Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64063
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London
* These authors contributed equally

Summary

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

Abstract

ניתן להשתמש במספר שיטות כדי לדמיין תאים בודדים בכל הגוף של דגי זברה עובריים, זחליים או צעירים. אנו מראים כי דגים חיים עם קרומי פלזמה המסומנים בפלואורסצנטיות יכולים להיסרק במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי על מנת לקבוע את נפח רקמת השריר ואת מספר סיבי השריר הקיימים. גישות יעילות למדידת מספר וגודל התאים בבעלי חיים חיים לאורך זמן מתוארות ומאומתות מול שיטות סגמנטציה מפרכות יותר. מתוארות שיטות המאפשרות שליטה על פעילות חשמלית השרירים, ובכך התכווצות. אובדן פעילות התכווצות שרירי השלד הפחית מאוד את צמיחת השרירים. בזחלים, מתואר פרוטוקול המאפשר הכנסה מחדש של פעילות התכווצות חשמלית מעוררת. השיטות המתוארות ממזערות את השפעת השונות הבין-אישית ויאפשרו ניתוח של השפעת גירויים חשמליים, גנטיים, תרופתיים או סביבתיים על מגוון פרמטרים של גדילה תאית ופיזיולוגית בהקשר של האורגניזם החי. לאחר מכן ניתן לבצע מעקב ארוך טווח אחר ההשפעות הנמדדות של התערבות מוגדרת בתחילת החיים על אנשים.

Introduction

צמיחת רקמות מוסדרת, הכוללת גידול במספר התאים (היפרפלזיה) ו/או בגודל התא (היפרטרופיה), היא גורם מכריע בהתפתחות, התחדשות והסתגלות אקולוגית ואבולוציונית. למרות ההתקדמות העצומה בהבנה הגנטית המולקולרית של ביולוגיה תאית והתפתחותית בעשורים האחרונים, ההבנה המכניסטית של ויסות גודל הרקמות והאיברים עדיין בחיתוליה. אחת הסיבות ללקונה זו בידע היא הקושי לכמת צמיחת רקמות באורגניזמים חיים בדיוק המרחבי והזמני הדרוש.

היבטים שונים של גדילה של אורגניזמים שלמים ניתנים למדידה חוזרת ונשנית לאורך זמן, וחושפים עקומות גדילה עבור כלאדם 1,2,3,4,5. שיטות סריקה מתוחכמות יותר ויותר, כגון אבסורפטיומטריה של קרני רנטגן כפולות (DXA), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), מאפשרות מעקב אחר צמיחה של איברים שלמים ואזורי גוף אחרים (לדוגמה, שרירי שלד שזוהו על ידי יחידים) אצל אנשים בודדים, הן בבני אדם והן באורגניזמים מודל 6,7,8,9,10 . עם זאת, לשיטות אלה עדיין אין את הרזולוציה לחשוף תאים בודדים ולכן קשה היה להבחין בקשרים בין התנהגויות תאיות לצמיחה ברמת הרקמה. כדי ליצור קשרים כאלה, מחקרים מסורתיים הסתמכו לעתים קרובות על קבוצות של בעלי חיים בודדים דומים, שכמה מהם מוקרבים בנקודות זמן עוקבות ולאחר מכן מנותחים בפירוט ציטולוגי. גישות כאלה דורשות ממוצע של השינויים הנצפים בין קבוצות של פרטים (רצוי דומים, אך בכל זאת משתנים) ולכן סובלות מהיעדר רזולוציה טמפורלית ומרחבית, מה שמקשה על מציאת אירועים מתואמים ברמה התאית המרמזים על סיבה ותוצאה.

מחקרים על אורגניזמים מודל חסרי חוליות, בתחילה ב- C. elegans ו- D. melanogaster, עקפו את הבעיות הללו על ידי פיתוח מיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג רזולוציה תאית ולמדוד במדויק צמיחה לאורך זמן אצל פרטים בודדים. מחקרים כאלה חשפו התנהגויות של שושלת תאים אינווריאנטית להפליא בגדילתם של אורגניזמי מודל קטנים אלה 11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, לבעלי חיים רבים, כולל כל בעלי החוליות, יש שושלות תאים לא מוגדרות, והם שולטים בצמיחת רקמות על ידי תהליכי משוב מסתוריים המשמשים להפיכת תוכנית הגדילה המקודדת גנטית לאורגניזם תלת-ממדי פונקציונלי שכל הרקמות והאיברים המרכיבים אותו תואמים את גודלו. כדי להבין את תהליכי הצמיחה המורכבים האלה, רצוי לדמיין רקמות שלמות או איברים לאורך זמן אצל אנשים בודדים שניתן לתמרן אותם בניסוי על ידי התערבויות גנטיות, פרמקולוגיות או אחרות בזמן בחירה וההשפעה נותחה לאחר מכן.

לכל שרירי שלד בעלי חוליות יש גודל, צורה ותפקוד מוגדרים, ואינטראקציות מאופיינות היטב עם רקמות סמוכות, כגון עצם, גיד ועצבים. חלק מהשרירים קטנים, שוכבים ממש מתחת לעור ולכן הם מועמדים טובים למחקרי הדמיה ברזולוציה גבוהה. בדומה לרוב האיברים, כל שריר גדל במהלך החיים העובריים, לאחר הלידה והנעורים, לפני שהוא מגיע לגודל בוגר יציב. לשריר, לעומת זאת, יש גם יכולת ייחודית לשנות גודל במהלך החיים הבוגרים, תלוי בשימוש ובתזונה18, ולתכונה זו יש השפעה רבה על הכושר האורגניזמי, הביצועים הספורטיביים והחיים העצמאיים. אובדן מסת שריר ותפקוד בגיל מבוגר, סרקופניה, הוא נושא של דאגה גוברת עבור חברות המתמודדות עם אוכלוסייה מזדקנת 19,20,21.

אנחנו ואחרים התמקדנו בצמיחה של בלוקים מוגדרים של רקמת שריר השלד בגוף החוזר על עצמו באופן סגמנטלי של זחלי דגי זברה, כמערכת סגורה לכאורה המכילה כמה מאות תאים שבהם ניתן לצפות בצמיחה, תחזוקה ותיקון של רקמות ולתפעל אותן 22,23,24,25,26. בעוד שעבודה כמותית מסוימת דווחה בעבר 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, אין שיטה מפורטת ומאומתת למדידת צמיחת שרירים בפרטים תאיים באורגניזמים בעלי חוליות בודדים לאורך זמן. כאן מתואר פרוטוקול יעיל כיצד לבצע מדידות חוזרות כאלה, יחד עם אימות, ודוגמה לשימוש בו לניתוח שינויים בצמיחה היפרטרופית והיפרפלסטית בתגובה לפעילות חשמלית שהשתנתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים המתוארים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות ותחת רישיונות מתאימים ממשרד הפנים הבריטי בהתאם לחוק בעלי החיים (נהלים מדעיים) 1986 והשינויים שבאו בעקבותיו. יש לגדל עוברים/זחלים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד להשלמת הקיבה, אך לאחר מכן ניתן לשמור אותם בטמפרטורה של 22-31 מעלות צלזיוס כדי לשלוט בקצב ההתפתחות. ניתן לסרוק או לעורר דגים בטמפרטורת החדר.

1. הרדמת זחלי דגי זברה

  1. לחצות כתב פלואורסצנטי מתאים דגים בוגרים כגון Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg הפניה 36 או Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg הפניה37 ולאסוף עוברים כמתואר38.
  2. בעת הבחירה, כגון יומיים לאחר ההפריה (dpf), מרדימים עוברים לזמן קצר באמצעות מדיום דגים המכיל טריקאין (מי דגים או מדיום E3), ומסננים EGFP או mCherry תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כגון Leica MZ16F. אם לאחד מהם יש עוברים רבים, בחר את אלה עם האות הבהיר ביותר. החזרת עוברים למדיום דגים רגיל מיד לאחר ההקרנה.

