Summary
På grund av jordens opacitet kan interaktioner mellan dess ingående mikrober inte lätt visualiseras med cellulär upplösning. Här presenteras två mikrofluidiska verktyg som erbjuder nya möjligheter att undersöka svamp-mikrobiella interaktioner. Enheterna är mångsidiga och enkla att använda, vilket möjliggör hög spatiotemporal kontroll och högupplöst avbildning på cellnivå.
Abstract
Filamentösa svampar är framgångsrika invånare i jorden och spelar en viktig roll i markens ekosystem, såsom vid nedbrytning av organiskt och oorganiskt material, samt reglering av näringsnivåer. Där hittar de också många möjligheter att interagera med en mängd andra mikrober som bakterier eller andra svampar. Att studera svampinteraktioner på cellnivå kan dock vara utmanande på grund av jordens svarta lådliknande natur. Nya mikrofluidiska verktyg utvecklas för studier av svampinteraktioner; två plattformar som är utformade för att studera bakteriell-svamp och svamp-svampinteraktioner lyfts fram. Inom dessa mikrokanaler kan svamp-mikrobiella interaktioner övervakas i kontrollerade fysikalisk-kemiska miljöer med högre tidsmässig och rumslig upplösning än vad som tidigare varit möjligt. Tillämpningen av dessa verktyg har gett många nya biologiska insikter, såsom observation av bakteriell polär bindning till hyfer eller avslöjande av okarakteriserade svamp-svamp-antagonismer. Ett viktigt inslag i dessa metoder är att det är lätt att använda detta verktyg av icke-experter, vilket ger mycket översättningsbar teknik för användning i mikrobiologilaboratorier.
Introduction
Jord är en exceptionellt varierad miljö som innehåller ett överflöd av mikroorganismer som är avgörande för kol- och fosforcykler 1,2. Trådformiga svampar är en viktig komponent i många ekosystem som sönderdelare av organiskt och oorganiskt material och kan förbättra växternas näring genom bildandet av symbiotiska relationer 3,4. Inom jord interagerar svampar dynamiskt med en mängd mikrober som andra svampar5, bakterier6, virus7 och nematoder8. Dessa interaktioner har betydande konsekvenser för mark- och växthälsa. Men på grund av bristen på lämpliga experimentella system som kan avbilda interagerande mikroorganismer med hög upplösning förblir många odefinierade.
Undersökningar av bakteriell-svampinteraktioner (BFI) och svamp-svampinteraktioner (FFI) har värdefulla tillämpningar inom en rad områden, inklusive antimikrobiella medel inom medicin och biologiska bekämpningsmedel inom jordbruket. Till exempel producerar svampen Coprinopsis cinerea peptiden copsin, som har visat sig uppvisa antibakteriell aktivitet mot den mänskliga patogenen Listeria monocytogenes9. På samma sätt används den svamp-härledda föreningen, griseofulvin, i stor utsträckning som en behandling för mänskliga svampinfektioner och kan dessutom hämma tillväxten av den växtpatogena svampen Alternaria solani10,11. Flera stammar av den jordlevande bakterien Bacillus subtilis har också visat sig vara effektiva biologiska bekämpningsmedel av svampväxtpatogenen Rhizoctonia solani12,13. Icke desto mindre, på grund av begränsningar i samband med traditionella metoder, är BFI och FFI dåligt förstådda på nivån för enskilda celler.
Konventionella studier utforskar vanligtvis BFI och FFI på makroskalan med hjälp av agarplattor med två eller flera arter i konfrontation. Deras interaktion bedöms genom att mäta tillväxthastigheter och metabolitproduktion av de konfronterandearterna 14,15,16; denna metod löses dock endast till koloninivå. För att studera interaktioner på cellnivå kan bakterie- och svampinokulanter odlas på glasmikroskopglas belagda med agar som sedan avbildas under ett mikroskop17. Ändå kan det vara svårt att följa en enda hypha med hjälp av mikroskopglas på grund av brist på inneslutning, vilket innebär att tidsfördröjningsbilder är svårare att få. Vidare är möjligheten att rumsligt begränsa andra mikroorganismer inom definierade regioner i svampmyceliet eller skapa definierade kemiska miljöer som till exempel kan störas inte möjlig i sådana uppsättningar. Jordens "svarta låda" -natur ökar också komplexiteten i att studera svamp-mikrobiella interaktioner på nivån av enskilda celler18. Genom att observera interagerande arter bort från den otroliga mångfalden i jordmikrobiomet kan det exakta sättet på vilket enskilda medlemmar interagerar bedömas. Således finns det ett fortsatt behov av mångsidiga plattformar som möjliggör högupplöst, encellsavbildning av BFI och FFI.
Mikrofluidikteknik, så kallade lab-on-a-chip-system, ger en idealisk plattform för studier av BFI och FFI på nivån av enskilda celler. Området mikrofluidik, som härrör från teknik som utvecklats för kemisk analys och mikroelektronik, har antagits av de biologiska vetenskaperna19. Mikrofluidisk teknik reglerar små volymer vätskor inom ett skräddarsytt nätverk av miniatyriserade kanaler, som har minst en dimension på mikrometerskalan, och deras användning i biologisk forskning expanderar20. I synnerhet har mikrofluidiska anordningar utvecklats för att undersöka tillväxten av trådformiga svampar 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fördel med att använda denna teknik är att inneslutningen av hyfer och fördelningen av näringsämnen inom mikrokanaler mer liknar jordmiljöns struktur än konventionella agarmetoder31. Nyligen har mikrofluidiska plattformar använts för att undersöka interaktioner mellan humana neutrofiler och svamppatogener32, bakterier och växtrötter33, samt svampar och nematoder34,35.
