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Bioengineering

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63917
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London

Summary

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Abstract

Les champignons filamenteux sont des habitants prospères du sol et jouent un rôle majeur dans les écosystèmes du sol, tels que la décomposition de la matière organique et inorganique, ainsi que la régulation des niveaux de nutriments. Ils y trouvent également de nombreuses occasions d’interagir avec une variété d’autres microbes tels que des bactéries ou d’autres champignons. L’étude des interactions fongiques au niveau cellulaire, cependant, peut être difficile en raison de la nature du sol ressemblant à une boîte noire. De nouveaux outils microfluidiques sont en cours de développement pour l’étude des interactions fongiques; deux plateformes conçues pour étudier les interactions bactérien-fongique et fongique-fongique sont mises en évidence. Au sein de ces microcanaux, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être surveillées dans des environnements physico-chimiques contrôlés à une résolution temporelle et spatiale plus élevée qu’auparavant. L’application de ces outils a donné lieu à de nombreuses nouvelles connaissances biologiques, telles que l’observation de l’attachement polaire bactérien aux hyphes ou la révélation d’antagonismes fongiques-fongiques non caractérisés. Une caractéristique clé de ces méthodologies concerne la facilité d’utilisation de cet outil par des non-experts, produisant des technologies hautement traduisibles pour une utilisation dans les laboratoires de microbiologie.

Introduction

Le sol est un environnement exceptionnellement diversifié contenant une abondance de micro-organismes qui jouent un rôle déterminant dans les cyclesdu carbone et du phosphore 1,2. Les champignons filamenteux sont une composante majeure de nombreux écosystèmes en tant que décomposeurs de matière organique et inorganique et peuvent améliorer la nutrition des plantes grâce à la formation de relations symbiotiques 3,4. Dans le sol, les champignons interagissent dynamiquement avec une multitude de microbes tels que d’autres champignons5, bactéries6, virus7 et nématodes8. Ces interactions ont des conséquences importantes sur la santé des sols et des plantes. Pourtant, en raison d’un manque de systèmes expérimentaux appropriés capables d’imager les micro-organismes en interaction avec une haute résolution, beaucoup restent indéfinis.

Les recherches concernant les interactions bactériens-fongiques (IFI) et les interactions fongiques-fongiques (IFF) ont des applications précieuses dans divers domaines, y compris les antimicrobiens en médecine et les agents de lutte biologique en agriculture. Par exemple, le champignon Coprinopsis cinerea produit le peptide copsine, dont il a été démontré qu’il présente une activité antibactérienne contre l’agent pathogène humain Listeria monocytogenes9. De même, le composé dérivé du champignon, la griséofulvine, est largement utilisé comme traitement des infections fongiques humaines et est en outre capable d’inhiber la croissance du champignon phytopathogène Alternaria solani10,11. Il a également été démontré que plusieurs souches de la bactérie bacillus subtilis sont des agents de lutte biologique efficaces de l’agent pathogène fongique des plantes Rhizoctonia solani12,13. Néanmoins, en raison des limites associées aux méthodologies traditionnelles, les IFI et les IFF sont mal compris au niveau des cellules individuelles.

Les études conventionnelles explorent généralement les IFI et les IFF à l’échelle macro en utilisant des plaques de gélose avec deux espèces ou plus en confrontation. Leur interaction est évaluée en mesurant les taux de croissance et la production de métabolites de l’espèce confrontante 14,15,16; cependant, cette méthodologie n’est résolue qu’au niveau de la colonie. Pour étudier les interactions au niveau cellulaire, les inoculants bactériens et fongiques peuvent être cultivés sur des lames de microscope en verre recouvertes d’agar qui sont ensuite imagées au microscope17. Néanmoins, il peut être difficile de suivre un seul hyphe à l’aide de lames de microscope en raison d’un manque de confinement, ce qui signifie que les images time-lapse sont plus difficiles à obtenir. En outre, la possibilité de confiner spatialement d’autres micro-organismes dans des régions définies du mycélium fongique ou de créer des environnements chimiques définis qui peuvent être perturbés, par exemple, n’est pas possible dans de telles configurations. La nature « boîte noire » du sol ajoute également à la complexité de l’étude des interactions fongiques-microbiennes au niveau des cellules individuelles18. En observant les espèces en interaction loin de l’incroyable diversité du microbiome du sol, la manière exacte dont les membres individuels interagissent peut être évaluée. Ainsi, il existe un besoin continu de plates-formes polyvalentes qui permettent l’imagerie unicellulaire à haute résolution des IFI et des IFF.

Les technologies microfluidiques, appelées systèmes de laboratoire sur puce, constituent une plate-forme idéale pour l’étude des BFI et des IFF au niveau des cellules individuelles. Le domaine de la microfluidique, issu des technologies développées pour l’analyse chimique et la microélectronique, a été adopté par les sciences biologiques19. Les technologies microfluidiques régulent de petits volumes de fluides au sein d’un réseau sur mesure de canaux miniaturisés, ayant au moins une dimension à l’échelle micrométrique, et leur utilisation dans la recherche biologique s’étend20. En particulier, des dispositifs microfluidiques ont été développés pour examiner la croissance des champignons filamenteux 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. L’un des avantages de l’utilisation de cette technologie est que le confinement des hyphes et la distribution des nutriments dans les microcanaux ressemblent davantage à la structure de l’environnement du sol que les méthodes conventionnelles d’agar31. Récemment, des plateformes microfluidiques ont été utilisées pour étudier les interactions entre les neutrophiles humains et les agents pathogènes fongiques32, les bactéries et les racines des plantes33, ainsi que les champignons et les nématodes34,35.

L’un des nombreux avantages de l’utilisation de la microfluidique pour étudier les interactions microbiennes comprend le contrôle spécifique de l’environnement des microcanaux. Par exemple, les régimes d’écoulement laminaire peuvent être exploités pour générer des gradients de concentration définis, ce qui est particulièrement utile lors de l’examen de la chimiotaxie bactérienne36. Un autre avantage est que la nature transparente du poly(diméthylsiloxane) (PDMS), un polymère élastomère biocompatible peu coûteux couramment utilisé dans la fabrication de dispositifs microfluidiques, facilite l’imagerie à haute résolution de cellules individuelles à l’aide de la microscopie à fond clair et à fluorescence37. De même, le confinement des microbes dans des microcanaux signifie que des expériences en accéléré de suivi de cellules individuelles peuvent être effectuées, permettant d’enregistrer et de quantifier les réponses cellulaires individuelles37. Enfin, comme les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour être conviviaux, ils peuvent être facilement utilisés par des non-experts38.