2. הרכבת דגים לסריקה קונפוקלית

  1. הפעל את מערכת סריקת הלייזר הקונפוקלית והלייזרים, כדי לאפשר למערכת להתייצב למשך 30-60 דקות.
    הערה: כאן, השתמשנו במיקרוסקופ Zeiss LSM 5 Exciter עם מעמד חומרים זקוף (המשפר את מרחק העבודה) המצויד במטרה לטבול במים של 20x/1.0 W.
  2. הכינו 1% אגרוז נמס נמוך (LMA) ושמרו בבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר בצינור של 1.5 מ"ל. כדי למנוע זעזוע חום, הסירו את ה-LMA aliquot מגוש החום ותנו לו להתקרר בדיוק מעל לפני שאתם מורחים על הזחל, תוך בדיקה נגד העור כדי לשפוט את הטמפרטורה המתאימה, כמו בעת הערכת הטמפרטורה של חלב פורמולה לתינוקות.
  3. בחר דגים להרכבה והרדמה ארעית של כל דג בתורו עם טריקאין (0.6 מ"מ במדיום דגים).
  4. לוקחים צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ שמצופה בשכבה של 1% אגרוז ומניחים על הבמה של מיקרוסקופ גזירה.
  5. מעבירים את הזחל עם פיפטה פסטר מפלסטיק 1 מ"ל על צלחת פטרי מצופה 60 מ"מ ומסירים כמה שיותר מדיום מועבר. לאחר מכן, עדיין באמצעות פיפטה פסטר, הניחו 5 עד 10 טיפות של LMA על הדג והתמקמו במהירות אופקית במבט רוחבי עם מלקחיים (או מחט זכוכית עדינה מלוטשת באש) לפני שה-LMA מתייצב. להדמיה אופטימלית, רצוי למקם את הזחל קרוב לפני השטח העליונים של ה-LMA.
    1. לחלופין, באמצעות פיפטה פסטר פלסטית של 1 מ"ל, לאסוף את הזחל עם כמה שפחות מדיום דגים, ולהעביר את הזחל לתוך aliquot של LMA מקורר. אפשרו לזחל לשקוע במשך 5 שניות כדי להיות מוקף לחלוטין ב-LMA. לאחר מכן, שלפו את הזחל והעבירו אותו בטיפה של LMA על צלחת הפטרי המצופה באגרוז. התמצאות מהירה ומיקום הזחל כמתואר לעיל.
  6. כוון את הזחל עם שני הצירים האנטרופוסטריים והדורסובנטרליים שלו בטווח של 10° מהאופקי (ראה הערה 'על טעות ותיקונה', בנקודה 4.6 להלן).
    1. אם הזחל אינו מותקן כראוי אופקית ליד פני השטח של טיפת agarose, להסיר ולהטביע מחדש. ניתן לשלוף זחלים בקלות על ידי שאיבה עדינה באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר בגודל 1 מ"ל, וניתן להסיר את LMA בעדינות באמצעות Kimwipes. תרגול באמת עושה מושלם בהליך ההרכבה; לבלות אחר הצהריים הטמעת כמה זחלים לא חשובים לפני שתנסה את זה על ניסוי אמיתי.
      הערה: על תכנון מיקרוסקופ: מעבדות רבות משתמשות במיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים להדמיה דרך כיסוי. מצאנו כי הטבעה והסרה חוזרות ונשנות של דגים המוחזקים באגרוז תחת כיסוי לתצפית במיקרוסקופ הפוך מובילה לאובדן גדול יותר של דגימות במהלך סריקה חוזרת ונשנית מאשר בהליך המתואר במיקרוסקופ זקוף. מסיבה זו, מומלץ להשתמש במערכת זקופה, אם קיימת. עם זאת, המפתח לנתונים איכותיים הוא בחירה נכונה ושימוש בפרמטרים אובייקטיביים וסריקה, נושא גדול מדי לדיון כאן.

3. סריקה קונפוקלית

  1. כאשר LMA התייצבה, הציפו את המנה בכ-10 מ"ל של דגים המכילים טריקאין. אם אתם מתכננים ללכוד ערימות קונפוקליות, תנו לדגים הרכובים לנוח לפחות 10 דקות לפני שתמשיכו לסריקה, מכיוון שמתרחשת נפיחות אגרוז.
  2. טוענים את צלחת הדגימה לשלב של המערכת הקונפוקלית, מאתרים את הזחל ומתמקדים בסומיט הרצוי. ניתן לבחור בסומיט 17 בגלל קלות הלוקליזציה שלו ליד פתח האוורור האנאלי וקלות ההדמיה. בדוק על ידי ספירת סומיטים מקדימה.
    הערה: הסומיט הראשון מתמזג מאחורי האוזן ואין לו גבול קדמי, אך ניתן לראות אותו בקלות כבעל סיבי שריר מפושטים.
  3. הגדר כאילו כדי ללכוד ערימת Z על ידי הגדרת החלק העליון (כלומר, ממש מעל העור) והתחתון (כלומר, ממש מתחת לנוטוקורד, כך שיכלול את כל הסומיט, גם אם הדג מותקן מעט מוטה). ניתן ללכוד גם צד שמאל וגם צד ימין לפי הצורך. זה יבטיח שכל סריקות YZ המהירות לוכדות את האזורים הרצויים.
  4. צלם תמונת XY באופן הבא. כוון את אזור הסריקה ביחס לדגים, כפי שמאפשרת התוכנה הקונפוקלית. מקם את הדג עם ציר האנטרופוסטריור במקביל לציר X המצולם והציר הגבי במקביל לציר Y עם סומיט 17 במרכז השדה כפי שמוצג בקובץ משלים 1. התמקדו במישור ברמה בינונית במיוטום העליון שבו כל חצאי הסומיט האפאקסיאליים וההיפאקסיאליים יחד עם המיוספטה האנכית והאופקית נראים לעין ולוכדים תמונת XY ברזולוציה גבוהה. זכור לתת שם ולשמור את התמונה.
  5. צלם תמונה אחת או יותר של YZ באופן הבא. בתוצאות המייצגות (להלן) משווים את הדיוק של שיטות של 2 פרוסות ו- 4 פרוסות. בגישת 2 פרוסות, נעשה שימוש בסריקות XY ו- YZ בודדות. בגישת 4 פרוסות, שלוש סריקות YZ ממוצעות כדי לתת הערכה מדויקת יותר של נפח מיוטום. אם נדרש על ידי התוכנה confocal, לכוון מחדש את שדה הסריקה.
    1. ציירו קו גב לגחון מדויק על פני הסומיט הנבחר בניצב לציר האנטרופוסטריור של הדג במיקום אנטרופוסטרי נבחר. בצע סריקת קו Z-stack.
    2. חזור על סריקת קו YZ שלוש פעמים במיקומים אנטרופוסטריוריים מוגדרים לאורך המיוטום שנבחר כדי ללכוד את YZa, YZm ו- YZp. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2A. תן שם לתמונות אלה ושמור אותן יחד עם תמונת ה- XY הקשורה.
      הערה: בבחירת מישורי YZ: המיוטום הוא בצורת V וצורתו משתנה במהלך הצמיחה. כדי לקבל את ההערכה המדויקת ביותר של נפח מיוטום 17 בשיטת 4 פרוסות, מקם את YZa בקצה הקדמי של המיוטום, YZp על הקצוות האחוריים של המיוטום בקצוות הגביים והגחוניים, ו- YZm באמצע הדרך בין YZa ל- YZp. בהנחה שהסומיט מתחדד באופן אחיד, ממוצע המדידות מכל מקטע YZ ייצג את המיוטום בכללותו. עבור שיטת 2 פרוסות, סריקת YZ יחידה צריכה להיות ממוקמת בקצה האחורי של המיוספטום האופקי, אשר מתאים בערך למרכז האנטרופוסטריור של מיוטום העניין (כגון YZm). לחלופין, ניתן לקחת קבוצה של שלושה מקטעי YZ בחלק הקדמי, האמצעי והאחורי של המיוספטום האופקי, אך כפי שמוצג להלן, מדידה כזו תהיה מעט מעל או תת-הערכה של נפח מיוטום (עבור סומיטים רוסטרליים וקאודליים, בהתאמה, עקב התחדדות מיוטום). ביסודו של דבר, עקביות במיקום מישורי פרוסת YZ בין דגים לניסויים היא המפתח לשכפול.