En av de många fördelarna med att använda mikrofluidik för att studera mikrobiella interaktioner inkluderar den specifika kontrollen av mikrokanalmiljön. Till exempel kan laminära flödesregimer utnyttjas för att generera definierade koncentrationsgradienter, vilket är särskilt användbart vid undersökning av bakteriell kemotaxi36. En annan fördel är att den transparenta naturen hos poly(dimetylsiloxan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomer polymer som vanligtvis används vid tillverkning av mikrofluidiska anordningar, underlättar högupplöst avbildning av enskilda celler med användning av ljusfält och fluorescensmikroskopi37. På samma sätt innebär inneslutningen av mikrober i mikrokanaler att time-lapse-experiment som spårar enskilda celler kan utföras, vilket gör att individuella cellulära svar kan registreras och kvantifieras37. Slutligen, eftersom mikrofluidiska enheter kan utformas för att vara användarvänliga, kan de enkelt användas av icke-experter38.
Att öka kunskapen om samspelet mellan marklevande mikroorganismer är viktigt för att förbättra hållbara ekosystemförvaltningsmetoder som upprätthåller den biologiska mångfalden och för att mildra klimatförändringarnas inverkan på landmiljöer39. Således är utvecklingen av nya mikrofluidiska verktyg grundläggande för att utöka förståelsen för svampar och deras interaktioner på cellulär nivå. Protokollet här kommer att fokusera på två mikrofluidiska enheter som produceras för studier av BFI40 och FFI41 som representeras i figur 1.
Figur 1: Visuell och schematisk representation av enheterna för bakteriell-svampinteraktion (BFI) och svamp-svampinteraktion (FFI). En mycelplugg placeras vid ingången till ena änden av mikrokanalerna för att möjliggöra hyphaltillväxt i enheten. Bakterieinloppet är i motsatt ände. Skalstreck = 5 mm. (B) Schematisk översikt över BFI-enheten, som visar placeringen av bakterieinloppen och riktningen för hyphaltillväxt genom interaktionsmikrokanalerna. Kanalerna är 10 μm djupa, 100 μm breda och 7 mm långa, med totalt 28 observationskanaler. (C) Konfrontationsanalys på agarplatta mellan Coprinopsis cinerea och Bacillus subtilis NCIB 3610, skalstreck = 20 mm (vänster). Mikroskopibilder som visar interaktionen mellan C. cinerea och B. subtilis NCIB 3610 inom mikrokanalen (mitten och höger), dvs polär bindning av bakterier till svamphyfer. Skalstreck = 25 μm (mitten) och 10 μm (höger). (D) Bild av FFI-enheten bunden till en glasbottnad petriskål, dubbelinokulerad med mycelproppar. Skalstreck = 1 cm (E) Schematisk översikt över FFI-enheten. Två svampinokutpluggar införs i inloppen i vardera änden av enheten, vilket möjliggör hyphalutforskning av mikrokanalerna. Kontrollkanaler är endast anslutna till ett svampinlopp och har en återvändsgrändskanal, vilket förhindrar interaktioner mellan testsvamparna. Interaktionskanaler förbinder både svampinlopp och tillåter hyphalinteraktioner mellan försökspersonerna inom mikrokanalen. Varje interaktionskanal består av 18 diamantformade sektioner, som mäter en total längd på 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm djup och har ett anslutningsområde mellan varje diamant på 20 μm. Kanaltyper dupliceras, skalstänger = 1 mm. (F) Interaktionszon mellan två närmande hyphalfronter, som växer från motsatta ändar av den sammankopplade interaktionskanalen. Faskontrastmikroskopibild, skalstreck = 250 μm. Panelerna i denna figur har modifierats från Stanley et al., 2014 (A-C)40 och Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: En sammanfattning av de procedurer som beskrivs i detta protokoll visas visuellt i figur 2.
Figur 2: Schematisk representation av den presenterade metoden bestående av fem huvudavsnitt som beskrivs i detta protokoll. Enhetsdesign skapas med hjälp av CAD-programvara (Computer Aided Design) och en huvudform tillverkad med fotolitografi (1). Detta används för att gjuta poly (dimetylsiloxan) (PDMS), som sedan tärnas i plattor och binds till glasbottnade petriskålar för att bilda mikrofluidiska anordningar (2). Mikrober som ska ingå i studien odlas (3) och används för att inokulera enheterna (4). Interaktioner studeras med mikroskopi och kvantifieras med hjälp av bildanalystekniker (5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Behärska formtillverkning
- Produktion av fotomasker
- Generera mikrofluidiska enhetsdesigner med hjälp av CAD-programvara (Computer Aided Design). Måtten på de presenterade enheterna anges i figur 1 och mer information om de specifika designfunktionerna listas utförligt i respektive publikation40,41.
- Exportera CAD-designfilen med ett lämpligt format (t.ex. .dwg, .dxf). Skriv ut en filmfotolitografimask genom att skicka den exporterade CAD-designfilen till en kommersiell leverantör för utskrift.
- Photolithography
OBS: Följande steg bör utföras i en dammfri och ljuskontrollerad miljö, till exempel en laminär flödeshuv eller renrumsanläggning. De experimentella förhållanden som anges här ges som vägledning och bör optimeras internt. Författarna rekommenderar att man söker specifik utbildning och konsulterar etablerade protokoll42.- Förbered en 100 mm kiselskiva genom att baka i ugn vid 200 °C i 2 timmar. Spin-coat kiselskivan med SU-8 2010 fotoresist, med sikte på en måltjocklek på 10 μm, med följande villkor: 500 rpm i 10 s (acceleration 100 rpm/s) och 3 000 rpm i 45 s (acceleration 300 rpm/s).