Il est important de mieux connaître les interactions entre les micro-organismes vivant dans le sol pour améliorer les pratiques de gestion durable des écosystèmes qui maintiennent la biodiversité et atténuer l’impact des changements climatiques sur les environnements terrestres39. Ainsi, le développement de nouveaux outils microfluidiques est fondamental pour élargir la compréhension des champignons et de leurs interactions au niveau cellulaire. Le protocole ici se concentrera sur deux dispositifs microfluidiques produits pour l’étude des BFI40 et41 tels que représentés à la figure 1.

Figure 1
Figure 1 : Représentation visuelle et schématique des dispositifs d’interaction bactérienne-fongique (BFI) et d’interaction fongique (FFI). (A) Image du dispositif BFI. Un bouchon mycélien est placé à l’entrée d’une extrémité des microcanaux pour permettre la croissance hyphale dans l’appareil. L’entrée bactérienne se trouve à l’extrémité opposée. Barre d’échelle = 5 mm. (B) Vue d’ensemble schématique du dispositif BFI, décrivant le positionnement des entrées bactériennes et la direction de la croissance hyphale à travers les microcanaux d’interaction. Les canaux ont une profondeur de 10 μm, une largeur de 100 μm et une longueur de 7 mm, avec 28 canaux d’observation au total. (C) Essai de confrontation sur plaque de gélose entre Coprinopsis cinerea et Bacillus subtilis NCIB 3610, barre d’échelle = 20 mm (à gauche). Images microscopiques montrant l’interaction entre C. cinerea et B. subtilis NCIB 3610 dans le microcanal (milieu et droite), c’est-à-dire la fixation polaire des bactéries aux hyphes fongiques. Barre d’échelle = 25 μm (au milieu) et 10 μm (à droite). (D) Image du dispositif FFI collé à une boîte de Petri à fond de verre, double inoculée avec des bouchons mycéliens. Barre d’échelle = 1 cm. (E) Vue d’ensemble schématique du périphérique FFI. Deux bouchons d’inoculant fongiques sont introduits dans les entrées à chaque extrémité de l’appareil, permettant l’exploration hyphale des microcanaux. Les canaux de contrôle sont connectés à une seule entrée fongique et ont un canal sans issue, empêchant les interactions entre les champignons d’essai. Les canaux d’interaction relient les deux entrées fongiques et permettent des interactions hyphales entre les sujets testés au sein du microcanal. Chaque canal d’interaction se compose de 18 sections en forme de diamant, mesurant une longueur totale de 8,8 mm (490 x 430 μm par diamant), 10 μm de profondeur et ayant une région de connexion entre chaque diamant de 20 μm. Les types de canaux sont dupliqués, barres d’échelle = 1 mm. (F) Zone d’interaction entre deux fronts hyphales approchants, se développant à partir des extrémités opposées du canal d’interaction interconnecté. Image de microscopie à contraste de phase, barre d’échelle = 250 μm. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 et Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

REMARQUE : Un résumé des procédures décrites dans ce protocole est illustré visuellement à la figure 2.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la méthodologie présentée, composée de cinq grandes sections détaillées dans le présent protocole. Les conceptions d’appareils sont créées à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) et d’un moule maître fabriqué à l’aide de la photolithographie (1). Ceci est utilisé pour couler le poly(diméthylsiloxane) (PDMS), qui est ensuite coupé en dés en dalles et collé à des boîtes de Petri à fond de verre pour former les dispositifs microfluidiques (2). Les microbes à inclure dans l’étude sont cultivés (3) et utilisés pour inoculer les dispositifs (4). Les interactions sont étudiées à l’aide de la microscopie et quantifiées à l’aide de techniques d’analyse d’images (5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Fabrication de moules maîtres

  1. Production de photomasques
    1. Générez des conceptions de dispositifs microfluidiques à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Les dimensions des dispositifs présentés sont données à la figure 1 et plus de détails sur les caractéristiques de conception spécifiques sont énumérés de manière exhaustive dans les publications respectives40,41.
    2. Exportez le fichier de conception CAO en utilisant un format approprié (par exemple, .dwg, .dxf). Imprimez un masque de photolithographie de film en envoyant le fichier de conception CAO exporté à un fournisseur commercial pour impression.
  2. Photolithographie
    REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un environnement sans poussière et à lumière contrôlée, comme une hotte à flux laminaire ou une salle blanche. Les conditions expérimentales fournies ici sont données à titre indicatif et doivent être optimisées en interne. Les auteurs recommandent de rechercher une formation spécifique et de consulter les protocoles établis42.
    1. Préparer une plaquette de silicium de 100 mm en la faisant cuire au four à 200 °C pendant 2 h. Spin-coat la plaquette de silicium avec la résine photosensible SU-8 2010, visant une épaisseur cible de 10 μm, en utilisant les conditions suivantes: 500 tr/ min pendant 10 s (accélération 100 tr / min / s) et 3 000 tr / min pour 45 s (accélération 300 tr / min / s).
      ATTENTION: La résine photosensible SU-8 est dangereuse, faites attention lors de la manipulation et empêchez l’inhalation et le contact avec la peau. Il est inflammable, potentiellement cancérigène et toxique pour l’environnement.
    2. Cuire la plaquette de silicium enrobée à 95 °C pendant 2,5 min (cuisson douce). Exposez la résine photosensible à la lumière ultraviolette (UV), à l’aide du masque de photolithographie sur film et d’une dose d’énergie de 140 mJ/cm2 à une longueur d’onde de 365 nm à l’aide d’un aligneur de masque.
    3. Cuire la plaquette de silicium enrobée à 95 °C pendant 3,5 min (cuisson après exposition). Immerger et agiter la plaquette de silicium dans une solution de développement pendant 3 min pour révéler les structures microfabriquées en retirant la résine photosensible non exposée.
      ATTENTION: La solution de développement peut être inflammable, prenez les précautions appropriées lors de la manipulation et du stockage.
    4. Rincer avec une solution de révélateur fraîche pendant 10 s. Rincer à l’alcool isopropylique pendant 10 s et sécher à l’air. Utilisez de l’air filtré et comprimé pour vous assurer que les structures sont bien sèches. Mesurez la hauteur des structures SU-8, par exemple, à l’aide d’un profilomètre.
    5. Silaniser chaque moule maître avec 50 μL de chlorotriméthylsilane en appliquant une pression de vide de 50 mbar pendant 2 h. Les auteurs notent que la re-silanisation du moule maître n’a pas été jugée nécessaire.
      ATTENTION : Le chlorotriméthylsilane est une substance dangereuse. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié et manipulez-le avec soin. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et empêchez l’inhalation. Tenir à l’écart des sources d’inflammation et utiliser dans un endroit bien ventilé.

