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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63917
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London

Summary

Devido à opacidade do solo, as interações entre seus micróbios constituintes não podem ser facilmente visualizadas com resolução celular. Aqui, são apresentadas duas ferramentas microfluidas, que oferecem novas oportunidades para investigar interações fúngicas-microbianas. Os dispositivos são versáteis e simples de usar, permitindo alto controle espesso e imagens de alta resolução no nível celular.

Abstract

Os fungos filamentosos são habitantes bem sucedidos do solo e desempenham um papel importante nos ecossistemas do solo, como na decomposição da matéria orgânica e inorgânica, bem como na regulação dos níveis de nutrientes. Lá eles também encontram inúmeras oportunidades de interagir com uma variedade de outros micróbios, como bactérias ou outros fungos. Estudar interações fúngicas no nível celular, no entanto, pode ser desafiador devido à natureza do solo semelhante à caixa preta. Novas ferramentas microfluídicas estão sendo desenvolvidas para o estudo das interações fúngicas; duas plataformas projetadas para estudar interações bacteriana-fúngicas e fúngicas são destacadas. Dentro desses microcanais, as interações fúngicos-microbianas podem ser monitoradas em ambientes físico-químicos controlados em maior resolução temporal e espacial do que antes possível. A aplicação dessas ferramentas tem rendido inúmeros novos insights biológicos, como a observação do apego polar bacteriano à hifa ou a revelação de antagonismos fúngicos-fúngicos não característicos. Uma característica fundamental dessas metodologias considera a facilidade de uso desta ferramenta por não especialistas, produzindo tecnologias altamente traduzíveis para uso em laboratórios de microbiologia.

Introduction

O solo é um ambiente excepcionalmente diverso que contém uma abundância de microrganismos que são instrumentais para os ciclos de carbono e fósforo 1,2. Os fungos filamentosos são um componente importante de inúmeros ecossistemas como decomposição de matéria orgânica e inorgânica e podem melhorar a nutrição das plantas através da formação de relações simbióticas 3,4. Dentro do solo, os fungos interagem dinamicamente com uma infinidade de micróbios como outros fungos5, bactérias6, vírus7 e nematoides8. Essas interações têm consequências significativas para a saúde do solo e das plantas. No entanto, devido à falta de sistemas experimentais apropriados capazes de imagens interagindo microrganismos com alta resolução, muitos permanecem indefinidos.

Investigações relativas às interações bacteriana-fúngica (BFIs) e interações fúngicas (FFIs) têm aplicações valiosas em uma variedade de campos, incluindo antimicrobianos na medicina e agentes de controle biológico na agricultura. Por exemplo, o fungo Coprinopsis cinerea produz o peptídeo copsin, que tem sido mostrado para exibir atividade antibacteriana contra o patógeno humano Listeria monocytogenes9. Da mesma forma, o composto derivado de fungos, griseofulvin, é amplamente utilizado como tratamento para infecções fúngicas humanas e é adicionalmente capaz de inibir o crescimento do fungo patogênico da planta Alternaria solani10,11. Várias cepas da bactéria bacillus subtilis também foram demonstradas como agentes de biocontrole eficazes do patógeno fúngico da planta Rizoctonia solani12,13. No entanto, devido às limitações associadas às metodologias tradicionais, os BFIs e os FFIs são mal compreendidos ao nível de células únicas.

Estudos convencionais normalmente exploram BFIs e FFIs na macroescala usando placas de ágar com duas ou mais espécies em confronto. Sua interação é avaliada pela medição das taxas de crescimento e produção metabólica das espécies confrontantes 14,15,16; no entanto, essa metodologia só é resolvida ao nível da colônia. Para estudar interações no nível celular, inoculantes bacterianos e fúngicos podem ser cultivados em lâminas de microscópio de vidro revestidas com ágar que são então imagens sob um microscópio17. No entanto, pode ser difícil seguir uma única higifia usando slides de microscópio devido à falta de confinamento, o que significa que imagens com lapso de tempo são mais difíceis de obter. Além disso, a oportunidade de confinar espacialmente outros microrganismos dentro de regiões definidas do micélio fúngico ou criar ambientes químicos definidos que podem ser perturbados, por exemplo, não é possível nessas configurações. A natureza "caixa preta" do solo também aumenta a complexidade de estudar interações fúngicos-microbianas ao nível de células únicas18. Observando espécies interagindo longe da incrível diversidade do microbioma do solo, a maneira exata pela qual os membros interagem pode ser avaliada. Assim, há uma necessidade contínua de plataformas versáteis que permitem imagens unicelulares de alta resolução de BFIs e FFIs.

As tecnologias microfluídicas, os chamados sistemas lab-on-a-chip, fornecem uma plataforma ideal para o estudo de BFIs e FFIs ao nível de células únicas. O campo dos microfluidos, originários de tecnologias desenvolvidas para análise química e microeletrônica, tem sido adotado pelas ciências biológicas19. As tecnologias microfluidas regulam pequenos volumes de fluidos dentro de uma rede sob medida de canais miniaturizados, tendo pelo menos uma dimensão na escala de micromítre, e seu uso em pesquisas biológicas está expandindo20. Em particular, foram desenvolvidos dispositivos microfluidos para examinar o crescimento de fungos filamentosos 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Um benefício do uso dessa tecnologia é que o confinamento da hifa e a distribuição de nutrientes dentro dos microcanais se assemelham mais à estrutura do ambiente do solo do que os métodos convencionais de ágar31. Recentemente, plataformas microfluidas têm sido usadas para investigar interações entre neutrófilos humanos e patógenos fúngicos32, bactérias e raízes vegetais33, além de fungos e nematoides34,35.

