例。 (A)共接種後の時点におけるBFIデバイスのマイクロチャネルにおけるコプリノプシス・シネレアと枯草菌NCIB 3610との間の相互作用の明視野顕微鏡画像。矢印は、B. subtilis NCIB 3610との相互作用の後に起こった薄い菌糸形態を強調する。(B)先行菌糸先端の菌糸増殖速度は、共接種後10時間にわたって測定された。バーは、3つの生物学的反復からの標準偏差を表す。(c)箱ひげ図(n=6)は、トリコデルマ・ロッシカムに対するフザリウム・グラミネアラムPH1−dsRedの相対増殖速度を示す。有意性は**で表され、Mann-Witney U検定を使用して計算されたp<0.01を表します。バーは、それぞれ上と下の百分位数に等しい最大または最小の観測値を表します(±1.5 x 四分位範囲)。(D) F. graminearum PH1-dsRed (左から右に成長) vs T. rossicum NEU135 (右から左に成長) 同時接種後 24 時間、48 時間、および 72 時間。明視野および蛍光チャネルが重ね合わされている。スケールバー = 200 μm。この図のパネルは、Stanley et al., 2014 (A-B)40 および Gimeno et al., 2021 (C-D)41 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
相互作用事象によって誘発される形態学的変化は、本論文で概説した方法論を用いて細胞レベルで観察することができる。図4は、提示されたBFIおよびFFIデバイスの形態学的観察の例を示しています。図4Aは、シュードモナス・シンキサンタ菌(P_phen)またはP.フルオレッセンス(P_rhizo)の細菌に遭遇したときのバーティシリウム・ロンギスポラム菌糸増殖の極性の喪失を、対照真菌単独(V1)と比較した47に示す。真菌 - 細菌相互作用は、菌糸の巻き毛の外観をもたらした。これは、真菌の有意な細菌誘発トランスクリプトーム変化および推定回避行動に起因していた。これらの結果は、植物病原体であるV. longisporumとして有意であり、シュードモナス属を意味する。本実施例47においてバイオコントロールとして使用される可能性がある。
図4Bは、菌糸細胞内容物の動的損失が観察され、赤色蛍光タンパク質dTomatoを保持するブレブを形成するタイムラプス実験を示す。このブレビング形態は枯草菌との同時接種後に起こったが、一部の頂端細胞でのみ観察された。しかし、菌糸の崩壊およびそれに続くブレビング現象は、細菌付着と相関していなかった。これは、付着依存性ではない潜在的な殺菌細菌活性が起こっていることを示唆し、リポペプチドの分泌に起因すると仮説を立てた。高解像度の動的イメージング技術はまた、図4Cの矢印で示すように、C. roseaによって拮抗するとセプタ形成の増加を示す、F. graminearumの推定防御機構を明らかにした。
図4:BFIおよびFFIデバイスにおける相互作用イベント中に観察される形態の変化の例。 (A)緑色蛍光タンパク質(GFP)でタグ付けされた植物病原性真菌Verticillium longisporum(V1)のカール形態学的変化48。この形態は、蛍光シュードモナス属に応答して生じた。フェナジン合成をコードする遺伝子を有する(P_phen;P. シンキサンタ)菜種(P_rhizoの根圏から単離された細菌;P. 蛍光)。(B)枯草菌を共接種したdトマト発現コプリノプシス・シネレア40を共接種し、共接種後5時間で画像化した。細胞は5時間で無傷(左)であったが、30分後に菌糸が崩壊し(蛍光の損失)、(蛍光性の)細胞材料を含むブレブが観察された。(C)矢印は、クロノスタキス・ロゼア菌糸との相互作用後に観察されたフザリウム・グラミナリウム菌糸におけるセプタ形成を強調する。スケールバー = 10 μm、タイムスタンプ = h 同時接種後。この図のパネルは、Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 および Gimeno et al., 2021 (C)41 から修正されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
提示された装置は、動的な生理学的変化を観察するのにも適している。BFI装置を用いて、菌糸関連細菌の濃度は経時的に変化し、細胞の局所的な蓄積に続いて減少することが示された(図5A)。マイクロチャネルに沿った細菌の動員は、クラスター状の集合体においても起こることが観察された。FFI装置では、蛍光標識により、F. graminearumに直面したときのC. rosea菌糸増殖の定量化が可能になり、拮抗相互作用のダイナミクスを特徴付けることができました(図5B)。これらの測定は20時間にわたって行われ、長期のタイムラプス実験を行うためのこれらの装置の可能性を実証した。
(A)枯草菌NCIB 3610 pMF37 40によるコプリノプシス・シネレアpMA41240の菌糸への3時間にわたる付着を描いたBFI装置におけるタイムラプス実験。(B)明視野および蛍光チャネル画像は、蛍光標識されたクロノスタキス・ロゼアとフザリウム・グラミナリウム49との間の相互作用の間にFFI装置を用いて検出された緑色蛍光タンパク質(GFP)の定量を示す。スケールバー = 50 μm。グラフ(右)は、20時間にわたって任意の単位(AU)で相対蛍光をプロットし、n=6およびエラーバーは標準誤差を示す。オレンジ色および灰色のプロットは、(i)C. rosea菌糸網および(ii)C. rosea含有対照チャネルと比較した相互作用チャネルにおいて検出されたGFPの蛍光強度をそれぞれ示す。黒色対照プロットは、対照チャネルと比較したC. rosea対照チャネルにおける菌糸の蛍光強度を示す。