2. Fabrication de l’appareil

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans un environnement exempt de poussière, tel qu’une hotte à flux laminaire.

  1. Préparation de dalles de poly(diméthylsiloxane) (PDMS)
    1. Préparez environ 40 g de PDMS en mélangeant soigneusement la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 à l’aide d’une spatule dans un gobelet en plastique propre. Dégazez le mélange pour éliminer toutes les bulles d’air en plaçant le gobelet en plastique contenant le PDMS dans une chambre à vide (pression de vide = 50 mbar) pendant 1 h.
    2. Fixez le moule principal dans un support en plastique à l’aide d’un ruban adhésif transparent. Nettoyez à l’aide d’air filtré comprimé pour éliminer les particules de poussière.
      REMARQUE: Alternativement, la feuille d’aluminium peut être façonnée autour d’une boîte de Petri en verre, puis utilisée pour abriter le moule principal et contenir le PDMS43.
    3. Versez le mélange PDMS sur le centre du moule maître, en vous assurant qu’il est sur une surface plane, et laissez-le se déposer.
      REMARQUE: Le mélange PDMS doit être versé aussi près que possible de la surface du moule maître et un flux continu doit être maintenu pour minimiser l’introduction de bulles d’air. Les bulles d’air peuvent être éliminées en dirigeant l’air comprimé sur la bulle ou en les extrayant à l’aide d’une aiguille fine.
    4. Couvrez le moule principal avec un couvercle en plastique pour empêcher les particules de poussière de se déposer à la surface du PDMS. Transférer le moule maître dans un four et durcir toute la nuit à 70 °C.
    5. Retirez le moule principal du four et laissez refroidir. Retirez le PDMS durci du moule maître et du cadre en plastique, en prenant soin d’éviter d’endommager le moule maître / PDMS.
    6. Placez du ruban adhésif transparent sur les microcanaux en relief dans le PDMS pour maintenir une surface exempte de poussière. Assurez-vous que la bande est retirée avant le collage.
    7. Coupez le PDMS en dalles (c’est-à-dire que si plusieurs dispositifs sont inclus dans la conception sur le moule maître, beaucoup peuvent être fabriqués à partir d’un seul moulage) comme indiqué par la conception à l’aide d’une guillotine montée ou d’une lame de rasoir. Lors de la coupe de l’ouverture latérale de la dalle BFI PDMS, assurez-vous que les microcanaux sont complètement ouverts (Figure 1A). Pour la dalle FFI PDMS, assurez-vous que chaque coin est coupé pour lui permettre de s’insérer dans la boîte de Petri à fond de verre illustrée à la figure 1D.
    8. Percez les trous d’entrée/sortie souhaités en fonction de la conception de l’appareil. Utilisez une fraise de précision pour percer des trous d’entrée de 3,18 mm et 4,75 mm pour les dispositifs BFI et FFI exemplaires, respectivement.
  2. Collage de dalles PDMS pour créer des périphériques
    REMARQUE: Les étapes de lavage suivantes (2.2.1-2.2.2) utilisent un nettoyeur à ultrasons rempli d’eau purifiée (ddH2O) à 37 kHz. Le lavage des dalles PDMS permet d’améliorer le collageréussi 44 et de réduire le risque de contamination. Pour manipuler les dalles PDMS, utilisez des pinces propres et soulevez-les à l’aide des trous d’entrée pour éviter d’endommager les microcanaux ou la surface de l’appareil.
    1. Immergez les dalles PDMS dans 0,5 M de NaOH et soniquez pendant 5 min. Rincer avec du ddH2O stérile. Transférer les dalles PDMS dans une solution d’éthanol à 70% et sonicer pendant 5 min. Rincer avec du ddHstérile 20.
    2. Immerger les dalles PDMS dans du ddH2O stérile et soniquer pendant 5 min. Retirez les dalles PDMS du ddH2O stérile, séchez-les à l’aide d’air comprimé filtré et placez-les dans une boîte de Petri carrée stérile.
    3. Placer la boîte de Petri carrée contenant les dalles PDMS dans un four à 70 °C pendant 1 h pour sécher. Retirer du four et laisser refroidir dans un environnement sans poussière. Éliminez toute poussière de la surface des dalles PDMS à l’aide de ruban adhésif et/ou d’air comprimé filtré.
    4. Activez les surfaces des dalles PDMS et des boîtes de Petri à fond de verre à coller à l’aide d’un nettoyeur plasma avec les réglages suivants: pression d’aspiration 0,75 mbar, puissance 50%, temps de revêtement 1 min. Placez les surfaces à activer (puis à coller) vers le haut dans le nettoyeur plasma.
    5. Retirez les dalles PDMS et les boîtes de Petri à fond de verre du nettoyeur plasma et liez en plaçant doucement les surfaces activées en contact les unes avec les autres. Collez les dalles BFI et FFI PDMS aux boîtes de Petri à fond de verre de 35 mm et 50 mm de diamètre (épaisseur de verre 0,17 mm), respectivement.
      REMARQUE: Veillez à ne pas appliquer trop de pression lors du collage, car cela peut entraîner l’effondrement des microcanaux.
    6. Vérifiez le collage réussi en essayant simplement de retirer la dalle PDMS de la boîte de Petri à fond de verre avec une pince à épiler. Visualisez les appareils à l’œil nu ou à l’aide de la microscopie générique pour éviter l’effondrement des entrées d’inoculation ou des microcanaux.
      REMARQUE : Pour les conditions saturées (c.-à-d. saturées d’eau et/ou riches en nutriments), inclure l’étape 2.2.7 du protocole. Si des conditions insaturées dans l’eau sont requises, passez à l’étape 2.2.8. Les appareils peuvent être remplis d’eau ou de médias.
    7. Remplissez les dispositifs immédiatement après le collage en pipetant 100 μL de la solution souhaitée pour le dispositif BFI (entrée bactérienne et ouverture latérale) ou 30 μL de fluide dans chaque entrée (60 μL au total) pour le dispositif FFI. Si des bulles d’air sont présentes, celles-ci se dissiperont environ 10 minutes après le remplissage car le PDMS est poreux.
    8. Ajouter ddH stérile2O (~100-200 μL) dans la boîte de Petri pour maintenir l’humidité.