Uma das muitas vantagens do uso de microfluidos para o estudo de interações microbianas inclui o controle específico do ambiente microcanal. Por exemplo, regimes de fluxo laminar podem ser explorados para gerar gradientes de concentração definidos, o que é especialmente útil ao examinar a quimiotaxis bacteriana36. Outra vantagem é que a natureza transparente do poli(dimetilsiloxano) (PDMS), um polímero elastomérico barato e biocompatível comumente utilizado na fabricação de dispositivos microfluidos, facilita a imagem de alta resolução de células únicas usando microscopia de campo brilhante e fluorescência37. Da mesma forma, o confinamento de micróbios dentro de microcanais significa que experimentos de lapso de tempo que rastreiam células únicas podem ser realizados, permitindo que respostas celulares individuais sejam registradas e quantificadas37. Por fim, como os dispositivos microfluidos podem ser projetados para serem fáceis de usar, eles podem ser facilmente empregados por não-especialistas38.

O aprofundamento do conhecimento das interações entre microrganismos que habitam o solo é importante para melhorar as práticas sustentáveis de manejo do ecossistema que mantêm a biodiversidade e mitigar o impacto das mudanças climáticas nos ambientes terrestres39. Assim, o desenvolvimento de novas ferramentas microfluídicas é fundamental para ampliar a compreensão dos fungos e suas interações no nível celular. O protocolo aqui se concentrará em dois dispositivos microfluidos produzidos para o estudo das BFIs40 e FFIs41, representadas na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Representação visual e esquemática dos dispositivos de interação bacteriana-fúngica (BFI) e interação fúngico (FFI). Um plugue mycelial é colocado na entrada de uma extremidade dos microcanais para permitir o crescimento de hifas no dispositivo. A entrada bacteriana está na extremidade oposta. Barra de escala = 5 mm. (B) Visão geral esquemática do dispositivo BFI, representando o posicionamento das entradas bacterianas e a direção do crescimento hifál através dos microcanais de interação. Os canais têm 10 μm de profundidade, 100 μm de largura e 7 mm de comprimento, com 28 canais de observação no total. (C) Ensaio de confronto na placa de ágar entre Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610, barra de escala = 20 mm (esquerda). Imagens de microscopia mostrando a interação entre C. cinerea e B. subtilis NCIB 3610 dentro do microcanal (médio e direito), ou seja, fixação polar de bactérias à hifa fúngica. Barra de escala = 25 μm (médio) e 10 μm (direita). (D) Imagem do dispositivo FFI ligado a uma placa de Petri com fundo de vidro, duplamente inoculada com plugues miceliais. Barra de escala = 1 cm. (E) Visão geral esquemática do dispositivo FFI. Dois plugues inoculantes fúngicos são introduzidos nas entradas em cada extremidade do dispositivo, permitindo a exploração higfálica dos microcanais. Os canais de controle são conectados apenas a uma entrada fúngica e têm um canal sem saída, impedindo interações entre os fungos de teste. Os canais de interação conectam ambas as entradas fúngicas e permitem interações hifais entre os sujeitos do teste dentro do microcanal. Cada canal de interação consiste em 18 seções em forma de diamante, medindo um comprimento total de 8,8 mm (490 x 430 μm por diamante), 10 μm de profundidade e tendo uma região de conexão entre cada diamante de 20 μm. Os tipos de canal são duplicados, barras de escala = 1 mm. (F) Zona de interação entre duas frentes hifais que se aproximam, crescendo a partir de extremidades opostas do canal de interação interconectada. Imagem de microscopia de contraste de fase, barra de escala = 250 μm. Os painéis desta figura foram modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 e Gimeno et al., 2021 (D-F)41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

NOTA: Um resumo dos procedimentos descritos neste protocolo são visualmente retratados na Figura 2.

Figure 2
Figura 2: Representação esquemática da metodologia apresentada consistindo de cinco seções principais detalhadas neste protocolo. Os projetos dos dispositivos são criados usando o software CAD (Computer Aided Design, design auxiliado por computador) e um molde mestre fabricado usando fotolitografia (1). Este é usado para lançar poli (dimetilsiloxano) (PDMS), que é então cortado em lajes e ligado a placas de Petri com fundo de vidro para formar os dispositivos microfluidos (2). Os micróbios a serem incluídos no estudo são cultivados (3) e usados para vacinar os dispositivos (4). As interações são estudadas por meio de microscopia e quantificadas por meio de técnicas de análise de imagem (5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Fabricação de moldes mestres

  1. Produção de máscaras fotográficas
    1. Gere designs de dispositivos microfluidos usando o software CAD (Computer Aided Design, design auxiliado por computador). As dimensões dos dispositivos apresentados são dadas na Figura 1 e mais detalhes sobre os recursos específicos de design estão amplamente listados nas respectivas publicações40,41.
    2. Exporte o arquivo de design CAD usando um formato apropriado (por exemplo, .dwg, .dxf). Imprima uma máscara de fotolitografia de filme enviando o arquivo de design CAD exportado para um provedor comercial para impressão.
  2. Fotolitografia
    NOTA: As seguintes etapas devem ser conduzidas dentro de um ambiente livre de poeira e controlado pela luz, como um capô de fluxo laminar ou uma instalação de sala limpa. As condições experimentais aqui fornecidas são dadas como guia e devem ser otimizadas internamente. Os autores recomendam buscar treinamentos específicos e consultoria de protocolosestabelecidos 42.
    1. Prepare um wafer de silício de 100 mm assando em um forno a 200 °C por 2 h. Gire o wafer de silício com fotoresist SU-8 2010, visando uma espessura alvo de 10 μm, utilizando as seguintes condições: 500 rpm para 10 s (aceleração 100 rpm/s) e 3.000 rpm para 45 s (aceleração de 300 rpm/s).
      ATENÇÃO: O fotoresist SU-8 é perigoso, tome cuidado ao manusear e evite a inalação e o contato com a pele. É inflamável, potencialmente cancerígeno e tóxico para o meio ambiente.
    2. Asse o wafer de silício revestido a 95 °C por 2,5 min (assado macio). Exponha o fotoresistista à luz ultravioleta (UV), usando a máscara fotolitografia do filme e uma dose de energia de 140 mJ/cm2 a 365 nm comprimento de onda usando um alinhador de máscara.
    3. Asse o wafer de silício revestido a 95 °C por 3,5 min (pós-exposição). Mergulhe e agitar o wafer de silício na solução do desenvolvedor por 3 minutos para revelar as estruturas microfrágicadas removendo o fotoresist não exposto.
      ATENÇÃO: A solução do desenvolvedor pode ser inflamável, tomar as precauções apropriadas ao manusear e armazenar.
    4. Enxágüe com nova solução de desenvolvedor para 10 s. Enxágüe com álcool isopropílico para 10 s e ar seco. Use ar filtrado e comprimido para garantir que as estruturas estejam completamente secas. Meça a altura das estruturas SU-8, por exemplo, usando um perfil.
    5. Silanize cada molde mestre com 50 μL de cloroforimilano aplicando uma pressão de vácuo de 50 mbar por 2 h. Os autores observam que a re-silanização do molde mestre não foi considerada necessária.
      ATENÇÃO: A clorometilosilana é uma substância perigosa. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e manuseie com cuidado. Evite o contato com a pele e os olhos e evite a inalação. Mantenha-se afastado de fontes de ignição e use em uma área bem ventilada.