この図のパネルは、Stanley et al., 2014 (A)40 および Gimeno et al., 2021 (B)41 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、チャネルマイクロフルイディクスを用いた真菌-微生物相互作用の研究のためのプロトコルを提示する。著者らは、これらの装置の汎用性を実証し、研究者の興味に合うように適応させることを目指している。手本となるBFIおよびFFIデバイスを使用して、真菌 - 微生物相互作用を以前にアクセス可能であったよりも詳細に研究することができる。土壌の背景の複雑さと不均一性を取り除き、菌糸が単一の単層に限定されるように成長を緩和し、環境パラメータを厳密に規制することによって、これらの生物学的事象の高解像度画像を経時的にキャプチャすることができます。これらの装置を用いて、微生物パートナー間の相互作用は、増殖速度、蛍光定量化、および形態学的形質の観察バイオイメージングを用いて特徴付けられてきた。
装置は、細胞レベルでの真菌−微生物相互作用の特性評価を可能にするように設計することができる。非専門家のための汎用性と設計の容易さにより、このプロトコルは幅広い研究課題への適応に適しています。BFIおよびFFIデバイスは、透明な性質とガラス結合表面により、実験目的に合わせてさまざまな顕微鏡での使用に適しています。これらのデバイスは、その構成と物理化学的パラメータの両方に関して調整することができます。たとえば、湿度、温度、チャンネルの飽和度などによって、テスト対象の環境エクスペリエンスが変わる可能性があります。次いで、デバイスは、チャネル構造およびサイズ、または障害物の包含によって制御される、物理的に成長を指示するか、または相互作用事象またはナビゲーション戦略などの特定の挙動を誘発することができるように設計することができる。これは、寒天プレートアッセイ31などの現在の方法論では不可能です。
これまでのところ、マイクロ流体デバイスは、真菌 - ファージ50 および真菌 - 線虫35 相互作用を探索するためにも使用されてきた。チャネルマイクロフルイディクスの使用により、デバイス内の流体の制御と交換も可能になります。この重要かつ有利な特徴は、菌糸ファージ保持50の研究に役立った。さらに、トランスクリプトミクス研究にマイクロ流体技術を使用すると、同様の寒天ベースのアッセイと比較して、発現差のある遺伝子の分解能が向上しました。これらの方法は、同じ寒天平板実験によって同定された28個の発現差遺伝子のうち24個において同時であり、マイクロ流体装置は多くのさらなる遺伝子を同定し、35と比較してより高い相対発現を報告した。
プロトコルの重要なステップは、元のデバイス設計から始まります。適切な設計を達成するためには、関心のある微生物のライフスタイルと成長/移動戦略に注意を払う必要があります。例えば、目的の微生物の生理学的要件および増殖速度を収容するのに十分なチャネル深さまたは長さを含む。マイクロチャネルの構造特性および構成要素は、ナビゲーション戦略を観察するための相互作用ゾーンまたは障害物の開口部などの特定の挙動を誘導または操作するように設計することができる。さらに、実験研究の質問は、デバイス設計で対処可能でなければなりません。例えば、(i)層流プロファイルをどのように利用できるか、(ii)調査する生物のマイクロ流路の高さを適応させ、変化させること、および(iii)装置内の菌糸の過剰増殖を防止するためのマイクロ流路入口の狭小化を考えてみましょう。著者らは、マイクロ流体デバイス設計のためのこれらのさらなるリソースを提案している51、52、53。また、製造中にデバイスをほこりから守ることも不可欠です。したがって、製造プロセスのすべての段階でほこりのない環境を維持するだけでなく、テープとろ過された圧縮空気を使用し、使用していないときはPDMS表面を覆ったままにするように注意する必要があります。プロトコルの他の重要なステップには、70%エタノール溶液でデバイスを洗浄することによって汚染のリスクを最小限に抑えること、および活性化された表面を互いに接触させ、マイクロチャネルに過度の圧力をかけないことによって、ガラス表面とPDMSスラブとの間の適切な結合を確保することが含まれる。接種前にPDMSスラブをガラスからずらして、良好な接着性を確認してください。これらのデバイスの制限の 1 つは、実験間で再利用できないことです。
オーダーメイドのマイクロ流体装置に土壌微生物を含めることで、微生物相互作用の研究のためのエキサイティングな新時代が始まります。提示された方法論の潜在的な将来の用途は、新規なバイオコントロール種または抗菌化合物の発見、または細菌動員のためのいわゆる真菌ハイウェイの特性評価など、多岐にわたる。BFIおよびFFIデバイスは、細胞レベルで相互作用前および相互作用後に起こる動的な形態学的および生理学的変化を視覚化するためのプラットフォームを提供する。新しいデバイスは、実験研究の質問に合わせて、単に創意工夫を必要とするだけで、設計と作成が簡単です。その汎用性と使いやすさは、この方法が細胞レベルで土壌微生物叢の研究をさらに進めるために非専門家によって使用できることを意味します。
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Disclosures
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
Acknowledgments
我々は、インペリアル・カレッジ・ロンドンの生物工学科及びレバーハルム・トラスト(研究助成金参照:RPG-2020-352)からの財政的支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
References
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