4. ניתוח

  1. מכיוון שהמיוטום משנה את גודלו לאורך הדג באופן מדורג, עבדו תמיד עם אותו סומיט במחקרים השוואתיים.
  2. כדי למדוד ולחשב את נפח המיוטום, השתמש בתוכנת הקונפוקל (כגון קבצי .lsm שנוצרו באמצעות תוכנת המיקרוסקופ Zeiss ZEN) או בתוכנת ניתוח תמונות אוניברסלית בקוד פתוח, כגון Fiji/ImageJ.
    הערה: בעת שינוי תבניות קובץ, ודא שגודל שלב Z מועבר כהלכה, מכיוון שלא כל התוכנות יכולות לקרוא תבניות קובץ קונפוקליות קנייניות כראוי. לדוגמה, כדי לייבא תמונת סריקת שורות ZEN לפיג'י, השתמש תחילה בפקודה File/Export כדי לייצא כ- .tif בחלון תמונה ברזולוציה מלאה - תבנית מישור בודד, ולאחר מכן יבא לפיג'י. למרות שניתן לפתוח את YZ scan.lsm ישירות בפיג'י, תמונות ה-YZ המתקבלות נדחסות בדרך כלל בממד Z עקב הערכה שגויה של גודל הצעד Z.
  3. ניתוח באמצעות ZEN
    1. ראשית, פתח את קבצי XY scan.lsm בזן. עברו לכרטיסייה ' גרפיקה' ובחרו בכלי קו. ציירו קו בין שני המיוספטה האנכיים של סומיט 17 המשתרעים על כל אורך המיוטום (במקביל לציר האנטרופוסטריור של הדג). סמן את התיבה M כדי לחשוף את ערכי המדידה (אורך = 89.71 מיקרומטר, ראה קובץ משלים 2).
    2. פתח את הקבצים YZ scan.lsm. תחת הכרטיסיה גרפיקה , בחר בכלי בזייה סגורה . ציירו סביב היקף המיוטום. לאחר השלמתו, סמן את התיבה M, פעולה זו תחשוף את ערך המדידה (שטח = 11980.01 מיקרומטר2, ראה קובץ משלים 3).
    3. הקלט את הערכים של כל מדידה באופן ידני בגיליון אלקטרוני. ממוצע מדידות CSA כנדרש. ניתן לחשב את נפח המיוטום כנפח = אורך מיוטום x CSA, כלומר, 89.71 מיקרומטר x 11980.01 מיקרומטר2 = 1.075 x 106 מיקרומטר3.
  4. ניתוח באמצעות פיג'י/אימג'יי
    1. פתח את הקבצים XY scan.lsm בפיג'י/ImageJ. בדוק אם תמונות XY שנפתחו ישירות בפיג'י מכוילות כראוי בקנה מידה, כפי שהן צריכות להיות.
    2. בחרו בכלי קו ישר מהסמלים. ציירו קו לאורך סומיט 17 כמתואר בשלב 4.3.1. הגדר פרמטרי מדידה על-ידי מעבר אל נתח, ולאחר מכן בחר קבע מדידות..., וסמן את התיבות הבאות אזור ותווית תצוגה. כדי למדוד, פשוט לחץ על המקש החם M, או עבור לתפריט ניתוח ובחר מדוד. חלון מוקפץ שנוצר מפרט את כל ערכי המדידה (כלומר, אורך = 90.023 מיקרומטר; ראה קובץ משלים 4). ניתן לשמור את התוצאות בצורה של .csv ולפתוח ב- Microsoft Excel או דומה לניתוח הבא.
    3. כדי למדוד CSA בתמונות YS, פתח את תמונות YZ בתבנית .tif כמתואר בשלב 4.2.
    4. כייל את התמונות .tif YZ מכיוון שהן אינן מכויילות בעת ייצואן. ניתן לקבל פרמטרים לכיול ב- ZEN על ידי מעבר אל המידע של התמונות שנבחרו: הקלט את ערכי קנה המידה X (0.489 מיקרומטר) ו- Scaling Z (0.890 מיקרומטר; ראה קובץ משלים 5). לאחר מכן, כאשר התמונות פתוחות בפיג'י, עבור אל תמונה ובחר מאפיינים.... קלט 0.489 מיקרומטר עבור רוחב הפיקסלים וגובה הפיקסלים, ו- 0.890 μm עבור עומק Voxel. סמן את התיבה כללי כדי להחיל את הכיול באופן אוניברסלי אם צפויה מדידה חוזרת של תמונות YZ (ראה קובץ משלים 6).
      הערה: ודא שכל תמונות YZ נלכדו באמצעות אותם פרמטרי סריקה; הפעל מחדש את Fiji/ImageJ או שנה את ערכי הכיול אם נדרשת ערכת כיול חדשה.
    5. למדידת CSA של תמונות YZ מכוילות, בחרו בכלי בחירות מצולע מהסמלים. ציירו סביב היקף הסומיט, ולחצו על M כדי לחשוף את ערכי המדידה (שטח = 11980.395 מיקרומטר2; ראו קובץ משלים 7). ניתן לחשב את נפח המיוטום כנפח = אורך מיוטום x CSA, כלומר, 90.023 מיקרומטר x 11980.395 מיקרומטר2 = 1.079 x 106 מיקרומטר3.
    6. חזור על המדידות בתמונות XY ו- YZ האחרות. מומלץ להשתמש באותה תוכנה לכל המדידות בסדרת ניסויים לצורך עקביות. אומדן הנפח מכל תוכנה דומה אך לא זהה בשל כלי השרטוט השונים, כלומר, ZEN = 1.074 × 10 6 מיקרומטר 3 ופיג'י / ImageJ = 1.079 × 106 מיקרומטר3. ניתן לחשב את גדילת המיוטום בין שתי נקודות זמן (כלומר, 3 עד 4 dpf) כ: (נפח 4 dpf - נפח 3 dpf)/ נפח 3 dpf × 100%.
      הערה: על טעות ותיקונה. במהלך ההרכבה, הדג צריך להיות מכוון עם המישור sagittal שלה (כלומר, anteroposterior ו dorsoventral צירים) קרוב ככל האפשר אופקי, כדי למנוע פיהוק וגלגול, בהתאמה. הסיבה לכך היא שגם אורך המיוטום L שנמדד מסריקת XY וגם ה-CSA שנמדד מסריקת YZ יוערכו יתר על המידה אם הדג יראה פיהוק (סיבוב סביב הציר הדורסו-ונטרלי) עקב הרכבה אנטרופוסטרית אלכסונית. לא המגרש ולא הגלגול במהלך ההרכבה אמורים להשפיע על המדידות לאחר הסריקה כמתואר בסעיף 3. עם זאת, סיבוב הגב (גליל) פוגע באיכות התמונה. טריגונומטריה פשוטה מראה כי עד 10° של פיהוק ייתן שגיאה של 3% במדידת הנפח, כפי שנמדדו L ו- CSA כל אחד בפרופורציה ל- (cosq)-1, כאשר q היא הזווית הרחק מאנטרופוסטריור אופקי (פיהוק). 15° ו-20° הנחה יתנו הערכות יתר של 7% ו-13% של נפח, בהתאמה.
      מכיוון שהנוטוכורד הוא גלילי, ניתן להשתמש בהכללת כל הנוטוקורד בסריקת YZ כדי לחשב את הזווית וההיקף של השכחה מהכיוון והגודל של הצירים הראשיים והמינוריים ובכך לתקן את L ו- CSA הנמדדים כדי למקסם את הדיוק. CSA מתוקן = נמדד CSA x ציר נוטוכורד מינורי/ציר נוטוכורד מז'ור. L מתוקן = נמדד L x ציר נוטוכורד מינורי/ציר נוטוכורד בכיוון מיקרוסקופ Z .
      שיקול נוסף מאפשר תיקון נוסף של L. ככל שהמיוטום גדל, הוא מוטה במישור הקורונלי (נורמלי לציר הדורסו-בונטרלי) כך שהמיוטום המדיאלי מעט קדמי למיוטום הלטרלי. במבט מהגב האחורי, המיוספטה האנכית בצד שמאל ובצד ימין יוצרת שברון רחב המצביע קדמית. אם הפיהוק נמוך, מורפולוגיה זו אינה משפיעה על מדידת L. אבל אם הפיהוק הוא משמעותי, תיקון טריגונומטרי הופך למאתגר וגישה טובה יותר היא למדוד את True L ישירות על ידי הערכת קואורדינטות XYZ של שתי הנקודות שבהן המיוספטה האנכית הקדמית והאחורית פוגשת את הנוטוקורד במיוספטום האופקי. טריגונומטריה פשוטה מאפשרת חישוב של L אמיתי מקואורדינטות אלה כ- L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. חולשותיה של גישה אחרונה זו הן ש- א) בחירת הנקודות יכולה להשתנות עם האופרטור ו- ב) לא נשמר תיעוד חזותי של הנקודות שנבחרו. שיקול זה אינו משפיע על תיקון CSA.