3. Culture microbienne

REMARQUE : Les étapes suivantes fournissent une procédure microbiologique générale pour la culture fongique et bactérienne et doivent être effectuées dans des conditions stériles (c.-à-d. à l’aide d’une flamme ou d’une armoire de sécurité microbiologique) appropriées au niveau de confinement requis pour les microbes souhaités. Des exemples précis sont donnés à la fin de chaque section pour une espèce d’intérêt.

  1. Culture fongique
    1. Préparer le milieu de culture souhaité complété par de la gélose. Autoclaver le milieu à 121 °C pendant 15 min. Laisser refroidir le milieu à 50 °C et verser dans des boîtes de Petri de 9 cm de diamètre, en maintenant des conditions stériles.
    2. Utilisez un foreur de liège pour retirer un bouchon de gélose de 4 mm de diamètre contenant du mycélium d’une colonie de stock de réfrigérateur de la souche fongique souhaitée afin d’activer l’isolat. Ceci est effectué pour assurer une croissance standardisée et vigoureuse du champignon avant l’inoculation du dispositif.
      REMARQUE: Les microbes peuvent également être activés à partir d’un stock de glycérol, c’est-à-dire des isolats fongiques stockés sur des bouchons de gélose dans une solution de glycérol à 50% à -70 ° C41.
    3. Placez le côté du bouchon avec du mycélium en contact avec la surface de la gélose au centre de la boîte de Petri non ininoculée. Remplacez le couvercle sur le dessus de la boîte de Petri et scellez avant d’incuber à la température appropriée pour la souche souhaitée pendant la durée requise, généralement environ 3 à 4 jours.
      NOTE: Exemples de conditions de culture pour Trichoderma rossicum: Gélose à l’extrait de malt, incubée à 25 °C dans l’obscurité pendant 48 h.
  2. Culture bactérienne
    1. Strier l’isolat bactérien désiré du stock source (p. ex., stock de glycérol ou colonie unique de la plaque d’agar) sur une plaque d’agar pour obtenir des colonies bactériennes uniques et assurer l’absence de contamination45. Scellez la plaque avec un film.
    2. Incuber à une température et à une durée spécifiques à l’isolat d’intérêt jusqu’à ce que des colonies individuelles soient observées.
    3. Préparez le bouillon de culture souhaité. Par exemple, ajouter 10 g de tryptone, 10 g de NaCl et 5 g d’extrait de levure pour 1 L de ddH2O pour préparer le milieu LB pour la culture de B. subtilis. Autoclaver le milieu à 121 °C pendant 15 min.
    4. Laissez le milieu refroidir à la température ambiante. Ajouter le milieu à une fiole de culture stérile à l’intérieur d’un environnement stérile.
    5. Touchez une seule colonie bactérienne de la plaque de gélose à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile. Transférer la boucle inoculée dans le milieu de culture stérile en touchant brièvement le liquide avec la boucle.
    6. Scellez la fiole à l’aide d’un couvercle ou d’une feuille stérile et placez-la à l’intérieur d’un incubateur à agitation pendant la nuit en utilisant les paramètres appropriés à l’espèce sélectionnée.
      NOTE: Exemples de conditions de culture pour B. subtilis: i) culture liquide - croissance aérobie à 37 °C à 200 tr/min en milieu LB et ii) culture sur plaque - température ambiante sur plaque de gélose LB. Reportez-vous aux documents FFI/BFI40,41 pour plus de détails sur la culture de différentes souches fongiques.

4. Inoculation de l’appareil

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent avoir lieu à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire à l’aide d’un équipement stérile.

  1. Inoculation fongique
    1. Utilisez un foreur de liège stérilisé (ø = 4 mm) pour retirer un bouchon d’agar de la colonie située à la périphérie d’une culture vieille de 3 jours (étape 3.1). Assurez-vous que le front hyphale en croissance reste intact.
    2. Introduisez le bouchon dans l’entrée fongique, côté mycélium vers le bas, avec la direction de croissance du front hyphale orientée vers les ouvertures des microcanaux pour encourager l’infiltration hyphale des canaux.
    3. Répétez les étapes 4.1.1 à 4.1.2 pour la deuxième espèce fongique (si vous utilisez le dispositif FFI), en introduisant la fiche dans l’entrée opposée. Si vous utilisez le périphérique BFI, omettez cette étape et passez à l’étape 4.1.4.
    4. Scellez la boîte de Petri avec un film transparent et incubez à 25-28 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que l’imagerie commence. Déterminer le temps d’incubation avant l’imagerie en fonction de l’événement biologique prévu à observer, p. ex. confrontations fongiques-fongiques, et du taux de croissance des espèces incluses dans l’instrument.
  2. Inoculation bactérienne
    1. Diluer les bactéries d’une culture pendant la nuit (étape 3.2) dans un rapport de 1:25 en utilisant le même milieu de culture que celui détaillé à l’étape 3.2.3. Culture pendant 3 h à 37 °C.
    2. Laver les bactéries en granulant la culture à l’aide d’une centrifugeuse à 2000 x g pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans le volume désiré de 0,9 % p/v de solution de chlorure de sodium.
    3. Centrifuger à nouveau pour obtenir une pastille. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu liquide (p. ex., C. cinerea minimal medium à un OD600 de 1). Optimiser la valeur OD600 pour la souche bactérienne en question.
    4. Retirez le dispositif BFI de l’incubateur et ouvrez-le dans un environnement stérile. Pipette 10 μL de suspension dans l’entrée bactérienne.
      REMARQUE: Optimisez les temps exacts d’inoculation pour les interactions bactériennes-fongiques en question. Par exemple, introduire des bactéries dans le dispositif BFI 18 h après l’inoculation fongique si vous utilisez C. cinerea.
    5. Scellez la boîte de Petri avec un film transparent et incubez à 25 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que l’imagerie commence. Rangez l’appareil à la verticale.