2. Fabricação de dispositivos

NOTA: As seguintes etapas devem ser conduzidas dentro de um ambiente livre de poeira, como um capô de fluxo laminar.

  1. Preparação de lajes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS)
    1. Prepare aproximadamente 40 g de PDMS misturando completamente a base e o agente de cura em uma proporção de 10:1 usando uma espátula em um copo plástico limpo. Desgas a mistura para remover todas as bolhas de ar colocando o copo plástico contendo o PDMS em uma câmara de vácuo (pressão de vácuo = 50 mbar) por 1 h.
    2. Fixar o molde mestre em uma montagem de plástico usando fita transparente. Limpe usando ar filtrado comprimido para remover qualquer partículas de poeira.
      NOTA: Alternativamente, a folha de alumínio pode ser moldada em torno de uma placa de vidro Petri, e depois usada para abrigar o molde mestre e conter o PDMS43.
    3. Despeje a mistura de PDMS no centro do molde mestre, garantindo que esteja em uma superfície nivelada e deixe se instalar.
      NOTA: A mistura de PDMS deve ser derramada o mais próximo possível da superfície do molde mestre e um fluxo contínuo mantido para minimizar a introdução de bolhas de ar. As bolhas de ar podem ser removidas direcionando o ar comprimido sobre a bolha ou retirando-as usando uma agulha fina.
    4. Cubra o molde mestre livremente com uma tampa plástica para evitar que partículas de poeira se instalem na superfície do PDMS. Transfira o molde mestre para um forno e cure durante a noite a 70 °C.
    5. Retire o molde mestre do forno e deixe esfriar. Retire o PDMS curado do molde mestre e da estrutura plástica, tomando cuidado para evitar danificar o molde mestre/PDMS.
    6. Coloque fita clara sobre os microcanais gravados no PDMS para manter uma superfície livre de poeira. Certifique-se de que a fita seja removida antes da ligação.
    7. Corte o PDMS em lajes (ou seja, se vários dispositivos forem incluídos no design do molde mestre, muitos podem ser fabricados a partir de uma única fundição) conforme designado pelo design usando uma guilhotina montada ou lâmina de barbear. Ao cortar a abertura lateral da laje BFI PDMS, certifique-se de que os microcanais estejam totalmente abertos (Figura 1A). Para a laje FFI PDMS, certifique-se de que cada canto seja aparado para permitir que ele se encaixe na placa de Petri com fundo de vidro mostrada na Figura 1D.
    8. Perfurar os orifícios de entrada/saída desejados de acordo com o design do dispositivo. Use um cortador de precisão para perfurar furos de entrada de 3,18 mm e 4,75 mm para os dispositivos BFI e FFI exemplares, respectivamente.
  2. Ligação de lajes PDMS para criar dispositivos
    NOTA: As seguintes etapas de lavagem (2.2.1-2.2.2) utilizam um limpador ultrassônico recheado com água purificada (ddH2O) a 37 kHz. Lavar as lajes do PDMS ajuda a melhorar a ligaçãobem sucedida 44 e reduzir o risco de contaminação. Para manipular as placas PDMS, use fórceps limpos e levante usando os orifícios de entrada para evitar danos aos microcanais ou à superfície do dispositivo.
    1. Submerse as lajes PDMS em 0,5 M NaOH e sonicate por 5 min. Enxágüe com ddH2O. Transfira as lajes PDMS em solução de 70% de etanol e sonicato por 5 min. Enxágüe com ddH20 estéril.
    2. Mergulhe as lajes PDMS em ddH2O e sonicato por 5 min. Remova as lajes PDMS do ddH2O estéril, seque usando ar comprimido filtrado e coloque em uma placa de Petri quadrada estéril.
    3. Coloque a placa de Petri quadrada contendo as lajes PDMS em um forno a 70 °C por 1h para secar. Retire do forno e deixe esfriar em um ambiente sem poeira. Limpe qualquer poeira da superfície das lajes PDMS usando fita e/ou ar comprimido filtrado.
    4. Ative as superfícies das lajes PDMS e placas de Petri com fundo de vidro a serem ligadas usando um limpador de plasma com as seguintes configurações: pressão de vácuo de 0,75 mbar, potência 50%, tempo de revestimento 1 min. Coloque as superfícies a serem ativadas (e posteriormente ligadas) voltadas para cima no limpador de plasma.
    5. Remova as lajes PDMS e as placas de Petri com fundo de vidro do limpador de plasma e conecte-se suavemente colocando as superfícies ativadas em contato conformal entre si. Unindo as lajes BFI e FFI PDMS às placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm e 50 mm de diâmetro (espessura de vidro 0,17 mm), respectivamente.
      NOTA: Tome cuidado para não aplicar muita pressão ao se relacionar, pois isso pode resultar em colapso dos microcanais.
    6. Verifique se há uma ligação bem sucedida simplesmente tentando tirar a laje PDMS da placa de Petri com pinças com pinças. Visualize os dispositivos por olho ou usando microscopia genérica para garantir que não haja colapso das entradas ou microchannels.
      NOTA: Para condições saturadas (ou seja, condições saturadas de água e/ou ricas em nutrientes), incluem a etapa 2.2.7 do protocolo. Se forem necessárias condições insaturadas de água, proceda à etapa 2.2.8. Os dispositivos podem ser preenchidos com água ou mídia.
    7. Preencha os dispositivos imediatamente após a ligação, tubos 100 μL da solução desejada para o dispositivo BFI (entrada bacteriana e abertura lateral) ou 30 μL de mídia em cada entrada (total de 60 μL) para o dispositivo FFI. Se as bolhas de ar estiverem presentes, estas se dissiparão cerca de 10 minutos após o enchimento, já que o PDMS é poroso.
    8. Adicione ddH2O estéril (~100-200 μL) na placa de Petri para manter a umidade.