5. שיטה אופציונלית: הסרה והצגה מחדש של הפעילות החשמלית של השרירים

  1. צרו תא גירוי.
    1. קח לוח באר בגודל 6 x 35 מ"מ, צור שני פתחים קטנים (<5 מ"מ קוטר, 1 ס"מ זה מזה) בכל צד של כל באר (ראו איור 1) באמצעות ברזל הלחמה צר.
      הערה: טפל בזהירות במגהץ ההלחמה החם ועבוד על מכסה אדים אם תרצה בכך כדי למנוע שאיפת אדים.
    2. השחיל זוג חוטי כסף או פלטינה (באורך של ~20 ס"מ) דרך הפתחים של כל באר (ראו איור 1). ניתן ליישם חומר דבק רב-פעמי (לדוגמה, BluTack) ליד הפתחים כדי לשמור על החוטים במקומם, ולהבטיח הפרדה של 1 ס"מ בין החוטים (ראו איור 1).
  2. ב-3 dpf, חלקו את הדגים לשלושה תנאים: מדיום דגים בקרה, לא פעיל, ולא פעיל+סטים.
    1. עבור קבוצות לא פעילות ולא פעילות+סטיים, מרדימים זחלים 72 שעות לאחר ההפריה (hpf) עם טריקאין (0.6 מ"מ).
      הערה: לאחר הפניה38, אליקוטים קפואים של מלאי טריאין מופשרים ומדוללים (40 μL/mL דגים בינוניים, לריכוז סופי של 0.6 mM) לפני שהם מוסיפים לדגים. אין להוסיף טריקאין ישר למים המכילים דגים, שכן חלק מהדגים עלולים לקבל מינונים גבוהים. יש להשתמש במלאי טריקאין תוך חודש ולעולם לא להקפיא אותו מחדש.
    2. עבור הדגים הבינוניים שליטה בדגים, השאירו אותם ללא הרדמה.
  3. במועדים נבחרים לאחר תחילת החשיפה לטריקיין (כלומר, ב-80 כ"ס), הכינו את קבוצת ה-Inactive+Stim לגירוי.
    1. הכינו 60 מ"ל של 2% אגרוז (1.2 גרם אבקת אגרוז ב-60 מ"ל של מדיום דגים), והמיסו את הקרח במלואו באמצעות מיקרוגל, מצננים, מוסיפים טריקאין ויוצקים 4 מ"ל לכל באר של תא הגירוי (איור 1).
    2. הוסיפו מיד מסרקים בעלי 4 בארות בהתאמה אישית בין האלקטרודות (שנוצרו על-ידי חיתוך פלסטיק (למשל, פוליפרופילן) במידות הרצויות והיצמדות זו לזו באמצעות Superglue; ראו איור 1). אפשר 10 דקות עד שהג'ל יתייצב. הסר מסרקים בזהירות כדי ליצור ארבע בארות מלבניות.
    3. מלאו כל באר במי טריקיין והניחו זחל אחד מורדם לא פעיל+סטיים בכל באר באמצעות מיקרו-פיפטה, כאשר הציר האנטרופוסטרי שלהם ניצב לאלקטרודות ( ראו איור 1).
    4. בדקו מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי המנתח אם כל דג מורדם במלואו בתוך כל באר של החדר.
  4. חברו מגרה אלקטרופיזיולוגי מתכוונן ליצירת תבניות לתא באמצעות בקר קוטביות, באמצעות קליפסים של תנינים המחוברים לכל אחת מהאלקטרודות בצד אחד של התא (ראו איור 1).
    הערה: בקר הקוטביות משמש להיפוך הקוטביות כל 5 שניות, כדי למנוע אלקטרוליזה וקורוזיה של האלקטרודות.
  5. לעורר דגים. לדוגמה, 1s עם רכבת של 200, 20 פולסים V, עם משך פולס 0.5 ms ו 4.5 ms הפרדת פולסים, פעם אחת כל 5 s נותן משטר יעיל התנגדות התכווצות טטנית חוזרת.
  6. בדוק באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר שהדגים מגרים; הגירוי החשמלי לדוגמה אמור לגרום להתכווצות דו-צדדית נראית לעין ולתנועה קלה, אחת ל-5 שניות.
  7. למשטר התנגדות/כוח גבוה, עוררו את הדגים בתדירות גבוהה למשך 5 דקות, שלוש פעמים, כאשר כל התקף מופרד על ידי 5 דקות של מנוחה.
    הערה: בזמן שדגים בצד אחד של התא נחים, ניתן לחבר את קליפס התנין לזוג האלקטרודות בצד השני של התא, והדגים הנוספים האלה מגורה.
  8. לאחר הגירוי, הסירו בזהירות דגים מכל באר על ידי שטיפתם בעדינות עם פיפטה מפלסטיק וחזרו לאינקובטור במדיום דגים טרי המכיל טריקאין.
  9. יש לשפוך את מי הטריקיין מתוך התא ולהשתמש במלקחיים כדי לחתוך ולהסיר את האגרוז מכל באר. שוטפים את הבארות במי ברז ומניחים להן להתייבש.
    הערה: אם משתמשים באלקטרודות של חוטי כסף, מדי פעם תחמוצת כסף עשויה להצטבר על פני השטח של החוט לאחר ניסוי גירוי. מכיוון שתחמוצת כסף פחות מוליכה מכסף, כדי לשמור על יכולת השחזור, שפשפו בזהירות את תחמוצת הכסף מהחוט באמצעות Kimwipes לפני השימוש מחדש בהתקנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידה מהירה ומדויקת של נפח הסומיט
מתוארת שיטה להכנת דגימה, איסוף נתונים וניתוח נפחי המאפשר מדידה מהירה של צמיחת שרירים בזחלי דגי זברה. ניתן למדוד את גודל השרירים בבעלי חיים באמצעות דגים המסומנים על קרומי הפלזמה שלהם באמצעות GFP ממוקד ממברנה (β-אקטין:HRAS-EGFP) או mCherry (α-אקטין:mCherry-CAAX). הזחלים הוחרמו באופן ארעי באמצעות טריקאין, הורכבו באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה והצטלמו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. סומיט 17 נבחר לניתוח גודל השריר לאור נגישותו בממשק תא המטען-זנב31. בפועל, כמו בתיאוריה, ניתן לחשב את נפח המיוטום כמכפלה של אורך מיוטום (L) וממוצע של שלוש מדידות שטח חתך (CSA) (איור 2A, המכונה שיטת 4 פרוסות).