5. Microscopie et analyse d’images

  1. Microscopie
    REMARQUE: Le chercheur doit choisir la méthode d’imagerie appropriée en accord avec la nature de l’expérience à mener, par exemple, une épifluorescence à grand champ inversé ou une microscopie confocale. Un aperçu général a été fourni ici, car les détails spécifiques dépendront des attributs de la configuration microscopique choisie.
    1. Allumez l’ordinateur du microscope, le corps principal du microscope (le cas échéant), la caméra, l’incubateur à température contrôlée et la ou les sources de lumière. Assurez-vous que le microscope a été correctement installé, par exemple, l’éclairage Köhler a été correctement appliqué pour un éclairage uniforme de l’échantillon. Lancez le progiciel d’imagerie.
      REMARQUE: Lors de l’utilisation d’un incubateur à température contrôlée, il est important de permettre à la température du microscope de s’équilibrer pendant plusieurs heures avant de commencer une expérience.
    2. Montez le dispositif microfluidique dans l’insert de scène. Assurez-vous que l’appareil est bien fixé, c’est-à-dire avec du ruban adhésif, pour éviter de déloger l’appareil pendant le mouvement actif de la scène.
    3. Acquérir des images des dispositifs inoculés, par exemple, des expériences en un seul point ou en accéléré. Des spécifications d’imagerie complètes pertinentes pour les expériences menées avec les dispositifs BFI et FFI sont fournies dans les publications respectivessusmentionnées 40,41.
      REMARQUE: Les images en champ clair ont été acquises en utilisant la microscopie à contraste de phase pour visualiser la prolifération hyphale à travers les canaux de croissance à l’aide d’un logiciel de mise au point automatique et d’un grossissement de 10x, d’un grossissement de 0,30 NA (ouverture numérique) ou d’un grossissement de 20x, d’objectifs de 0,45 NA. L’excitation des protéines rapporteures fluorescentes a été réalisée à l’aide d’un moteur lumineux à diode électroluminescente de haute puissance avec des longueurs d’onde spécifiques au fluorophore.
    4. Exportez les images dans un format approprié pour le traitement ultérieur de l’image. Par exemple, .tiff.
  2. Analyse d’images
    NOTE: Les auteurs recommandent Fidji46 comme outil d’analyse d’images, mais d’autres progiciels sont disponibles. Voici des exemples d’analyses d’images effectuées à l’aide de Fidji à partir des publications présentées sur les appareils BFI et FFI. Ces étapes sont spécifiques à un Mac et peuvent différer légèrement si vous utilisez un PC.
    1. Mesures du taux de croissance hyphale
      NOTE: Cette méthode a été utilisée dans le manuscrit BFI40 pour mesurer les taux de croissance des hyphes individuels.
      1. Téléchargez, installez et lancez Fiji. Importez la séquence d’images à partir d’une expérience time-lapse en sélectionnant Fichier > Importer > séquence d’images. Recherchez le dossier dans lequel les données sont stockées et sélectionnez Ouvrir. Dans la fenêtre Options de séquence , sélectionnez Préférences, puis OK.
      2. Sélectionnez l’icône Ligne droite dans la barre d’outils principale. Placez le début de la ligne droite à l’extrémité de l’extrémité hyphale en croissance en cliquant puis en faisant glisser le curseur vers un autre point de la fenêtre. Une ligne jaune apparaîtra avec trois cases indiquant le début, le milieu et la fin de la ligne.
      3. Passez à l’image suivante de la séquence d’images en maintenant la touche Ctrl enfoncée et >. Placez l’extrémité de la ligne droite à l’extrémité de l’hyphe en croissance en sélectionnant et en faisant glisser la case carrée vers la bonne position.
      4. Maintenez les touches Ctrl et M enfoncées pour mesurer la longueur de la ligne en pixels. Une fenêtre Résultats apparaîtra avec les données mesurées. Définissez les données affichées dans la fenêtre Résultats comme suit : cliquez sur la fenêtre Résultats , puis sélectionnez Résultats > Définir les mesures.
      5. Passez à l’image suivante de la séquence d’images en maintenant la touche Ctrl enfoncée, puis >. Placez le début de la ligne droite à l’extrémité de l’hyphe en croissance en sélectionnant et en faisant glisser la case carrée à la bonne position.
      6. Maintenez la touche Ctrl enfoncée , puis sur M pour mesurer la longueur de la ligne en pixels. Une fenêtre Résultats apparaîtra avec les données mesurées.
      7. Répétez les étapes 5.2.1.5-5.2.1.6 jusqu’à ce que vous ayez fini de mesurer la croissance de l’hyphe en pixels.
      8. Sélectionnez toutes les données dans la fenêtre Résultats . Copiez et collez dans un autre logiciel, par exemple une feuille de calcul, pour traiter les données. Tracez la croissance hyphale (en pixels ou en micromètres) en fonction du temps et calculez les taux de croissance moyens. Effectuer au moins trois répliques biologiques par expérience.
    2. Mesures de l’intensité de fluorescence
      NOTE: Cette méthode a été utilisée dans la publicationFFI 41 pour évaluer le changement d’intensité de fluorescence dans les hyphes de Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP au contact de Clonostachys rosea 016 en fonction du temps.
      1. Téléchargez, installez et lancez Fiji. Importez une séquence d’images à partir d’une expérience time-lapse en sélectionnant Fichier > Importer > Séquence d’images. Recherchez le dossier dans lequel les données sont stockées et sélectionnez Ouvrir. Dans la fenêtre Options de séquence, sélectionnez Préférences , puis OK.
      2. Spécifiez une région d’intérêt (ROI) pour mesurer l’intensité de fluorescence absolue d’un hyphe à l’aide de l’outil rectangulaire, situé dans la barre d’outils principale. La taille du carré peut être définie exactement comme suit : Modifier > Sélection > Spécifier ; le retour sur investissement peut également être enregistré pour référence ultérieure dans le gestionnaire de retour sur investissement en sélectionnant Modifier > sélection > Ajouter au gestionnaire.
      3. Mesurez l’intensité de fluorescence absolue (valeur grise moyenne) dans le retour sur investissement défini pour chaque image de l’ensemble de la séquence ou de la pile d’images comme suit : Pile d’images > > Pile de mesures. La fenêtre Résultats s’ouvrira automatiquement une fois que toutes les images de la pile auront été traitées.
        REMARQUE: Les données affichées dans la fenêtre Résultats peuvent être définies comme suit: cliquez sur la fenêtre Résultats , puis sélectionnez Résultats > Définir les mesures. Assurez-vous que la valeur grise moyenne a été sélectionnée.
      4. Sélectionnez toutes les données dans la fenêtre Résultats . Copiez et collez dans un autre logiciel, par exemple une feuille de calcul, pour tracer les intensités de fluorescence absolues du retour sur investissement spécifié en fonction du temps.
      5. Répétez les étapes 5.2.2.2-5.2.2.4 pour recueillir des mesures d’intensité de fluorescence absolue pour chaque roi, c’est-à-dire sur l’hyphe d’intérêt, à côté de l’hyphe d’intérêt ou dans le canal de contrôle correspondant.
      6. Calculer les intensités de fluorescence relatives appropriées en unités arbitraires (UA), par exemple en divisant l’intensité de fluorescence absolue du ROI [hyphe d’intérêt] par l’intensité de fluorescence absolue du ROI [canal de contrôle]. Consultez la publication41 de la FFI pour plus de détails.
      7. Effectuer au moins trois répliques biologiques par expérience et tracer les intensités de fluorescence relatives en fonction du temps.