VARNING: SU-8 fotoresist är farligt, var försiktig vid hantering och förhindra inandning och kontakt med huden. Det är brandfarligt, potentiellt cancerframkallande och giftigt för miljön. - Grädda den belagda kiselskivan vid 95 °C i 2,5 min (mjukbakning). Utsätt fotoresisten för ultraviolett (UV) ljus med hjälp av filmfotolitografimasken och en energidos på 140 mJ / cm2 vid 365 nm våglängd med hjälp av en maskjusterare.
- Grädda den belagda kiselskivan vid 95 °C i 3,5 minuter (baka efter exponering). Sänk ner och rör om kiselskivan i utvecklarlösningen i 3 minuter för att avslöja de mikrofabricerade strukturerna genom att ta bort den oexponerade fotoresisten.
VARNING: Utvecklarlösningen kan vara brandfarlig, vidta lämpliga försiktighetsåtgärder vid hantering och lagring. - Skölj med färsk utvecklarlösning i 10 s. Skölj med isopropylalkohol i 10 s och lufttorka. Använd filtrerad tryckluft för att säkerställa att strukturerna är ordentligt torra. Mät höjden på SU-8-strukturerna, till exempel med hjälp av en profilometer.
- Silanisera varje huvudform med 50 μL klortrimetylsilan genom att applicera ett vakuumtryck på 50 mbar i 2 timmar. Författarna noterar att återsilanisering av huvudformen inte befanns vara nödvändig.
VARNING: Klortrimetylmilan är ett farligt ämne. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) och hantera med försiktighet. Undvik kontakt med hud och ögon och förhindra inandning. Håll dig borta från antändningskällor och använd i ett väl ventilerat område.
- Förbered en 100 mm kiselskiva genom att baka i ugn vid 200 °C i 2 timmar. Spin-coat kiselskivan med SU-8 2010 fotoresist, med sikte på en måltjocklek på 10 μm, med följande villkor: 500 rpm i 10 s (acceleration 100 rpm/s) och 3 000 rpm i 45 s (acceleration 300 rpm/s).
2. Tillverkning av enheter
OBS: Följande steg bör utföras i en dammfri miljö, till exempel en laminär flödeshuv.
- Beredning av plattor av poly(dimetylsiloxan) (PDMS)
- Förbered cirka 40 g PDMS genom att noggrant blanda basen och härdningsmedlet i förhållandet 10:1 med en spatel i en ren plastkopp. Avgaser blandningen för att avlägsna alla luftbubblor genom att placera plastkoppen som innehåller PDMS i en vakuumkammare (vakuumtryck = 50 mbar) i 1 timme.
- Fäst huvudformen i ett plastfäste med klar tejp. Rengör med komprimerad filtrerad luft för att avlägsna dammpartiklar.
OBS: Alternativt kan aluminiumfolie formas runt en petriskål i glas och sedan användas för att hysa huvudformen och innehålla PDMS43. - Häll PDMS-blandningen på mitten av huvudformen, se till att den är på en plan yta och låt den sätta sig.
PDMS-blandningen ska hällas så nära ytan på huvudformen som möjligt och ett kontinuerligt flöde bibehållas för att minimera införandet av luftbubblor. Luftbubblor kan avlägsnas genom att rikta tryckluft över bubblan eller genom att skopa ut dem med en fin nål. - Täck huvudformen löst med ett plastlock för att förhindra att dammpartiklar sätter sig på PDMS yta. Överför huvudformen till en ugn och härda över natten vid 70 °C.
- Ta bort huvudformen från ugnen och låt svalna. Skala bort det härdade PDMS från huvudformen och plastramen, var noga med att undvika att skada huvudformen / PDMS.
- Placera klar tejp över mikrokanalerna präglade i PDMS för att bibehålla en dammfri yta. Se till att tejpen tas bort före limning.
- Skär PDMS i plattor (dvs. om flera enheter ingår i designen på huvudformen kan många tillverkas av en enda gjutning) som betecknas av designen med en monterad giljotin eller rakblad. När du skär sidoöppningen på BFI PDMS-plattan, se till att mikrokanalerna är helt öppna (figur 1A). För FFI PDMS-plattan, se till att varje hörn är trimmat så att det passar in i den glasbottnade petriskålen som visas i figur 1D.
- Stansa önskade inlopps-/utloppshål enligt enhetens design. Använd en precisionsskärare för att stansa inloppshål på 3,18 mm och 4,75 mm för de exemplariska BFI- respektive FFI-enheterna.
- Limning av PDMS-plattor för att skapa enheter
OBS: Följande tvättsteg (2.2.1-2.2.2) använd en ultraljudsrengörare fylld med renat vatten (ddH2O) vid 37 kHz. Tvättning av PDMS-plattorna hjälper till att förbättra framgångsriklimning 44 och minska risken för kontaminering. För att manipulera PDMS-plattorna, använd rena pincett och lyft med inloppshålen för att undvika skador på mikrokanalerna eller enhetens yta.- Sänk ner PDMS-plattorna i 0.5 M NaOH och sonikat i 5 minuter. Skölj med steril ddH2O. Överför PDMS-plattor till 70% etanollösning och ultraljudsbehandling i 5 minuter. Skölj med steril ddH20.