3. Cultura microbiana

NOTA: As etapas a seguir fornecem um procedimento microbiológico geral para a cultura fúngica e bacteriana e devem ser realizadas em condições estéreis (ou seja, utilizando um gabinete de segurança de chama ou microbiológico) adequados para o nível de contenção necessário para os micróbios desejados. Exemplos específicos são dados no final de cada seção para uma espécie de interesse.

  1. Cultura fúngica
    1. Prepare o meio de cultura desejado complementado com ágar. Autoclave o médio a 121 °C por 15 min. Deixe o médio esfriar até 50 °C e despeje em placas de Petri de 9 cm de diâmetro, mantendo condições estéreis.
    2. Use um borer de cortiça para remover um plugue de 4 mm de diâmetro de ágar contendo micélio de uma colônia de estoque de geladeira da cepa fúngica desejada para ativar o isolado. Isso é realizado para garantir o crescimento padronizado e vigoroso do fungo antes da inoculação do dispositivo.
      NOTA: Os micróbios também podem ser ativados a partir de um estoque de glicerol, ou seja, isolados fúngicos armazenados em plugues de ágar em solução de 50% de glicerol a -70 °C41.
    3. Coloque a lateral do plugue com micélio em contato com a superfície do ágar no centro da placa de Petri não vacinada. Substitua a tampa em cima da placa de Petri e vedação antes de incubar na temperatura apropriada para a cepa desejada pela quantidade de tempo necessária, normalmente, em torno de 3 a 4 dias.
      NOTA: Condições de cultura de exemplo para Trichoderma rossicum: Ágar extrato de malte, incubado a 25 °C no escuro por 48 h.
  2. Cultura bacteriana
    1. Retire o isolado bacteriano desejado do estoque de origem (por exemplo, estoque de glicerol ou colônia única da placa de ágar) em uma placa de ágar para alcançar colônias bacterianas únicas e garantir que não haja contaminação45. Sele a placa com o filme.
    2. Incubar a uma temperatura e duração específicas do isolamento de interesse até que sejam observadas colônias individuais.
    3. Prepare o caldo de cultura desejado. Por exemplo, adicione 10 g de triptona, 10 g de NaCl e 5 g de extrato de levedura por 1 L de ddH2O para preparar o meio LB para a cultura de B. subtilis. Autoclave o médio a 121 °C por 15 min.
    4. Deixe o médio esfriar até a temperatura ambiente. Adicione o meio a um frasco de cultura estéril dentro de um ambiente estéril.
    5. Toque uma única colônia bacteriana da placa de ágar usando um laço de inoculação estéril. Transfira o laço inoculado para o meio de cultura estéril tocando brevemente o líquido com o laço.
    6. Sele o frasco usando uma tampa ou folha estéril, e coloque dentro de uma incubadora de agitação durante a noite usando as configurações apropriadas para as espécies selecionadas.
      NOTA: Condições de cultura de exemplo para B. subtilis: i) cultura líquida - crescimento aeróbico a 37 °C a 200 rpm em cultura de placas lb média e ii ) - temperatura ambiente na placa de ágar LB. Consulte os papéis FFI/BFI40,41 para obter mais detalhes sobre a cultura de diferentes cepas fúngicas.

4. Inoculação do dispositivo

NOTA: As seguintes etapas devem ocorrer dentro de um capô de fluxo laminar usando equipamento estéril.