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Representative Results

Des résultats représentatifs sont présentés à partir des dispositifs exemplaires BFI40 et FFI41. Les mesures du taux de croissance de l’hyphalie peuvent facilement être obtenues à l’aide de ces dispositifs en combinaison avec des techniques de microscopie de base. La figure 3A-B illustre les interactions bactériens-fongiques entre C. cinerea hyphae et B. subtilis NCIB 3610. La présence de B. subtilis arrête la croissance de C. cinerea après environ 5 h après la co-inoculation (figure 3B). Les flèches indiquent l’observation morphologique simultanée d’hyphes plus minces et plus transparents (Figure 3A). Il a également été noté que les cellules hyphales non affectées continuaient de proliférer. La figure 3C-D montre le fort effet inhibiteur de F. graminearum PH1-dsRed sur T. rossicum NEU135 après interaction hyphale, entraînant un arrêt complet de la croissance hyphale de T. rossicum.

Figure 3
Figure 3 : Exemples de quantification et d’observation du taux de croissance à partir des dispositifs BFI et FFI. (A) Images microscopiques en champ clair des interactions entre Coprinopsis cinerea et Bacillus subtilis NCIB 3610 dans les microcanaux du dispositif BFI aux points temporels après la co-inoculation. Les flèches mettent en évidence une morphologie hyphale mince, qui s’est produite après une interaction avec B. subtilis NCIB 3610. Barre d’échelle = 25 μm. (B) Taux de croissance hyphale des pointes hyphales principales mesuré plus de 10 h après la co-inoculation. Les barres représentent des écarts-types par rapport à trois répliques biologiques. (C) Boxplot (n = 6) affichant le taux de croissance relatif de Fusarium graminearum PH1-dsRed par rapport à Trichoderma rossicum. La signification est notée par ** et représente p < 0,01, calculée à l’aide du test de Mann-Witney U. Les barres représentent la plus grande ou la plus petite observation égale au centile supérieur et au centile inférieur, respectivement (± plage interquartile de 1,5 x). (D) F. graminearum PH1-dsRed (en croissance de gauche à droite) vs T. rossicum NEU135 (en croissance de droite à gauche) à 24 h, 48 h et 72 h après la co-inoculation. Canaux de champ lumineux et de fluorescence superposés. Barre d’échelle = 200 μm. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Stanley et al., 2014 (A-B)40 et Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les changements morphologiques induits par les événements d’interaction peuvent être observés au niveau cellulaire à l’aide des méthodologies décrites dans cet article. La figure 4 donne des exemples d’observations morphologiques pour les dispositifs BFI et FFI présentés. La figure 4A montre la perte de polarité de la croissance hyphale de Verticillium longisporum lorsqu’on rencontre les bactéries Pseudomonas synxantha (P_phen) ou P. fluorescens (P_rhizo), par rapport aux champignons témoins seuls (V1)47. Les interactions fongiques-bactériennes ont entraîné l’apparence bouclée des hyphes. Cela a été attribué à d’importants changements transcriptomiques induits par la bactérie dans les champignons et au comportement d’évitement putatif. Ces résultats sont significatifs car V. longisporum est un agent pathogène des plantes, c’est-à-dire le Pseudomonas sp. a le potentiel d’être utilisé comme biocontrôle dans ce cas47.

La figure 4B montre une expérience en accéléré dans laquelle la perte dynamique du contenu cellulaire hyphale peut être observée, formant des blebs qui retiennent la protéine fluorescente rouge dTomato. Cette morphologie de blebbing s’est produite après la co-inoculation avec B. subtilis, mais n’a été observée que dans certaines cellules apicales. Cependant, l’effondrement des hyphes et les phénomènes de blebbing ultérieurs n’étaient pas corrélés avec l’attachement bactérien. Cela suggérait qu’il y avait une activité bactérienne fongicide potentielle qui n’était pas dépendante de l’attachement, supposée être due à la sécrétion de lipopeptides. Les techniques d’imagerie dynamique à haute résolution ont également révélé un mécanisme de défense putatif de F. graminearum, présentant une formation accrue de septa lorsqu’il est antagonisé par C. rosea, comme l’indiquent les flèches de la figure 4C.