- Sänk ner PDMS-plattor i steril ddH2O och ultraljudsbehandling i 5 minuter. Ta bort PDMS-plattorna från den sterila ddH2O, torka med filtrerad tryckluft och placera i en steril fyrkantig petriskål.
- Placera den fyrkantiga petriskålen som innehåller PDMS-plattorna i en ugn vid 70 °C i 1 timme för att torka. Ta ut ur ugnen och låt svalna i en dammfri miljö. Rensa bort damm från PDMS-plattornas yta med tejp och/eller filtrerad tryckluft.
- Aktivera ytorna på PDMS-plattorna och de glasbottnade petriskålarna som ska bindas med en plasmarengörare med följande inställningar: vakuumtryck 0,75 mbar, effekt 50%, beläggningstid 1 min. Placera ytorna som ska aktiveras (och därefter bindas) uppåt i plasmarengöraren.
- Ta bort PDMS-plattorna och de glasbottnade petriskålarna från plasmarengöraren och bind genom att försiktigt placera de aktiverade ytorna i konform kontakt med varandra. Bind BFI- och FFI PDMS-plattorna till de 35 mm respektive 50 mm diameter glasbottnade petriskålarna (glastjocklek 0,17 mm).
OBS: Var försiktig så att du inte applicerar för mycket tryck vid bindning, eftersom detta kan leda till kollaps av mikrokanalerna. - Kontrollera om det lyckas med limning genom att helt enkelt försöka dra PDMS-plattan från den glasbottnade petriskålen med pincett. Visualisera enheterna med ögat eller med hjälp av generisk mikroskopi för att säkerställa att inokuleringsinloppen eller mikrokanalerna inte kollapsar.
OBS: För mättade förhållanden (dvs. vattenmättade och/eller näringsrika förhållanden), inkludera steg 2.2.7 i protokollet. Om vattenomättade förhållanden krävs, fortsätt till steg 2.2.8. Enheter kan fyllas med vatten eller media. - Fyll enheterna omedelbart efter bindning genom att pipettera 100 μL av den önskade lösningen för BFI-anordningen (bakteriell inlopp och sidoöppning) eller 30 μL media i varje inlopp (totalt 60 μL) för FFI-enheten. Om luftbubblor finns kommer dessa att försvinna cirka 10 minuter efter fyllning eftersom PDMS är poröst.
- Tillsätt steril ddH2O(~ 100-200 μL) i petriskålen för att bibehålla fuktigheten.
3. Mikrobiell kultur
OBS: Följande steg ger ett allmänt mikrobiologiskt förfarande för svamp- och bakteriekultur och bör utföras under sterila förhållanden (dvs. med hjälp av en flamma eller ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp) som är lämpligt för den inneslutningsnivå som krävs för de önskade mikroberna. Specifika exempel ges i slutet av varje avsnitt för en art av intresse.
- Svamp kultur
- Förbered önskat odlingsmedium kompletterat med agar. Autoklavera mediet vid 121 °C i 15 minuter. Låt mediet svalna till 50 °C och häll i petriskålar med en diameter på 9 cm och bibehålla sterila förhållanden.
- Använd en korkborr för att ta bort en 4 mm diameter plugg av agar som innehåller mycelium från en kylskåpskoloni med önskad svampstam för att aktivera isolatet. Detta utförs för att säkerställa standardiserad och kraftig tillväxt av svampen före anordningsinokulering.
OBS: Mikroberna kan också aktiveras från ett glycerolbestånd, dvs svampisolat lagrade på agarpluggar i 50% glycerollösning vid -70 °C41. - Placera pluggens sida med mycel i kontakt med agarytan i mitten av den oinokulerade petriskålen. Sätt tillbaka locket ovanpå petriskålen och försegla innan du ruvar vid lämplig temperatur för önskad stam under önskad tid, vanligtvis cirka 3 till 4 dagar.
OBS: Exempel på odlingsförhållanden för Trichoderma rossicum: Maltextraktagar, inkuberad vid 25 °C i mörker i 48 timmar.
- Bakteriell kultur
- Stryk ut det önskade bakterieisolatet från källbeståndet (t.ex. glycerolbestånd eller enstaka koloni från agarplattan) på en agarplatta för att uppnå enstaka bakteriekolonier och säkerställa ingen kontaminering45. Försegla plattan med film.
- Inkubera vid en temperatur och varaktighet som är specifik för isolatet av intresse tills enskilda kolonier observeras.
- Förbered önskad kulturbuljong. Tillsätt till exempel 10 g trypton, 10 g NaCl och 5 g jästextrakt per 1 liter ddH2 O för att bereda LB-medium för odlingav B. subtilis. Autoklavera mediet vid 121 °C i 15 minuter.
- Låt mediet svalna till rumstemperatur. Tillsätt mediet till en steril odlingskolv i en steril miljö.
- Rör vid en enda bakteriekoloni från agarplattan med en steril ympningsslinga. Överför den inokulerade slingan till det sterila odlingsmediet genom att kort vidröra vätskan med slingan.
- Försegla kolven med ett sterilt lock eller folie och placera inuti en skakinkubator över natten med de inställningar som är lämpliga för den valda arten.
OBS: Exempel på odlingsförhållanden för B. subtilis: i) flytande odling - aerob tillväxt vid 37 °C vid 200 rpm i LB-medium och ii) plattkultur - rumstemperatur på LB-agarplatta. Se FFI/BFI-papper40,41 för mer information om odling av olika svampstammar.