  1. Inoculação fúngica
    1. Use um borer de cortiça esterilizado (ø = 4 mm) para remover um plugue de ágar da colônia na periferia de uma cultura de 3 dias de idade (passo 3.1). Certifique-se de que a frente higfál em crescimento permanece intacta.
    2. Introduza o plugue na entrada fúngica, mycelium lado para baixo, com a direção de crescimento da frente hiphal orientada para as aberturas do microcanal para incentivar a infiltração hifal dos canais.
    3. Repita as etapas 4.1.1-4.1.2 para a segunda espécie fúngica (se usar o dispositivo FFI), introduzindo o plugue na entrada oposta. Se usar o dispositivo BFI, omitir esta etapa e continuar a passo 4.1.4.
    4. Sele a placa de Petri com filme transparente e incubar a 25-28 °C no escuro até que a imagem comece. Determine o tempo de incubação pré-imagem dependendo do evento biológico pretendido a ser observado, por exemplo, confrontos fúngicos-fúngicos, e a taxa de crescimento de espécies incluídas dentro do dispositivo.
  2. Inoculação bacteriana
    1. Diluir as bactérias de uma cultura durante a noite (passo 3.2) em uma razão de 1:25 usando o mesmo meio de cultura detalhado na etapa 3.2.3. Cultura para 3 h a 37 °C.
    2. Lave as bactérias através da cultura de pelotização usando uma centrífuga a 2000 x g por 10 min. Descarte o supernatante e resuspenque as células no volume desejado de solução de cloreto de sódio de 0,9% w/v.
    3. Centrifugar novamente para obter uma pelota. Descarte o supernaspe e resuspenque as células em meio líquido (por exemplo, C. cinerea meio mínimo para um OD600 de 1). Otimize o valor OD600 para a cepa bacteriana em questão.
    4. Remova o dispositivo BFI da incubadora e abra-o em um ambiente estéril. Pipeta 10 μL de suspensão na entrada bacteriana.
      NOTA: Otimize os tempos exatos de inoculação para as interações bacteriana-fúngica em questão. Por exemplo, introduza bactérias no dispositivo BFI 18 h de inoculação pós-fúngica se usar C. cinerea.
    5. Sele a placa de Petri com um filme transparente e incubar a 25 °C no escuro até que a imagem comece. Armazene o dispositivo na vertical.

5. Microscopia e análise de imagem

  1. Microscopia
    NOTA: O pesquisador deve selecionar o método adequado de concordância de imagem com a natureza do experimento a ser conduzido, por exemplo, uma epifluorescência de campo largo invertido ou microscopia confocal. Uma visão geral foi fornecida aqui, pois detalhes específicos dependerão dos atributos da microscopia escolhida.
    1. Ligue o computador do microscópio, o corpo principal do microscópio (se aplicável), a câmera, a incubadora controlada pela temperatura e as fontes de luz. Certifique-se de que o microscópio foi configurado corretamente, por exemplo, a iluminação Köhler foi corretamente aplicada para a iluminação da amostra. Inicie o pacote de software de imagem.
      NOTA: Ao usar uma incubadora controlada pela temperatura, é importante permitir que a temperatura do microscópio se equilibre por várias horas antes de iniciar um experimento.
    2. Monte o dispositivo microfluido na inserção do estágio. Certifique-se de que o dispositivo está bem protegido, ou seja, com fita, para evitar desalojar o dispositivo durante o movimento do estágio ativo.
    3. Adquira imagens dos dispositivos inoculados, por exemplo, experimentos de ponto único ou lapso de tempo. As especificações abrangentes de imagem relevantes para os experimentos realizados com os dispositivos BFI e FFI são fornecidas nas respectivas publicações acima mencionadas40,41.
      NOTA: As imagens brightfield foram adquiridas usando microscopia de contraste de fase para visualizar a proliferação de hifais através dos canais de crescimento usando software de foco automático e ampliação de 10x, 0,30 NA (abertura numérica) ou ampliação de 20x, lentes objetivas na 0,45. A excitação de proteínas fluorescentes de repórteres foi alcançada usando um motor leve emissor de luz de alta potência com comprimentos de onda específicos para o fluoróforo.
    4. Exportar imagens em um formato adequado para processamento subsequente de imagens. Por exemplo, .tiff.
  2. Análise de imagem
    NOTA: Os autores recomendam Fiji46 como uma ferramenta para análise de imagens, mas outros pacotes de software estão disponíveis. A seguir, exemplos de análises de imagem realizadas utilizando Fiji a partir das publicações apresentadas de dispositivos BFI e FFI. Essas etapas são específicas para um Mac e podem diferir ligeiramente se usar um PC.
    1. Medições da taxa de crescimento hiphal
      NOTA: Este método foi utilizado no manuscrito BFI40 para medir as taxas de crescimento da hifa individual.
      1. Baixe, instale e inicie Fiji. Importe a sequência de imagem de um experimento de lapso de tempo selecionando Arquivo > Importar > Sequência de imagem. Localize a pasta onde os dados são armazenados e selecione Abrir. Na janela Opções de sequência , selecione Preferências e, em seguida, OK.
      2. Selecione o ícone Linha Reta na barra de ferramentas principal. Posicione o início da linha reta na ponta da ponta hignótica em crescimento clicando e, em seguida, arrastando concomitantemente o cursor para outro ponto dentro da janela. Uma linha amarela aparecerá com três caixas indicando o início, o ponto médio e o fim da linha.
      3. Mova-se para o próximo quadro na sequência de imagem pressionando e segurando Ctrl e >. Posicione a extremidade da linha reta na ponta do higese em crescimento selecionando e arrastando a caixa quadrada para a posição correta.
      4. Pressione e segure Ctrl e M para medir o comprimento da linha em pixels. Uma janela Resultados aparecerá com os dados medidos. Defina os dados exibidos na janela Resultados da seguinte forma: clique na janela Resultados e selecione Resultados > Definir medidas.
      5. Mova-se para o próximo quadro na sequência de imagem pressionando e segurando Ctrl e, em seguida, >. Posicione o início da linha reta na ponta do higese em crescimento selecionando e arrastando a caixa quadrada para a posição correta.
      6. Pressione e segure Ctrl e, em seguida, M para medir o comprimento da linha em pixels. Uma janela Resultados aparecerá com os dados medidos.
      7. Repetimos as etapas 5.2.1.5-5.2.1.6 até terminar de medir o crescimento do hypha em pixels.
      8. Selecione todos os dados na janela Resultados . Copie e cole em outro programa de software, por exemplo, uma planilha, para processar os dados. Plote o crescimento hifal (em pixels ou micrômetros) em função do tempo e calcule as taxas médias de crescimento. Realize pelo menos três réplicas biológicas por experimento.
    2. Medidas de intensidade de fluorescência
      NOTA: Este método foi utilizado na publicaçãoFFI 41 para avaliar a alteração na intensidade da fluorescência na hifa de Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP após contato com Clonostachys rosea 016 em função do tempo.
      1. Baixe, instale e inicie Fiji. Importe a sequência de imagens de um experimento de lapso de tempo selecionando o Arquivo > importar > sequência de imagem. Localize a pasta onde os dados são armazenados e selecione Abrir. Na janela Opções de sequência selecione Preferências e, em seguida, OK.
      2. Especifique uma região de interesse (ROI) para medir a intensidade absoluta de fluorescência de um higifize usando a ferramenta retangular, localizada na barra principal de ferramentas. O tamanho do quadrado pode ser definido exatamente da seguinte forma: Editar > Seleção > Especificar; o ROI também pode ser salvo para referência futura no Gerenciador de ROI selecionando Editar > Seleção > Adicionar ao Gerente.
      3. Meça a intensidade absoluta de fluorescência (valor cinza médio) dentro do ROI definido para cada imagem em toda a sequência de imagem ou pilha da seguinte forma: Image > Stacks > Measure Stack. A janela Resultados será aberta automaticamente assim que todas as imagens da pilha forem processadas.
        NOTA: Os dados exibidos na janela Resultados podem ser definidos da seguinte forma: clique na janela Resultados e selecione Resultados > Definir medidas. Certifique-se de que o Valor Cinza Médio foi selecionado.
      4. Selecione todos os dados na janela Resultados . Copie e cole em outro programa de software, por exemplo, uma planilha, para traçar as intensidades absolutas de fluorescência do ROI especificado em função do tempo.
      5. Repetir as etapas 5.2.2.2-5.2.2.4 para coletar medidas absolutas de intensidade de fluorescência para cada ROI, ou seja, sobre o hypha de interesse, ao lado do hypha de interesse ou dentro do canal de controle correspondente.
      6. Calcule as intensidades de fluorescência relativa apropriadas em unidades arbitrárias (UA), por exemplo, dividindo a intensidade absoluta de fluorescência do ROI [hypha of interest] pela intensidade absoluta de fluorescência do ROI [canal de controle]. Consulte a publicaçãoFFI 41 para obter mais detalhes específicos.
      7. Realizar pelo menos três réplicas biológicas por experimento e traçar as intensidades relativas de fluorescência em função do tempo.