כדי לאמת את השיטה הזו, התקבלו ערימות Z קונפוקליות שלמות של זחלי דגי זברה חיים (איור 2B), ונפח הסומיט חושב על ידי הכפלת סכום 17 אזורי הפרופיל של סומיט בכל פרוסה (80-100 פרוסות) במרחק בין פרוסות (1-1.2 מיקרומטר). נצפה מתאם חזק בין שיטות החישוב של 4 פרוסות וערימה מלאה (איור 2C). עם זאת, שיטת 4 הפרושים נתנה בדרך כלל הערכת נפח מעט גדולה יותר (~2% יותר בממוצע) (איור 2D). הבדל זה יכול לנבוע או א) שכחה של הדגימות הנותנות מדידת נפח גדולה בטעות או ב) התצפית כי מיוטומים של דגי זברה מתחדדים לאורך ציר האנטרופוסטריור, בהיותם קטנים יותר לכיוון זנב החיה. מכיוון שמדידות YZa, YZm ו-YZp CSA הן לכיוון החלק הקדמי של שברון הסומיט 17 מיוטום (איור 2A), הפרשנות האחרונה נבדקה על-ידי ניתוח נפחי של המיוטומים של הסומיטומים 16 ו-18. כל סומיט היה גדול בכ-7% מזה שמאחוריו (איור 2E). ניתוח נוסף גילה ששיטת 2 פרוסות הדורשת רק מדידת YZ אחת, הממוקמת במרכז הסומיט במקום שבו החצאים האפאקסיאליים וההיפאקסיאליים נפגשים במיוספטום האופקי (YZm), ופרוסת XY, נותנת הערכה מדויקת למדי של נפח המיוטום (איור 2F,G). גישת 2 פרוסות מאפשרת איסוף נתונים מהיר יותר כאשר אילוצי זמן מגבילים את מספר הדגים שניתן לסרוק. לסיכום, נתונים אלה מראים כי ניתן למדוד את נפח המיוטום במהירות ובדייקנות בזחלי דגי זברה חיים. זחלים בודדים נמדדו בהצלחה, שוב ושוב, במשך תקופה של 6 ימים בשיטה זו.

לצורך מחקר השוואתי של צמיחה של יחידת רקמה מזוהה, השיטה המתוארת מספקת הערכות נפח אמינות ומדויקות. עם זאת, כדי להשיג נפחים מוחלטים מדויקים, ניתן להחיל מספר שינויים. ראשית, ניתן לבצע תיקון לשגיאות הנגרמות על ידי הרכבה אלכסונית על ידי הטיית שלב המנה או המיקרוסקופ כדי להשיג פרוסות YZ ו - XY רוחביות טובות יותר במהלך ההדמיה או באמצעות שימוש בפרופיל נוטוכורד בפרוסות YS; הציר המשני בחתך מגלה את הקוטר האמיתי של הנוטוקורד הגלילי, ואילו הציר הראשי שלו חושף את הזווית והגודל של השכחה (ראו הערה בנקודה 4.6 לעיל). שנית, יש לבחור את המיקום של חיתוך XY ו - YZ במהלך הסריקה כדי לשקף, במדויק, את המיוטום(ים) הרצויים. (ראה הערה בנקודה 4.6 לעיל). שים לב, עם זאת, כי הצורה של שברון myotome משתנה בהתאם לשלב ההתפתחותי וזה חייב להילקח בחשבון בעת בחירת סריקות YS . לבסוף, כדי לקבוע אם שינויים במיוטום 17 משקפים צמיחת שרירים לאורך הציר, ניתן למדוד מיוטומים בהמשך לאזורי תא המטען או הזנב בשיטה המתוארת.

מדידות חוזרות ונשנות חושפות צמיחת סומיט
יתרון של השיטה המתוארת הוא הקלות של ניתוח חוזר על דג בודד. עוברים וזחלים בודדים יכולים להיות מוטמעים, נמדדים ומשוחררים שוב ושוב מבלי לסבול מהשפעות ארוכות טווח ברורות (איור 2H). המיוטום גדל באופן ניכר הן ב-L והן ב-CSA בין 2 ל-5 dpf, מה שמוביל לעלייה מתמדת בנפח (איור 2H). הצמיחה צולמה באופן זה בין 1 ל-8 dpf וגם הזחלים שוחררו לאחר ההדמיה וגדלו לבגרות. ניתוחים נוספים לתוך תקופת הזחלים המאוחרת צפויים להיות אפשריים, אם כי יהיה צורך לעקוב בקפידה אחר ההשפעות של הדמיה חוזרת ונשנית על התנהגות ההאכלה בהשוואה לאחים שאינם מצולמים. חשוב לציין שהתפתחות פיגמנטציה עלולה לטשטש את ההדמיה. בעוד שפיגמנטציה אינה מהווה בעיה בדגים בעלי אוריינטציה נכונה, מכיוון שפסי המלנופור אינם מונעים את המדידות הנדרשות, פיגמנט יכול להיות בעייתי יותר בדגימות רכובות אלכסוניות. השימוש בקווים מוטנטיים של פיגמנטציה, כגון roy;mitfa39, צפוי, מה שיאריך את חלון הזמן של מדידות הגדילה עד שיגיעו לגבולות עומק הסריקה הקונפוקלית המעשית.

יתרון נוסף של ההליך המתואר הוא הקלות של ניתוח מפורט של צמיחה של סיבים בודדים בהשוואה לכל מיוטום שלהם על פני תקופות קצרות. על-ידי סימון סיבים באמצעות הזרקת דנ"א, פותחה שיטה לאיתור רכישה גרעינית וצמיחה של סיבים בודדים שזוהו במשך 4 שעות, ולאחר מכן לאפשר ניתוח מחדש בזמנים מאוחרים יותר (איור 2I). יתר על כן, ניתן למדוד צמיחה של כל מיוטום במשך 12 שעות או פחות26 (ונתונים לא מוצגים). על ידי מדידה חוזרת ונשנית של אותם דגים, השונות בין האינדיבידואלים מתבטלת ומספר קטן של בעלי חיים יכול להניב תוצאות חזקות סטטיסטית26.

ניתן לזהות בקלות מניפולציות שמשנות את נפח הסומיט
הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לחקור שינויים בגדילת שרירים בתנאים ביולוגיים ופיזיולוגיים שונים, כגון שינויים בחוסר פעילות גופנית. טריקיין הרדמה, החוסם את פוטנציאל הפעולה העצבית על ידי עיכוב ערוצי Na+ 40 מגודרים במתח, שימש להשראת חוסר פעילות שרירים בזחלי β-אקטין:HRAS-EGFP . כפי שהוצג קודםלכן 26, חוסר פעילות במשך 24 שעות בין ה-dpf השלישי לרביעי הפחית מאוד את נפח המיוטום, מה שמצביע על כך שצמיחת שרירי הזחל תלויה בפעילות (איור 3A). ניתן לחקור את ההשפעה של חוסר פעילות גם באמצעות שיטות זיהוי אחרות שחושפות את מבנה הסומיט, כגון mCherry-CAAX (בקו מהונדס או בהזרקת mRNA) או על ידי טבילה לילית של זחלים בצבע BODIPY (איור 3A). הגישה השנייה, תוך הסרת הצורך לחצות דגים על רקע מהונדס או להזריק לעוברים אינה יכולה לשמש למדידות חוזרות ונשנות בשל רעילות של BODIPY. לפיכך, השיטה הנוכחית מאפשרת למדוד מחדש שינויים בנפח רקמת השריר.