4. Enhetens ympning
OBS: Följande steg bör ske inuti en laminär flödeshuv med steril utrustning.
- Svamp ympning
- Använd en steriliserad korkborrare (ø = 4 mm) för att ta bort en agarplugg från kolonin i periferin av en 3 dagar gammal kultur (steg 3.1). Se till att den växande hyphalfronten förblir intakt.
- Introducera pluggen i svampinloppet, mycelsidan nedåt, med hyphalffrontens tillväxtriktning orienterad mot mikrokanalöppningarna för att uppmuntra hyphalinfiltration av kanalerna.
- Upprepa steg 4.1.1-4.1.2 för den andra svamparten (om du använder FFI-enheten) och inför kontakten i motsatt inlopp. Om du använder BFI-enheten utelämnar du det här steget och fortsätter till steg 4.1.4.
- Förslut petriskålen med transparent film och inkubera vid 25–28 °C i mörker tills avbildning påbörjas. Bestäm inkubationstiden före avbildning beroende på den avsedda biologiska händelsen som ska observeras, t.ex. svamp-svampkonfrontationer och tillväxthastigheten för inkluderade arter i enheten.
- Bakteriell ympning
- Späd bakterierna från en kultur över natten (steg 3.2) i förhållandet 1:25 med samma odlingsmedium som beskrivs i steg 3.2.3. Kultur i 3 timmar vid 37 °C.
- Tvätta bakterierna genom pelleteringskultur med en centrifug vid 2000 x g i 10 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i önskad volym av 0,9% w / v natriumkloridlösning.
- Centrifugera igen för att få en pellet. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i flytande medium (t.ex . C. cinerea minimalt medium till en OD600 av 1). Optimera OD600-värdet för bakteriestammen i fråga.
- Ta bort BFI-enheten från inkubatorn och öppna den i en steril miljö. Pipettera 10 μl suspension i bakterieinloppet.
OBS: Optimera de exakta inokuleringstiderna för bakterie-svampinteraktionerna i fråga. Till exempel införa bakterier i BFI-enheten 18 h efter svampinokulering om du använder C. cinerea. - Förslut petriskålen med en genomskinlig film och inkubera vid 25 °C i mörker tills avbildning påbörjas. Förvara enheten upprätt.
5. Mikroskopi och bildanalys
- Mikroskopi
OBS: Forskaren bör välja lämplig metod för avbildning som överensstämmer med arten av experimentet som ska utföras, till exempel en inverterad bredfältsepefluorescens eller konfokalmikroskopi. En allmän översikt har tillhandahållits här, eftersom specifika detaljer beror på attributen för den valda mikroskopiuppsättningen.- Slå på mikroskopdatorn, mikroskopets huvudkropp (om tillämpligt), kameran, temperaturkontrollerad inkubator och ljuskälla (er). Se till att mikroskopet har ställts in korrekt, t.ex. köhlerbelysning har applicerats korrekt för jämn belysning av provet. Starta bildprogramvarupaketet.
OBS: När du använder en temperaturkontrollerad inkubator är det viktigt att låta mikroskoptemperaturen balansera i flera timmar innan du startar ett experiment. - Montera den mikrofluidiska enheten i sceninsatsen. Se till att enheten är väl säkrad, dvs. med tejp, för att förhindra att enheten lossnar under aktiv scenrörelse.
- Skaffa bilder av de inokulerade enheterna, t.ex. antingen enpunkts- eller tidsfördröjningsexperiment. Omfattande bildspecifikationer som är relevanta för de experiment som utförts med BFI- och FFI-enheterna finns i respektive ovannämnda publikationer40,41.
OBS: Brightfield-bilder förvärvades genom att använda faskontrastmikroskopi för att visualisera hyphalproliferation genom tillväxtkanalerna med hjälp av autofokusprogramvara och antingen 10x förstoring, 0,30 NA (numerisk bländare) eller 20x förstoring, 0,45 NA-objektivlinser. Excitation av fluorescerande reporterproteiner uppnåddes med hjälp av en högeffektiv ljusemitterande diodljusmotor med våglängder specifika för fluoroforen. - Exportera bilder till ett lämpligt format för efterföljande bildbehandling. Till exempel .tiff.
- Slå på mikroskopdatorn, mikroskopets huvudkropp (om tillämpligt), kameran, temperaturkontrollerad inkubator och ljuskälla (er). Se till att mikroskopet har ställts in korrekt, t.ex. köhlerbelysning har applicerats korrekt för jämn belysning av provet. Starta bildprogramvarupaketet.
- Bildanalys
OBS: Författarna rekommenderar Fiji46 som ett verktyg för bildanalys, men andra programvarupaket finns tillgängliga. Följande är exempel på bildanalyser utförda med Fiji från de presenterade BFI- och FFI-enhetspublikationerna. Dessa steg är specifika för en Mac och kan skilja sig något om du använder en PC.- Hyphal tillväxthastighetsmätningar
OBS: Denna metod användes i BFI-manuskriptet40 för att mäta tillväxthastigheterna för enskilda hyfer.- Ladda ner, installera och starta Fiji. Importera bildsekvensen från ett time-lapse-experiment genom att välja Arkiv > Importera > Bildsekvens. Leta reda på mappen där data lagras och välj Öppna. I fönstret Sekvensalternativ väljer du Inställningar och sedan OK.
- Välj ikonen Rak linje från huvudverktygsfältet. Placera början av den raka linjen vid spetsen av den växande hyphalspetsen genom att klicka och sedan samtidigt dra markören till en annan punkt i fönstret. En gul linje visas med tre rutor som anger början, mittpunkten och slutet av raden.