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Representative Results

Os resultados representativos são apresentados dos dispositivos BFI40 eFFI 41 exemplares. As medidas da taxa de crescimento hiphal podem ser facilmente obtidas usando esses dispositivos em combinação com técnicas básicas de microscopia. A Figura 3A-B ilustra interações bacteriana-fúngicas entre C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. A presença de B. subtilis interrompe o crescimento de C. cinerea após cerca de 5 h pós co-inoculação (Figura 3B). As setas indicam a observação morfológica simultânea de hifas mais finas e transparentes (Figura 3A). Também foi observado que as células hífas não afetadas continuaram a proliferar. A Figura 3C-D mostra o forte efeito inibidor de F. graminearum PH1-dsRed em T. rossicum NEU135 após interação hifana, resultando em uma prisão completa do crescimento hifal T. rossicum.

Figure 3
Figura 3: Exemplos de quantificação e observação da taxa de crescimento e observação dos dispositivos BFI e FFI. (A) Imagens de microscopia Brightfield de interações entre Coprinopsis cinerea e Bacillus subtilis NCIB 3610 nos microcanais do dispositivo BFI nos pontos de tempo pós-co-inoculação. As setas destacam uma fina morfologia hifaba, que ocorreu após interação com B. subtilis NCIB 3610. Barra de escala = 25 μm. (B) Taxa de crescimento hifál de pontas de higifismo líder medida acima de 10 h após a co-inoculação. As barras representam desvios padrão de três réplicas biológicas. (C) Boxplot (n = 6) exibindo a taxa de crescimento relativa do Fusarium graminearum PH1-dsRed versus Trichoderma rossicum. A significância é denotada por ** e representa p < 0,01, calculada usando o teste de Mann-Witney U. As barras representam maior ou menor observação igual ao percentil superior e inferior, respectivamente (± faixa interquartil de 1,5 x). (D) F. graminearum PH1-dsRed (crescendo da esquerda para a direita) vs T. rossicum NEU135 (crescendo da direita para a esquerda) às 24h, 48 h e 72 h pós-co-inoculação. Canais de brightfield e fluorescência sobrepostos. Barra de escala = 200 μm. Os painéis desta figura foram modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A-B)40 e Gimeno et al., 2021 (C-D)41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As alterações morfológicas induzidas por eventos de interação podem ser observadas no nível celular usando as metodologias descritas neste artigo. A Figura 4 dá exemplos de observações morfológicas para os dispositivos BFI e FFI apresentados. A Figura 4A mostra a perda da polaridade do crescimento do hífal verticillium longisporum ao encontrar as bactérias Pseudomonas synxantha (P_phen) ou P. fluorescens (P_rhizo), em comparação apenas com os fungos de controle (V1)47. Interações fúngicas-bacterianas resultaram na aparência encaracolada da hifa. Isso foi atribuído a mudanças transcriômicas significativas induzidas por bactérias nos fungos e comportamento de evasão putativa. Estes resultados são significativos, pois V. longisporum é um patógeno vegetal, ou seja, o Pseudomonas sp. tem potencial para ser usado como um biocontrole neste caso47.

A Figura 4B mostra um experimento de lapso de tempo no qual a perda dinâmica do conteúdo celular hiphal pode ser observada, formando blebs que retêm a proteína fluorescente vermelha dTomato. Esta morfologia blebbing ocorreu após co-inoculação com B. subtilis, mas só foi observada em algumas células apical. No entanto, o colapso da hifae e os fenômenos subsequentes de blebbing não foram correlacionados com o apego bacteriano. Isso sugere que havia potencial atividade bacteriana fungicida que não era dependente de apego, hipótese de ser devido à secreção de lipopeptídeos. Técnicas de imagem dinâmica de alta resolução também revelaram um mecanismo de defesa putativo de F. graminearum, exibindo maior formação de septa quando antagonizada por C. rosea, como indicado pelas setas na Figura 4C.