כפי שתואר לעיל, ניתן להשתמש בשיטות סימון גנטיות כדי לבצע מדידות חוזרות ונשנות של נפח המיוטום, מה שמאפשר מעקב אחר שינויים בגודל השריר במשך ימים רצופים בדגים בודדים. מכיוון שדגים בודדים ודגים שלמים באותו שלב התפתחות נבדלים זה מזה בנפח המוחלט של המיוטום (איור 3A; אולי בגלל גודלן או בריאותן של ביצים), היכולת למדוד גדילה של כל פרט מפחיתה את ההשפעות של שונות אינדיבידואלית על-ידי התרת ניתוחים סטטיסטיים של דגימות מזווגות. מדידה חוזרת ונשנית של אותם דגים מפחיתה את מספר הדגים הדרושים לזיהוי השפעות חזקות. כדי להמחיש את האפקט הזה, התוצאות מניתוח הצמיחה של כל פרט מ-3 עד 4 dpf באוכלוסיות של זחלים פעילים ולא פעילים הושוו לניתוח של אותן שתי אוכלוסיות תוך שימוש רק במדד יחיד של גודל מיוטום שנעשה ב-4 dpf. מהשכבה לשכבה נצפתה שונות גדולה יותר בהפחתה לכאורה של גודל המיוטום כאשר מודדים את נפח המיוטום ב-4 dpf רק בהשוואה למדידת נפח של 4/3 dpf עבור כל פרט (איור 3B). שימו לב לטווח ההפחתה הגדול יותר (68%-91%) במדידות 4 dpf בלבד, בהשוואה לשיטת 4/3 dpf (78%-89%) והמתאם החלש בין שני המדדים. אף על פי שכצפוי, ההפחתה הממוצעת בכל 13 המשכפלים הביולוגיים הייתה דומה בכל הערכה (איור 3C) בהיותה 82.62 ± 1.01% (ממוצע ± SEM, n = 13) עבור שיטת 4/3 dpf ו- 82.31 ± 1.92% עבור שיטת 4 dpf בלבד, השגיאה המשוערת בשיטת 4 dpf בלבד הייתה כמעט כפולה מזו של שיטת 4/3 dpf. לפיכך, כימות גדילה אינדיבידואלית באמצעות מדידה חוזרת היא השיטה המדויקת יותר, על ידי ביטול השתנות הגודל בין הדגים באותה שכבה, כפי שהוכח קודםלכן 26. עם זאת, מכיוון שלא נצפה הבדל משמעותי בירידה בנפח המיוטום הנגרמת כתוצאה מחוסר פעילות כאשר מודדים את נפח המיוטום ב-4 dpf בלבד (איור 3C), הנתונים מצביעים על כך ש~6-8 דגים מספיקים כדי לממוצע את הפרש הגודל בין האינדיבידואלים בתוך שכבה בודדת. ברור שכאשר הגודל קטן שיטת 4/3 dpf עדיפה.

ניתוח הבסיס התאי של הצמיחה
Myotome CSA נקבע על ידי מספר סיבי שריר וגודל הסיבים. ניתן להעריך את מספר הסיבים על ידי ספירת מספר הסיבים המהירים והאיטיים בשלושה מקטעי YZ (YZ a, YZ m, YZ p). אף על פי שאזורים של שני מיוטומים סמוכים כלולים במקטעי YZ כאלה, כפי שמוצג על ידי נוכחות של מיוספטה אנכית (VM) ברוב המקטעים (איור 2A), ספירות אלה משקפות במדויק את מספר הסיבים. ספירת יתר מתרחשת ב-VMs עקב התחדדות של זוגות סיבים מכל מקטע סמוך ב-VM (איור 4A). ניתן להסביר ספירת יתר כזו באמצעות המשוואה הבאה: מספר סיבים = ספירת סיבים כוללת - (סיבים במגע עם VM) / 2 הפניה33. יתר על כן, ניתן לקבוע את נפח הסיבים הממוצע על ידי חלוקת נפח המיוטום במספר הסיבים. השתמשנו בניתוחים האלה כדי לגלות שהפעילות שולטת בשני ההיבטים התאיים של הגדילה (איור 4B,C).

מאיור 2A ניתן לראות שגודלם של הסיבים משתנה על פני המיוטום, מציאות שאינה משתקפת במדידות מחושבות של נפח סיבים ממוצע. על-ידי ציור סביב כל סיב של סומיט 17 משני דגים, נראה כי שטח חתך הסיבים שנמדד נע בין 28 מיקרומטר 2 ל-217 מיקרומטר2 (איור 4D). אולם במציאות, סיבים רבים נמצאים בזווית אלכסונית בתוך המיוטום, כך שמדדי CSA כאלה אינם משקפים את ה-CSA האמיתי של סיב בניצב לציר הארוך שלו. לעומת זאת, בשל הזוויות המשתנות של הסיבים בתוך המיוטום, לכל הסיבים הפועלים בכיוונים שאינם מיושרים באופן אנטרופוסטריורלי יש אורכים שונים מאורך המיוטום. למרות אזהרות אלה, אשר ניתן לעקוף רק על ידי סגמנטציה מלאה של היוטום לנפחי סיבים בודדים או על ידי חישוב לאחר מדידת זווית השכחה של כל סיב, CSAs שנמדדו מספקים הערכה של מגוון גודל הסיבים בכל דג. לדוגמה, סיבים בודדים ירדו ב-CSA עם חוסר פעילות, וכתוצאה מכך תזוזה שמאלה בעקומת התדר המצטברת ביחס לזחלי בקרה פעילים (לא מורדמים) (איור 4E). מכיוון שלדגים לא פעילים יש ~10 פחות סיבים מאשר לדגים פעילים (איור 4B), 10 הסיבים הקטנים ביותר מדגים פעילים שאינם מורדמים (בהנחה שהם החדשים) או 10 הגדולים ביותר (כקיצוניות החלופית) הושמטו מההשוואה, שהראתה שרוב אובדן נפח המיוטום נובע מחוסר צמיחת סיבים, במקום כישלון של היווצרות סיבים חדשים (איור 4F). יחד, נתונים אלה מראים כי השיטה המתוארת מאפשרת חקירה מפורטת של תפקיד הפעילות הגופנית על היווצרות וצמיחה של רקמת שריר.

הטלה מחדש של הפעילות על ידי גירוי חשמלי
פעילות גופנית נדרשת לגדילת שרירים (איור 3A). מתוארת שיטה לכפייה מחדש של התכווצויות שרירים על-ידי גירוי חשמלי בזחלים שאינם פעילים, מה שמעורר תגובה התכווצותית חזקה (איור 5A, קובץ משלים 8). למרות שפרמטרים מדויקים של גירוי מתוארים כאן (איור 5B) כדי להפעיל באופן מרבי את השרירים, ניתן לשנות את הפרוטוקול (על ידי שינוי משרעת זרם, תדירות, משך דופק וכו') כדי לשלוט בהפעלת השרירים ובמינון האימון. לפיכך, השיטה הנוכחית מספקת גירוי פעילות מבוקר עם התנהגות סטנדרטית בין התקפי פעילות, תוך התגברות על מגבלה חשובה של מודלים חייתיים עכשוויים של פעילות גופנית18.

השיטות המתוארות מדגימות את הפוטנציאל של שימוש בזחלי דגי זברה כדי לחקור היבטים שונים של צמיחת שרירים (למשל, היפרפלזיה והיפרטרופיה). בפרט, מיוגנזה בזחלי דגי זברה הוכחה כנוחה לניתוח באמצעות חוסר פעילות הנגרמת על ידי פרמקולוגית והתכווצות הנגרמת על ידי חשמל. הגישה מאפשרת לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם פעילות גופנית מובילה לצמיחת שרירים in vivo.