- Flytta till nästa bildruta i bildsekvensen genom att trycka och hålla ned Ctrl och >. Placera änden av den raka linjen vid spetsen av den växande hypha genom att markera och dra den fyrkantiga rutan till rätt position.
- Håll Ctrl och M intryckta för att mäta linjens längd i pixlar. Ett resultatfönster visas med mätdata. Definiera data som visas i resultatfönstret enligt följande: klicka på fönstret Resultat och välj sedan Resultat > Ange mått.
- Flytta till nästa bildruta i bildsekvensen genom att hålla ned Ctrl och sedan >. Placera början av den raka linjen vid spetsen av den växande hypha genom att markera och dra den fyrkantiga rutan till rätt position.
- Håll Ctrl intryckt och sedan M för att mäta linjens längd i pixlar. Ett resultatfönster visas med mätdata.
- Upprepa steg 5.2.1.5-5.2.1.6 tills mätningen av hyphas tillväxt i pixlar är klar.
- Markera alla data i fönstret Resultat . Kopiera och klistra in i ett annat program, t.ex. ett kalkylblad, för att bearbeta data. Plotta hyphaltillväxten (i pixlar eller mikrometer) som en funktion av tiden och beräkna de genomsnittliga tillväxthastigheterna. Utför minst tre biologiska replikat per experiment.
- Mätningar av fluorescensintensitet
OBS: Denna metod användes i FFI-publikationen41 för att bedöma förändringen i fluorescensintensitet i hyfer av Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP vid kontakt med Clonostachys rosea 016 som en funktion av tiden.- Ladda ner, installera och starta Fiji. Importera bildsekvens från ett time-lapse-experiment genom att välja Arkiv > Importera > Bildsekvens. Leta reda på mappen där data lagras och välj Öppna. I fönstret Sekvensalternativ väljer du Inställningar och sedan OK.
- Ange ett område av intresse (ROI) för att mäta den absoluta fluorescensintensiteten för en hypha med hjälp av det rektangulära verktyget, som finns i huvudverktygsfältet. Kvadratens storlek kan definieras exakt enligt följande: Redigera > Markering > Ange; ROI kan också sparas för framtida referens i ROI Manager genom att välja Redigera > Urval > Lägg till i Manager.
- Mät den absoluta fluorescensintensiteten (medelgrått värde) inom den definierade avkastningen för varje bild i hela bildsekvensen eller stapeln enligt följande: Bild > stackar > måttstapel. Fönstret Resultat öppnas automatiskt när alla bilder i stapeln har bearbetats.
OBS: Data som visas i resultatfönstret kan definieras enligt följande: klicka på resultatfönstret och välj sedan Resultat > Ställ in mätningar. Kontrollera att Medelgrått värde har valts. - Markera alla data i fönstret Resultat . Kopiera och klistra in i ett annat program, t.ex. ett kalkylblad, för att plotta de absoluta fluorescensintensiteterna för den angivna avkastningen som en funktion av tiden.
- Upprepa steg 5.2.2.2-5.2.2.4 för att samla in absoluta mätningar av fluorescensintensitet för varje ROI, dvs. på hypha av intresse, bredvid hypha av intresse eller inom motsvarande kontrollkanal.
- Beräkna lämpliga relativa fluorescensintensiteter i godtyckliga enheter (AU), t.ex. genom att dividera roi:s absoluta fluorescensintensitet [hypha of interest] med roi:s [kontrollkanals absoluta fluorescensintensitet]. Se FFI:s publikation 41 för mer specifik information.
- Utför minst tre biologiska replikat per experiment och plotta de relativa fluorescensintensiteterna som en funktion av tiden.
- Hyphal tillväxthastighetsmätningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat presenteras från exemplen BFI40 och FFI41-enheter. Hyphal-tillväxthastighetsmätningar kan enkelt erhållas med hjälp av dessa enheter i kombination med grundläggande mikroskopitekniker. Figur 3A-B illustrerar bakterie-svampinteraktioner mellan C. cinerea hyphae och B. subtilis NCIB 3610. Närvaron av B. subtilis stoppar tillväxten av C. cinerea efter ca 5 h efter samtidig ympning (figur 3B). Pilar indikerar den samtidiga morfologiska observationen av tunnare och mer transparenta hyfer (figur 3A). Det noterades också att opåverkade hyphaloceller fortsatte att sprida sig. Figur 3C-D visar den starka hämmande effekten av F. graminearum PH1-dsRed på T. rossicum NEU135 efter hyphalinteraktion, vilket resulterar i ett fullständigt stopp av T. rossicum hyphal tillväxt.