Figure 4
Figura 4: Exemplos de alterações na morfologia observadas durante eventos de interação nos dispositivos BFI e FFI. (A) As alterações morfológicas curling no fungo patogênico vegetal Verticillium longisporum (V1) marcado com proteína fluorescente verde (GFP)48. Esta morfologia ocorreu em resposta a um Pseudomonas spp fluorescente. com codificação de genes para síntese de fenoazina (P_phen; P. synxantha) e uma bactéria isolada da rizosfera da colmada (P_rhizo; P. fluorescens). Barras de escala = 20 μm. (B) dTomato-expressing Coprinopsis cinerea40 co-inoculado com Bacillus subtilis imaged 5 h pós-co-inoculação. As células estavam intactas (esquerda) às 5h, mas um hypha entrou em colapso 30 minutos depois (perda de fluorescência) e foram observados blebs contendo material celular (fluorescente). Barra de escala = 25 μm. (C) Setas destacam a formação de septa em Fusarium graminearum hyphae observada após interação com Clonostachys rosea hyphae. Barra de escala = 10 μm, carimbo de hora = h pós co-inoculação. Os painéis desta figura foram modificados a partir de Harting et al., 2021 (A)47, Stanley et al., 2014 (B)40 e Gimeno et al., 2021 (C)41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os dispositivos apresentados também são adequados para observar alterações fisiológicas dinâmicas. Utilizando o dispositivo BFI, mostrou-se que a concentração de bactérias associadas à higia mudou ao longo do tempo e diminuiu após um acúmulo local de células (Figura 5A). A mobilização bacteriana ao longo dos microcanais também foi observada em conjuntos semelhantes a clusters. No dispositivo FFI, a rotulagem de fluorescência permitiu a quantificação da proliferação de C. rosea hyphal quando confrontada com F. graminearum para caracterizar a dinâmica da interação antagônica (Figura 5B). Essas medidas foram tomadas ao longo de um período de 20 h e demonstram o potencial desses dispositivos para a realização de experimentos de longo prazo.

Figure 5
Figura 5: Medidas de caracterização fisiológica dinâmica exemplar para os dispositivos BFI e FFI. (A) Experimento de lapso de tempo no dispositivo BFI representando o acessório por Bacillus subtilis NCIB 3610 pMF3740 à hifa de Coprinopsis cinerea pMA41240 mais de 3 h. Barra de escala = 50 μm. (B) Imagens do canal Brightfield e fluorescência mostram quantificação da proteína fluorescente verde (GFP) detectada usando o dispositivo FFI durante a interação entre clonostachys rosea fluorescentemente marcada e Fusarium graminearum49. Barra de escala = 50 μm. Gráfico (à direita) plota fluorescência relativa em unidades arbitrárias (UA) acima de 20 h, n = 6 e barras de erro indicam o erro padrão. As parcelas laranja e cinza ilustram as intensidades de fluorescência de (i) GFP detectadas na rede hífala de C. rosea e (ii) o canal de interação em comparação com o canal de controle contendo C. rosea, respectivamente. O gráfico de controle preto mostra a intensidade de fluorescência da hifa no canal de controle C. rosea em comparação com o canal de controle. Os painéis deste número foram modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A)40 e Gimeno et al., 2021 (B)41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este artigo apresenta um protocolo para o estudo das interações fúngicos-microbianas utilizando microfluidos de canal. Os autores visam demonstrar a versatilidade desses dispositivos e incentivar a adaptação para atender aos interesses do pesquisador. Usando os dispositivos BFI e FFI exemplares, as interações fúngicos-microbianas podem ser estudadas com mais detalhes do que previamente acessíveis. Ao remover a complexidade de fundo e a heterogeneidade do solo, moderando o crescimento da hifa de tal forma que eles estão confinados a uma única monocamada, e regulando fortemente parâmetros ambientais, é possível capturar imagens de alta resolução desses eventos biológicos ao longo do tempo. Utilizando esses dispositivos, as interações entre parceiros microbianos têm sido caracterizadas por meio de taxa de crescimento, quantificação de fluorescência e bioimagem observacional de traços morfológicos.

Os dispositivos podem ser projetados para permitir a caracterização de interações fúngicas-microbianas no nível celular. A versatilidade e facilidade de design para não especialistas tornam este protocolo adequado para adaptação a uma ampla amplitude de questões de pesquisa. Os dispositivos BFI e FFI são adequados para uso com uma variedade de microscópios para se adequar ao objetivo experimental, devido à sua natureza transparente e superfície ligada ao vidro. Os dispositivos podem ser adaptados em relação tanto à sua configuração quanto aos parâmetros físico-químicos; por exemplo, umidade, temperatura ou saturação de canais podem alterar a experiência ambiental para o sujeito teste. Então, o dispositivo pode ser projetado de tal forma que possa direcionar fisicamente o crescimento ou provocar um comportamento específico, como eventos de interação ou estratégias de navegação, controlados pela estrutura e tamanho do canal ou pela inclusão de obstáculos. Isso não é possível com metodologias atuais, como ensaios de ágar-placa31.

Até agora, dispositivos microfluidos também foram empregados para explorar as interações fúngica-phage50 e fúngico-nematóide35 . O uso de microfluidos de canal também permite o controle e troca de fluidos dentro do dispositivo. Essa característica importante e vantajosa foi fundamental no estudo da retenção de fárquicosmicelial 50. Além disso, o uso de tecnologias microfluidas para estudos de transcriptômica produziu uma maior resolução de genes expressos diferencialmente em comparação com um ensaio semelhante à base de ágar. Os métodos foram concomitantes em 24 dos 28 genes expressos diferencialmente identificados pelo mesmo experimento de placa de ágar, com os dispositivos microfluidos identificando muitos outros genes e relatando uma expressão relativa mais elevada na comparação35.