Figure 4
Figure 4 : Exemples de changements de morphologie observés lors d’événements d’interaction dans les dispositifs BFI et FFI. (A) Les changements morphologiques de curling chez les champignons phytopathogènes Verticillium longisporum (V1) marqués avec de la protéine fluorescente verte (GFP)48. Cette morphologie s’est produite en réponse à un Pseudomonas spp fluorescent. avec des gènes codant pour la synthèse de la phénazine (P_phen; P. synxantha) et une bactérie isolée de la rhizosphère du colza (P_rhizo; P. fluorescens). Barres d’échelle = 20 μm. (B) dTomato-exprimant Coprinopsis cinerea40 co-inoculé avec Bacillus subtilis imagé 5 h après la co-inoculation. Les cellules étaient intactes (à gauche) à 5 h, mais un hyphe s’est effondré 30 minutes plus tard (perte de fluorescence) et des blebs contenant du matériel cellulaire (fluorescent) ont été observés. Barre d’échelle = 25 μm. (C) Les flèches mettent en évidence la formation de septa dans les hyphes de Fusarium graminearum observée après interaction avec Clonostachys rosea hyphae. Barre d’échelle = 10 μm, horodatage = h après la co-inoculation. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 et Gimeno et al., 2021 (C)41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les appareils présentés sont également adaptés à l’observation des changements physiologiques dynamiques. À l’aide du dispositif BFI, il a été démontré que la concentration de bactéries associées aux hyphes changeait au fil du temps et diminuait à la suite d’une accumulation locale de cellules (figure 5A). La mobilisation bactérienne le long des microcanaux a également été observée dans des assemblages de type grappe. Dans le dispositif FFI, le marquage par fluorescence a permis de quantifier la prolifération hyphale de C. rosea lorsqu’il était confronté à F. graminearum pour caractériser la dynamique de l’interaction antagoniste (Figure 5B). Ces mesures ont été prises sur une période de 20 h et démontrent le potentiel de ces dispositifs pour mener des expériences time-lapse à long terme.

Figure 5
Figure 5 : Mesures exemplaires de caractérisation physiologique dynamique pour les dispositifs BFI et FFI. (A) Expérience en accéléré dans le dispositif BFI représentant la fixation par Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 aux hyphes de Coprinopsis cinerea pMA41240 sur 3 h. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Les images en champ clair et en canal de fluorescence montrent la quantification de la protéine fluorescente verte (GFP) détectée à l’aide du dispositif FFI lors de l’interaction entre Clonostachys rosea marquée par fluorescence et Fusarium graminearum49. Barre d’échelle = 50 μm. Le graphique (à droite) trace la fluorescence relative en unités arbitraires (UA) sur 20 h, n = 6 et les barres d’erreur indiquent l’erreur-type. Les graphiques orange et gris illustrent les intensités de fluorescence de (i) GFP détectée dans le réseau hyphale de C. rosea et (ii) le canal d’interaction par rapport au canal témoin contenant C. rosea, respectivement. Le diagramme de contrôle noir montre l’intensité de fluorescence des hyphes dans le canal de contrôle de C. rosea par rapport au canal de contrôle. Les panneaux de cette figure ont été modifiés à partir de Stanley et al., 2014 (A)40 et Gimeno et al., 2021 (B)41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cet article présente un protocole pour l’étude des interactions fongiques-microbiennes à l’aide de la microfluidique des canaux. Les auteurs visent à démontrer la polyvalence de ces dispositifs et à encourager l’adaptation en fonction des intérêts du chercheur. En utilisant les dispositifs BFI et FFI exemplaires, les interactions fongiques-microbiennes peuvent être étudiées plus en détail qu’auparavant. En supprimant la complexité et l’hétérogénéité du fond du sol, en modérant la croissance des hyphes de telle sorte qu’ils soient confinés à une seule monocouche et en régulant étroitement les paramètres environnementaux, il est possible de capturer des images à haute résolution de ces événements biologiques au fil du temps. À l’aide de ces dispositifs, les interactions entre les partenaires microbiens ont été caractérisées à l’aide du taux de croissance, de la quantification de la fluorescence et de la bioimagerie observationnelle des traits morphologiques.

Les dispositifs peuvent être conçus pour permettre la caractérisation des interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire. La polyvalence et la facilité de conception pour les non-spécialistes rendent ce protocole adapté à l’adaptation à un large éventail de questions de recherche. Les dispositifs BFI et FFI peuvent être utilisés avec une variété de microscopes pour répondre à l’objectif expérimental, en raison de leur nature transparente et de leur surface liée au verre. Les dispositifs peuvent être adaptés en fonction de leur configuration et de leurs paramètres physico-chimiques; par exemple, l’humidité, la température ou la saturation des canaux peuvent modifier l’expérience environnementale du sujet testé. Ensuite, l’appareil peut être conçu de manière à pouvoir diriger physiquement la croissance ou provoquer un comportement particulier, tel que des événements d’interaction ou des stratégies de navigation, contrôlés par la structure et la taille des canaux ou l’inclusion d’obstacles. Cela n’est pas possible avec les méthodologies actuelles, telles que les essais sur plaque d’agar31.

Jusqu’à présent, des dispositifs microfluidiques ont également été utilisés pour explorer les interactions fongique-phage50 et fongique-nématode35 . L’utilisation de la microfluidique des canaux permet également le contrôle et l’échange de fluides à l’intérieur de l’appareil. Cette caractéristique importante et avantageuse a joué un rôle déterminant dans l’étude de la rétention des phages mycéliens50. De plus, l’utilisation de technologies microfluidiques pour les études transcriptomiques a donné une plus grande résolution des gènes exprimés différentiellement par rapport à un test similaire à base d’agar. Les méthodes étaient simultanées dans 24 des 28 gènes exprimés différentiellement identifiés par la même expérience sur plaque d’agar, les dispositifs microfluidiques identifiant de nombreux autres gènes et rapportant une expression relative plus élevée en comparaison35.