Figure 1
איור 1: תכנון תא גירוי להחדרה מחדש של הפעילות החשמלית של השרירים לזחלי דגי הזברה. צלחת תרבית תאים בעלת 6 בארות המצוידת באלקטרודות מאפשרת תחזוקה של הזחלים בבארות המיוצרות בתוך 2% ג'ל אגרוז. מסרקים מותאמים אישית של 4 בארות מיוצרים כדי ליצור בארות מלבן (מידות כפי שצוין) באגרוז כדי לשמור על המיקום והכיוון של זחלי דגים בודדים, וכדי למנוע מהם לבוא במגע עם חוטי הכסף במהלך עוויתות נמרצות על גירוי חשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מדידת נפח השרירים בדגי זברה חיים α-אקטין:mCherry-CAAX (A,B,E) או β-אקטין:זחלים מהונדסים HRAS-EGFP (H,I). הזחלים בתמונה ממבט לרוחב ומוצגים גב למעלה, קדמי לשמאל בלוחות עליונים (A,B,E). (A) בשיטת 4 פרוסות, נפח מיוטום חושב על ידי הכפלת אורך הסומיט 17 (L) שנמדד בין מיוספטה אנכית (VM) במישור XY (חץ כחול) בממוצע של שלושה אזורי חתך (CSA) שנמדדו במישורי YZ (YZm, YZa ו-YZp; קווים צהובים מקווקווים). (B) בשיטת Full Stack נמדד השטח של סומיט 17 מיוטום (דוגמאות המתוארות בצהוב) בכל פרוסה של ערימת Z שלמה של זחל דג זברה חי וסכום האזורים המיוטומליים הוכפל במרחק בין פרוסות. (C) קונקורדנציה גבוהה בין השיטות 4 פרוסות ו-Full Stack. צבעים מציינים דגי β-אקטין בודדים:HRAS-EGFP (ריבועים) או α-אקטין:mCherry-CAAX (עיגולים). (D) נפח Myotome הוא מעט, אך משמעותי, גדול יותר כאשר מחושב בשיטת 4 פרוסות. (E) בזחלי דגי הזברה המתחדדים, יותר סומיטים קדמיים גדולים יותר מסומיטים אחוריים, כפי שנמדד בשיטת 4 פרוסות. (ו,ז) מתאם חזק בין מדידות נפח שבוצעו באמצעות ממוצע של שלושה מקטעי CSA (שיטת 4 פרוסות) או שיטת YZm CSA אחת (שיטת 2 פרוסות). ערכי p מראים תוצאות של שני מבחני t זנביים עם שונות שווה (D,G) או ANOVA חד-כיווני עם מבחני בונפרוני לאחר הוק (E). ns, לא משמעותי. (H) מדידת נפח מיוטום 16, אורך (L) ושטח חתך (CSA) מ-2 עד 5 dpf בשלושה דגים בודדים (צבעים) המבטאים β-אקטין:HRAS-EGFP ומיוג:H2B-mRFP. תמונות YZm של האדם הירוק בכל נקודת זמן מוצגות לעיל. (I) גידול סיבים בודדים הנמדד על ידי סגמנטציה אוטומטית של סף קבוע. דג β-אקטין:HRAS-EGFP;מיוג:H2B-mRFP המסומן בפסיפס על ידי הזרקת פלסמיד CMV:Cerulean בשלב 1-2 תאים. סיב Cerulean יחיד המסומן בסומיט 10 נסרק בערימות XYZ מלאות ברזולוציה גבוהה שוב ושוב על גבי Zeiss LSM880. התמונות המוצגות הן פרוסות בודדות מייצגות (משמאל) והקרנה של הנפח המקוטע התלת-ממדי (מימין). כל נקודת נתונים בגרף מייצגת סריקה יחידה של אותו סיב, ב- 3 dpf (0 שעות), לאחר 4 שעות וב- 5 dpf (54 שעות). סריקות משולשות נעשו ופולחו לפי נקודת זמן כדי להראות יכולת שכפול. ראשי חץ לבנים מצביעים על גרעיני סיבים; שים לב ששני גרעינים מתווספים בין 3 ל-5 DPF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: גדילת שרירים תלויי פעילות בסומיט 17. (A) עיכוב פעילות למשך 24 שעות על ידי מריחת טריקיין (ורוד) בין 3 ל-4 dpf מפחית את נפח המיוטום הן בקווים מהונדסים והן בדגים לא מהונדסים המוכתמים ב-BODIPY בהשוואה לבקרות רכב על אחים (כחול). נפח מכומת בשיטת 4 פרוסות. צורת הסמל מציינת ניסויים משוכפלים מתוך שכפלים נפרדים (שכפולים ביולוגיים). סמלים גדולים מציינים ערכי SEM ממוצעים ±. סמלים קלושים קטנים מראים את נפחם של זחלי שכפול בודדים. (B) השוואה של הפחתת נפח מיוטום בדגים לא פעילים בהשוואה לאחים לבקרה שנקבעה על ידי מדידה יחידה של נפח מיוטום ב-4 dpf (4 dpf בלבד, סכמת עליונה) או שינוי בנפח מיוטום בין 3 ל-4 dpf (4/3 dpf, סכמות תחתונות). כל סמל מייצג את הנפח הממוצע של מיוטום 17 ב~5 דגים לא פעילים משכבה אחת חלקי המיוטום הממוצע 17 נפח של ~5 אחים בקרה פעילים. (C) לא נצפה הבדל בירידה הממוצעת בגדילת השרירים בדגים לא פעילים, כאשר מודדים בשיטות של 4 dpf בלבד או 4/3 dpf. המספרים בתוך החטיפים מייצגים את המספר הכולל של הדגים שנותחו. ערכי p מראים תוצאות של ANOVA דו-כיווני עם מבחני בונפרוני לאחר הוק (A) או שני מבחני t זנביים עם שונות לא שווה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: שינויים ברמת התאים בגדילת השרירים נגרמים על-ידי חוסר פעילות. (A) סכמטי המראה כיצד ספירת יתר מתרחשת ב-VMs עקב ספירה כפולה של סיבים מתחדדים במקום שבו מיוטומים כחולים ואדומים נפגשים. שים לב שספירת הסיבים הממוצעת היא 6 אך הערך הממוצע האמיתי הוא 5.5. הספירה המתוקנת נותנת קירוב טוב יותר. (ב,ג) מספר הסיבים (B) ונפח הסיבים הממוצע (C) מופחתים בזחלים לא פעילים (ורודים) בהשוואה לזחלים פעילים (bue). צורת הסמל מציינת ניסויים משוכפלים מתוך שכפלים נפרדים (שכפולים ביולוגיים). סמלים גדולים מציינים ערכי SEM ממוצעים ±. סמלים קלושים קטנים יותר מראים את הערך של זחלים משוכפלים בודדים. המספרים בתוך החטיפים מייצגים את המספר הכולל של הדגים שנותחו. (D) בזחלים בודדים, כל פרופיל סיבים במיוטום 17 סומן ו-CSA נקבע. תיבות מציגות ממוצע ± SEM. ערכי p מציגים תוצאות של ANOVA דו-כיווני עם מבחני בונפרוני לאחר הוק (B,C) או שני t-test זנב עם שונות שווה (D). (ה,ו) עקומות תדר מצטברות המציגות התפלגות גודל סיבים בזחלים פעילים (כחולים) ולא פעילים (ורודים). השוואה של כל הסיבים (E), או לאחר השמטה של סיבים קטנים ככל הנראה, או, בקצה החלופי, סיבים גדולים (F) מראה כי גודל הסיבים גדל, לא עלייה במספר הסיבים, בעיקר חשבונות לצמיחה מונעת פעילות של מיוטום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: גירוי חשמלי קצר מעורר התכווצויות שרירים טטניים בזחלי דגי זברה מרדימים. (A) תמונות עוקבות (שצולמו מתוך וידאו בקובץ משלים 8) המראות כיצד גירוי חשמלי מפעיל התכווצויות מקסימליות של זחל מורדם ב-3 dpf. סולם זמן בשניות. תיבות אדומות מציינות תנועות בתחילת שלוש רכבות גירוי רצופות של 1 שניות. כל תמונה היא חשיפה של 40 אלפיות השנייה. (B) סכמטי המציג את משטר הגירוי החשמלי, שבו ניתנת רכבת 1 s של 200 דחפים חשמליים בתדר גבוה, 20 וולט כל 5 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: סכמות של תמונות שצולמו בצורה מושלמת (למעלה משמאל) וזחלים המותקנים בצורה לא מושלמת ביחס למסגרת הייחוס של המיקרוסקופ XYZ (צירים שחורים). מיוטום (ירוק), נוטוכורד (צהוב), צינור עצבי (שזוף), פרמטרים מיוטומליים נמדדים (אדום), פרמטרים נוטוכורד נמדדים (חיצים שחורים), וסיבובים אפשריים או ממשיים של דגים (כחול). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: צילום מסך המציג מדידת אורך סומיט מתמונות XY בזן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: צילום מסך המציג מדידת CSA מתמונות YZ בזן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: צילום מסך המציג מדידת אורך סומיט מתמונות XY בפיג'י / ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים: צילום מסך המציג חילוץ של פרמטרי כיול עבור תמונות YZ מ- ZEN. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: צילום מסך המציג כיול של תמונות YZ בפיג'י/ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: צילום מסך המציג מדידת CSA מתמונות YZ בפיג'י / ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 8: סרטון מייצג המציג התכווצות שרירים המתעוררת על ידי גירוי חשמלי ישיר (אורך 1 שניות) של זחל 3 dpf שהורדם על ידי טריקאין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מדווחים על שיטה להערכה מדויקת ויעילה של נפח השריר של זחלי דגי זברה חיים בשלבים או בגרסאות גנטיות שבהן פיגמנטציה אינה מהווה מכשול גדול להדמיה וכאשר הרדמה חולפת ו/או אימוביליזציה נסבלת היטב. בעוד שהשתמשנו במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, הגישות המתוארות ישימות למיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב או גיליון אור ולכל שיטה אחרת היוצרת ערימות של תמונות במישורי מוקד נפרדים. מתוארת סדרה של גישות מתוחכמות יותר ויותר להערכת גודל רקמות ותכולת תאים. לכל שיטה יש יתרונות ומגבלות, שאנו מראים שניתן לכמת. מגבלה מרכזית בחקר גדילת רקמות היא הקושי לנתח שינויי גדילה בזמן אמת כאשר קצבי הגדילה משתנים בתגובה לסדרה של אירועים מולקולריים או תת-תאיים המזורזים על ידי גירויים הניתנים באופן חריף. יתר על כן, שונות אינדיבידואלית יכולה ליצור בעיות כאשר משווים אנשים נפרדים. הגישה הנוכחית מאפשרת מדידה של צמיחת רקמות על פני תקופות של פחות מיום אצל אנשים חיים בודדים. יישום הגישה ניתן לחזות על ציר הזמן הדק.