As etapas críticas do protocolo começam com o design original do dispositivo. Para alcançar um design adequado, é preciso prestar atenção à estratégia de estilo de vida e crescimento/mobilidade dos micróbios de interesse. Por exemplo, incluindo profundidade ou comprimento de canal suficientes para acomodar os requisitos fisiológicos e a velocidade de crescimento do microrganismo de interesse. As características estruturais e componentes dos microcanais podem ser projetados para induzir ou manipular comportamentos específicos, como aberturas para zonas de interação ou obstáculos para observar estratégias de navegação. Além disso, a questão da pesquisa experimental deve ser endereçada com o design do dispositivo. Considere, por exemplo: (i) como os perfis de fluxo laminar podem ser explorados, (ii) adaptação e alturas microcanais variadas para que o organismo seja investigado, e (iii) estreitamento das entradas de microcanal para evitar a super proliferação de hifas dentro do dispositivo. Os autores sugerem esses recursos adicionais para o projeto de dispositivosmicrofluidos 51,52,53. Também é essencial manter os dispositivos livres de poeira durante a fabricação. Por isso, deve-se tomar cuidado para manter um ambiente livre de poeira durante todas as etapas do processo de fabricação, bem como usando fita e ar comprimido filtrado, e mantendo as superfícies PDMS cobertas quando não estão em uso. Outras etapas críticas do protocolo incluem minimizar o risco de contaminação lavando os dispositivos em solução de 70% de etanol, e garantir a ligação adequada entre a superfície de vidro e a laje do PDMS, colocando suavemente as superfícies ativadas em contato entre si e não aplicando muita pressão nos microcanais. Verifique se há adesão satisfatória ao tentar deslocar a laje PDMS do vidro antes da inoculação. Uma limitação desses dispositivos é que eles não podem ser reutilizados entre experimentos.

A inclusão de micróbios do solo em dispositivos microfluidos sob medida começa uma nova era emocionante para pesquisas sobre interações microbianas. As aplicações futuras potenciais da metodologia apresentada são abrangentes, como a descoberta de novas espécies de biocontrole ou compostos antimicrobianos, ou a caracterização da chamada rodovia fúngica para mobilização bacteriana. Os dispositivos BFI e FFI fornecem uma plataforma para visualizar alterações morfológicas e fisiológicas dinâmicas que ocorrem antes e pós-interação no nível celular. Novos dispositivos são simples de projetar e criar, simplesmente exigindo engenhosidade, para se adequar à questão da pesquisa experimental. Sua versatilidade e facilidade de uso significa que esse método pode ser usado por não-especialistas para promover a pesquisa de microbioma do solo no nível celular.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Reconhecemos o apoio financeiro do Departamento de Bioengenharia do Imperial College London e do Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Difco Laboratories 214010 Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil Fisher Scientific Ltd 11759408
AutoCAD 2021 Autodesk, USA
Autoclave (VX-75) Systec
Centrifuge (5810R) Eppendorf
Chlorotrimethysilane Merck Life Sciences 386529 CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer SLS COR1000
Developer solution (mr-Dev 600) Microresist Technologies CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks VWR 214-1108 e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)  Fisher Scientific Ltd E/0650DF/15 Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji ImageJ Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers SLS INS5026
Forceps Fisher Scientific Ltd 10008051 Bent, sharp
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD35-100 35 mm
Glass bottom petri dish World Precision Instruments FD5040-100 50 mm
Glass crystallisation dishes VWR 216-1865 Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes VWR 216-1866 Used in the development of master moulds
Glass media bottles Fisher Scientific Ltd 15456113 e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton) Fisher Scientific Ltd 10625251 Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM) SAWATEC
Inoculation loop VWR COPA175CS01
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
Laminar flow hood Air Science (PCR) Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium Fisher Scientific Ltd BP9723-500 Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB) Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner Suss Microtec
Malt extract VWR 84618 Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer Applied Materials 4700DP Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount 3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2) Contained Air Solutions Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water Available as standard in biology labs. 
NaOH Fisher Scientific Ltd BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software Nikon Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer Nikon Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115) Fisher Scientific Ltd 15602126 Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S) KOYO Used for preparing silicon wafers
Parafilm Bemis HS234526B transparent film
Petri dishes, square sterile Fisher Scientific Ltd 11708573 120.5 mm
Petri dishes, sterile Fisher Scientific Ltd 15370366 90 mm 
Photolithography mask Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto) Diener Electronic 100012601
Plastic cup Semadeni 8323
Plastic spatula Semadeni 3340
Portable precision balance (OHAUS Scout) Fisher Scientific Ltd 15519631 Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter Syneo HS1251135P1183 Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter  Syneo HS1871730P1183S Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer  Bruker Dektak XT-stylus
Razor blades Häberle Labortechnik 9156110
Refridgerator Haden 4-6 °C
Retiga R1 CCD camera Qimaging Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape Office Depot 3969954 19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) Fisher Scientific Ltd 10257954
Silicon wafer Inseto 100 mm
Soda lime glass plate Inseto 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Spincoater  SAWATEC SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist MicroChem CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. 
Sylgard 184 elastomer kit VWR 634165S Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator Okolab Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope Nikon MEA54000 Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line Fisher Scientific Ltd FB15050
Vacuum desiccator Fisher Scientific Ltd 10528861 Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH20105 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens Nikon MRH48230 Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions

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Bioengenharia Edição 184
Ferramentas microfluídicas para sondar interações fúngicas-microbianas no nível celular
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Masters-Clark, E., Clark, A. J.,… More

Masters-Clark, E., Clark, A. J., Stanley, C. E. Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level. J. Vis. Exp. (184), e63917, doi:10.3791/63917 (2022).

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