Figur 3: Exempel på tillväxthastighetskvantifiering och observation från BFI- och FFI-enheterna. Pilar markerar en tunn hyphalmorfologi, som inträffade efter interaktion med B. subtilis NCIB 3610. Skalstång = 25 μm. (B) Hyphal-tillväxthastighet för ledande hyphalspetsar uppmätta över 10 timmar efter samtidig ympning. Staplar representerar standardavvikelser från tre biologiska replikat. (C) Boxplot (n = 6) som visar den relativa tillväxthastigheten för Fusarium graminearum PH1-dsRed jämfört med Trichoderma rossicum. Signifikans betecknas med ** och representerar p < 0,01, beräknat med Mann-Witney U-test. Staplar representerar största eller minsta observation som är lika med övre respektive nedre percentilen (± 1,5 x interkvartilintervall). (D) F. graminearum PH1-dsRed (växer från vänster till höger) vs T. rossicum NEU135 (växer från höger till vänster) vid 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar efter samtidig ympning. Brightfield och fluorescenskanaler överlagrade. Skalstreck = 200 μm. Panelerna i denna figur har modifierats från Stanley et al., 2014 (A-B)40 och Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De morfologiska förändringarna som induceras av interaktionshändelser kan observeras på cellnivå med hjälp av de metoder som beskrivs i detta dokument. Figur 4 ger exempel på morfologiska observationer för de presenterade BFI- och FFI-enheterna. Figur 4A visar förlusten av polariteten hos Verticillium longisporum hyphal tillväxt vid möte med bakterierna Pseudomonas synxantha (P_phen) eller P. fluorescens (P_rhizo), jämfört med enbart bekämpningssvamparna (V1)47. Svamp-bakteriella interaktioner resulterade i hyfernas lockiga utseende. Detta tillskrevs signifikanta bakteriellt inducerade transkriptomiska förändringar i svamparna och förmodat undvikande beteende. Dessa resultat är signifikanta eftersom V. longisporum är en växtpatogen, vilket betyder Pseudomonas sp. har potential att användas som biologisk bekämpning i detta fall47.
Figur 4B visar ett time-lapse-experiment där den dynamiska förlusten av hyphalcellulärt innehåll kan observeras och bilda blebs som behåller det röda fluorescerande proteinet dTomato. Denna blebbande morfologi inträffade efter samtidig ympning med B. subtilis, men observerades endast i vissa apikala celler. Hyphaes kollaps och efterföljande blebbingfenomen var emellertid inte korrelerade med bakteriell fastsättning. Detta föreslog att det fanns potentiell fungicid bakteriell aktivitet som inte var anknytningsberoende, hypotesen att bero på utsöndringen av lipopeptider. Högupplösta dynamiska avbildningstekniker har också avslöjat en förmodad försvarsmekanism för F. graminearum, som uppvisar ökad septabildning när den motverkas av C. rosea, vilket indikeras av pilarna i figur 4C.
Figur 4: Exempel på förändringar i morfologi som observerats under interaktionshändelser i BFI- och FFI-enheterna. Denna morfologi inträffade som svar på en fluorescerande Pseudomonas spp. med gener som kodar för fenazinsyntes (P_phen; P. synxantha) och en bakterie isolerad från rapsens rhizosfär (P_rhizo; P. fluorescens). Skalstänger = 20 μm. (B) dTomato-uttryckande Coprinopsis cinerea40 saminokulerade med Bacillus subtilis avbildad 5 h efter samtidig ympning. Cellerna var intakta (vänster) vid 5 h, men en hypha kollapsade 30 min senare (förlust av fluorescens) och blebs innehållande (fluorescerande) cellulärt material observerades. Skalstreck = 25 μm. (C) Pilar markerar septabildning i Fusarium graminearum hyfer observerade efter interaktion med Clonostachys rosea hyfer. Skalstreck = 10 μm, tidsstämpel = h efter samtidig ympning. Panelerna i denna figur har modifierats från Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 och Gimeno et al., 2021 (C)41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De presenterade anordningarna är också lämpliga för att observera dynamiska fysiologiska förändringar. Med hjälp av BFI-enheten visades att koncentrationen av hyphae-associerade bakterier förändrades över tiden och minskade efter en lokal ackumulering av celler (figur 5A). Bakteriell mobilisering längs mikrokanaler observerades också förekomma i klusterliknande sammansättningar. I FFI-anordningen tillät fluorescensmärkning kvantifieringen av C. rosea hyphal-spridning när den konfronterades med F. graminearum för att karakterisera dynamiken i den antagonistiska interaktionen (figur 5B). Dessa mätningar gjordes under en period av 20 timmar och visar potentialen hos dessa enheter för att genomföra långsiktiga tidsfördröjningsexperiment.
Figur 5: Exempel på dynamiska fysiologiska karakteriseringsmätningar för både BFI- och FFI-enheterna. Skalstreck = 50 μm. (B) Brightfield- och fluorescenskanalbilder visar kvantifiering av grönt fluorescerande protein (GFP) detekterat med hjälp av FFI-enheten under interaktionen mellan fluorescerande märkta Clonostachys rosea och Fusarium graminearum49. Skalstreck = 50 μm. Diagram (höger) visar relativ fluorescens i godtyckliga enheter (AU) över 20 timmar, n = 6 och felstaplar indikerar standardfelet. Orange och grå diagram illustrerar fluorescensintensiteterna för (i) GFP som detekterats i C. rosea hyphal-nätverket respektive (ii) interaktionskanalen jämfört med den C. rosea-innehållande kontrollkanalen. Det svarta kontrolldiagrammet visar fluorescensintensiteten hos hyfer i C. rosea-kontrollkanalen jämfört med kontrollkanalen. Panelerna i denna figur har modifierats från Stanley et al., 2014 (A)40 och Gimeno et al., 2021 (B)41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel presenterar ett protokoll för studier av svamp-mikrobiella interaktioner med hjälp av kanalmikrofluidik. Författarna strävar efter att visa mångsidigheten hos dessa enheter och uppmuntra anpassning för att passa forskarens intressen. Med hjälp av de exemplifierande BFI- och FFI-enheterna kan svamp-mikrobiella interaktioner studeras mer detaljerat än tidigare tillgängligt. Genom att ta bort jordens bakgrundskomplexitet och heterogenitet, moderera tillväxten av hyfer så att de är begränsade till ett enda monolager och tätt reglera miljöparametrar är det möjligt att fånga högupplösta bilder av dessa biologiska händelser över tiden. Med hjälp av dessa enheter har interaktionerna mellan mikrobiella partners karakteriserats med hjälp av tillväxthastighet, fluorescenskvantifiering och observationell bioavbildning av morfologiska egenskaper.