Les étapes critiques du protocole commencent par la conception originale de l’appareil. Pour obtenir un design approprié, une attention particulière doit être accordée au mode de vie et à la stratégie de croissance / mobilité des microbes d’intérêt. Par exemple, inclure une profondeur ou une longueur de canal suffisante pour répondre aux besoins physiologiques et à la vitesse de croissance du micro-organisme d’intérêt. Les caractéristiques structurelles et les composants des microcanaux peuvent être conçus pour induire ou manipuler des comportements spécifiques, tels que des ouvertures pour les zones d’interaction ou des obstacles pour observer les stratégies de navigation. De plus, la question de la recherche expérimentale doit pouvoir être abordée avec la conception de l’appareil. Considérons, par exemple: (i) comment les profils d’écoulement laminaire peuvent être exploités, (ii) l’adaptation et la variation des hauteurs de microcanaux pour l’organisme à étudier, et (iii) le rétrécissement des entrées de microcanaux pour empêcher la prolifération excessive d’hyphes dans le dispositif. Les auteurs suggèrent ces ressources supplémentaires pour la conception de dispositifs microfluidiques 51,52,53. Il est également essentiel de garder les appareils exempts de poussière pendant la fabrication. Par conséquent, il faut veiller à maintenir un environnement exempt de poussière à toutes les étapes du processus de fabrication, ainsi qu’en utilisant du ruban adhésif et de l’air comprimé filtré, et en gardant les surfaces PDMS couvertes lorsqu’elles ne sont pas utilisées. D’autres étapes critiques du protocole comprennent la minimisation du risque de contamination en lavant les appareils dans une solution d’éthanol à 70% et en assurant une liaison adéquate entre la surface en verre et la dalle PDMS, en plaçant doucement les surfaces activées en contact les unes avec les autres et en n’appliquant pas trop de pression sur les microcanaux. Vérifiez l’adhérence satisfaisante en essayant de déplacer la dalle PDMS du verre avant l’inoculation. L’une des limites de ces dispositifs est qu’ils ne peuvent pas être réutilisés entre les expériences.

L’inclusion de microbes du sol dans des dispositifs microfluidiques sur mesure marque le début d’une nouvelle ère passionnante pour la recherche sur les interactions microbiennes. Les applications futures potentielles de la méthodologie présentée sont vastes, telles que la découverte de nouvelles espèces de lutte biologique ou de composés antimicrobiens, ou la caractérisation de la soi-disant autoroute fongique pour la mobilisation bactérienne. Les dispositifs BFI et FFI fournissent une plate-forme pour visualiser les changements morphologiques et physiologiques dynamiques qui se produisent avant et après l’interaction au niveau cellulaire. Les nouveaux dispositifs sont simples à concevoir et à créer, nécessitant simplement de l’ingéniosité, pour répondre à la question de la recherche expérimentale. Leur polyvalence et leur facilité d’utilisation signifient que cette méthode peut être utilisée par des non-experts pour faire avancer la recherche sur le microbiome du sol au niveau cellulaire.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le soutien financier du département de bio-ingénierie de l’Imperial College de Londres et du Leverhulme Trust (référence de subvention de recherche: RPG-2020-352).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Difco Laboratories 214010 Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil Fisher Scientific Ltd 11759408
AutoCAD 2021 Autodesk, USA
Autoclave (VX-75) Systec
Centrifuge (5810R) Eppendorf
Chlorotrimethysilane Merck Life Sciences 386529 CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer SLS COR1000
Developer solution (mr-Dev 600) Microresist Technologies CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks VWR 214-1108 e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)  Fisher Scientific Ltd E/0650DF/15 Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji ImageJ Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers SLS INS5026
Forceps Fisher Scientific Ltd 10008051 Bent, sharp
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD35-100 35 mm
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD5040-100 50 mm
Glass crystallisation dishes VWR 216-1865 Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes VWR 216-1866 Used in the development of master moulds
Glass media bottles Fisher Scientific Ltd 15456113 e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton) Fisher Scientific Ltd 10625251 Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM) SAWATEC
Inoculation loop VWR COPA175CS01
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
Laminar flow hood Air Science (PCR) Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium Fisher Scientific Ltd BP9723-500 Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB) Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner Suss Microtec
Malt extract VWR 84618 Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer Applied Materials 4700DP Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount 3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2) Contained Air Solutions Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water Available as standard in biology labs. 
NaOH Fisher Scientific Ltd BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software Nikon Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer Nikon Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115) Fisher Scientific Ltd 15602126 Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S) KOYO Used for preparing silicon wafers
Parafilm Bemis HS234526B transparent film
Petri dishes, square sterile Fisher Scientific Ltd 11708573 120.5 mm
Petri dishes, sterile Fisher Scientific Ltd 15370366 90 mm 
Photolithography mask Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto) Diener Electronic 100012601
Plastic cup Semadeni 8323
Plastic spatula Semadeni 3340
Portable precision balance (OHAUS Scout) Fisher Scientific Ltd 15519631 Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter Syneo HS1251135P1183 Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter  Syneo HS1871730P1183S Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer  Bruker Dektak XT-stylus
Razor blades Häberle Labortechnik 9156110
Refridgerator Haden 4-6 °C
Retiga R1 CCD camera Qimaging Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape Office Depot 3969954 19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) Fisher Scientific Ltd 10257954
Silicon wafer Inseto 100 mm
Soda lime glass plate Inseto 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Spincoater  SAWATEC SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist MicroChem CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. 
Sylgard 184 elastomer kit VWR 634165S Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator Okolab Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope Nikon MEA54000 Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line Fisher Scientific Ltd FB15050
Vacuum desiccator Fisher Scientific Ltd 10528861 Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH20105 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH48230 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions

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Bioingénierie numéro 184
Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire
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Masters-Clark, E., Clark, A. J.,… More

Masters-Clark, E., Clark, A. J., Stanley, C. E. Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level. J. Vis. Exp. (184), e63917, doi:10.3791/63917 (2022).

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