Enheter kan utformas för att möjliggöra karakterisering av svamp-mikrobiella interaktioner på cellulär nivå. Mångsidigheten och den enkla designen för icke-specialister gör detta protokoll lämpligt för anpassning till en bred bredd av forskningsfrågor. BFI- och FFI-enheterna är lämpliga för användning med en mängd olika mikroskop för att passa det experimentella målet på grund av deras transparenta natur och glasbundna yta. Anordningarna kan skräddarsys med avseende på både deras konfiguration och fysikalisk-kemiska parametrar. till exempel kan luftfuktighet, temperatur eller kanalmättnad förändra miljöupplevelsen för testpersonen. Sedan kan enheten utformas så att den fysiskt kan styra tillväxten eller framkalla ett visst beteende, såsom interaktionshändelser eller navigeringsstrategier, som styrs av kanalstruktur och storlek eller inkludering av hinder. Detta är inte möjligt med nuvarande metoder, såsom agarplattanalyser31.
Hittills har mikrofluidiska anordningar också använts för att utforska svamp-50 och svamp-nematod35-interaktioner . Användningen av kanalmikrofluidik möjliggör också kontroll och utbyte av vätskor i enheten. Denna viktiga och fördelaktiga egenskap var avgörande för studien av mycelial fagresention50. Dessutom gav användningen av mikrofluidisk teknik för transkriptomikstudier en större upplösning av differentiellt uttryckta gener jämfört med en liknande agarbaserad analys. Metoderna var samtidiga i 24 av de 28 differentiellt uttryckta generna som identifierades av samma agarplattexperiment, med de mikrofluidiska enheterna som identifierade många ytterligare gener och rapporterade ett högre relativt uttryck i jämförelse35.
De kritiska stegen i protokollet börjar med den ursprungliga enhetsdesignen. För att uppnå en lämplig design måste uppmärksamhet ägnas åt livsstilen och tillväxt/ rörlighetsstrategin för de mikrober som är av intresse. Till exempel inklusive tillräckligt kanaldjup eller längd för att tillgodose de fysiologiska kraven och tillväxthastigheten hos mikroorganismen av intresse. Mikrokanalernas strukturella egenskaper och komponenter kan utformas för att inducera eller manipulera specifika beteenden, såsom öppningar för interaktionszoner eller hinder för att observera navigationsstrategier. Dessutom måste den experimentella forskningsfrågan kunna adresseras med enhetsdesignen. Tänk till exempel på: (i) hur laminära flödesprofiler kan utnyttjas, (ii) anpassning och varierande mikrokanalshöjder för organismen som ska undersökas, och (iii) förminskning av mikrokanalingångar för att förhindra överspridning av hyfer i enheten. Författarna föreslår dessa ytterligare resurser för mikrofluidisk enhetsdesign 51,52,53. Det är också viktigt att hålla enheterna fria från damm under tillverkningen. Därför bör man se till att upprätthålla en dammfri miljö under alla stadier av tillverkningsprocessen, samt genom att använda tejp och filtrerad tryckluft och hålla PDMS-ytorna täckta när de inte används. Andra kritiska steg i protokollet inkluderar att minimera risken för kontaminering genom att tvätta enheterna i 70% etanollösning och säkerställa tillräcklig bindning mellan glasytan och PDMS-plattan genom att försiktigt placera de aktiverade ytorna i kontakt med varandra och inte applicera för mycket tryck på mikrokanalerna. Kontrollera om det finns tillfredsställande vidhäftning genom att försöka förskjuta PDMS-plattan från glaset före inokulering. En begränsning med dessa enheter är att de inte kan återanvändas mellan experiment.
Införandet av jordmikrober i skräddarsydda mikrofluidiska enheter börjar en spännande ny era för forskning om mikrobiella interaktioner. Potentiella framtida tillämpningar av den presenterade metoden är omfattande, såsom upptäckten av nya biologiska bekämpningsarter eller antimikrobiella föreningar, eller karakteriseringen av den så kallade svampvägen för bakteriell mobilisering. BFI- och FFI-enheterna ger en plattform för att visualisera dynamiska morfologiska och fysiologiska förändringar som inträffar före och efter interaktion på cellnivå. Nya enheter är enkla att designa och skapa, vilket helt enkelt kräver uppfinningsrikedom, för att passa den experimentella forskningsfrågan. Deras mångsidighet och användarvänlighet innebär att denna metod kan användas av icke-experter för att främja jordmikrobiomforskning på cellnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi erkänner ekonomiskt stöd från Institutionen för bioteknik vid Imperial College London och The Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
References
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
- Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
- Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
- Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33 (2021).
- Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
- Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
- Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
- Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
- Tang, H. -Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
- Bai, Y. -B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
- Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
- Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
- Válková, H., Novotný, Č, Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
- Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), Basel, Switzerland. 572 (2020).
- Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
- Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
- Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
- Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
- Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
- Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
- Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
- Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
- Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163 (2019).
- Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
- Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535 (2020).
- Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
- Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
- Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154 (2017).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
- Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243 (2019).
- Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
- Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
- Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074 (2020).
- Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
- Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
- Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262 (2021).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010 (2018).
- Choi, C. -H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468 (2021).
- Boenisch, M. J. Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , Staats-und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky. (2013).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
- Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