השיטות המתוארות מאפשרות ניתוחים שלא היו מעשיים עד כה. באמצעות שיטת 4 פרוסות, ניתן להשלים את חלק ההדמיה של בדיקת גדילת השרירים על גודל מדגם של כ-20 דגים תוך שעה על ידי מפעיל מיומן. זאת בניגוד גמור לשיטת Full Stack המקובלת, שלוקחת לפחות 3 שעות עבור אותו מספר דגים (כלומר, פי שלושה יותר). אם נדרשות תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוחים תת-תאיים עוקבים, שיטת Full Stack יכולה בקלות לדרוש 30 דקות לכל דג, מה שהופך את מבחני הגדילה של קבוצות בעלי חיים בשלב התפתחותי דומה לבלתי אפשריים. לעומת זאת, שיטות 2 או 4 פרוסות מאפשרות לכידת תמונה מהירה באיכות גבוהה. אם נעבור לשיקול של ניתוח תמונה, היתרונות של שיטת 2 או 4 פרוסות בחיסכון בזמן המפעיל (בהיעדר סגמנטציה אוטומטית של תמונות) על פני שיטת Full Stack הם עצומים. כל דג דורש כ-20 דקות לניתוח Full Stack, אך רק 3-4 דקות לניתוח של 4 פרוסות. ניתן לשמר עוד יותר את זמן המפעיל בשיטת 2 פרוסות כמעט מדויקת. לפיכך, השיטה המתוארת יעילה ובכך מגבירה את הגמישות בתכנון הניסוי.

המגבלה העיקרית של שיטות 4 או 2 פרוסות היא ששתי השיטות הן הערכות, בשל צורת השברון החופפת של הסומיטים (למשל, נפח האזורים של שני סומיטים שכנים (למשל, מיוטום 16 ו-17). זה נראה כי זה יכול להעריך יתר על המידה את נפח מיוטום 17 בפועל על ידי כ -2%, תלוי בדיוק היכן נבחרו פרוסות YZ . יתר על כן, מעקב ידני אחר גבולות הסומיט במהלך המדידות עשוי לתרום לשינויים באומדנים, אם כי נמצא הבדל קטן בין הניסויים (הנתונים לא מוצגים). ניתן לטפל בשגיאות מדידה באמצעות אלגוריתמים של סף, סינון וסגמנטציה כדי לרכוש שטח פנים באופן אובייקטיבי יותר וניתן לשחזור. עם זאת, עדיין יידרשו התאמות אישיות כדי לקחת בחשבון את השונות בפלואורסצנציה ברקע (למשל עקב הטבעה ו/או עובי של ה-LMA) ואת רמת הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים של זחלים בודדים לאורך זמן. שים לב שמדידות אוטומטיות כאלה יהיו מאתגרות עוד יותר אם ייעשה שימוש במדווח שאינו ספציפי לשרירים, כגון קו β-actin:HRAS-EGFP . עם זאת, בנסיבות רבות, למשל, כאשר משווים השפעות של מניפולציות בין דגים הנתונים לטיפולים שונים הצפויים להשפיע על כל רקמת השריר, חוסר הדיוק עשוי להיות לא מהותי. עם זאת, אם נדרש דיוק מרבי להשוואה לסיבים או למספרים גרעיניים הנספרים אך ורק ממיוטום 17, למשל, ניתן לשפר את שיטות ה'פרוסה'. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בשיטת Full Stack המפרך, על ידי תיקון מתמטי על ידי הכפלת נפחי 4 הפרושים שנמדדו ב-0.98, או על ידי הזזת המיקום של סריקות YZ CSA לאחור כדי לשקף בצורה מדויקת יותר את ה-CSA האמיתי של מיוטום 17.

מגבלה שנייה של השיטה היא רגישותה לכיוון ההרכבה של הדג. בפועל, מפעילים מיומנים יכולים לכוון דגים בגבולות סבירים רוב הזמן, גם כאשר הם עובדים במהירות להטמעת דגימות רבות. ניתן לחזות שינויים בציוד בשלב המיקרוסקופ שיאפשרו תיקון של פיהוק וגליל לפני הסריקה. ללא מנגנון כזה, מתוארת שיטה לכימות התמצאות שגויה שניתן להשתמש בה כדי לתקן את הנפחים הנמדדים. יתר על כן, גם אם התמצאות שגויה מגדילה את השונות בנפח הנמדד, ובכך מקטינה את הסיכוי לתצפית על גדלי אפקטים קטנים, במצבים רבים שונות כזו תשפיע באופן דומה על דגימות בקרה וניסוי. כך שתוצאות חיוביות שגויות אינן סבירות, אם המפעילים מודעים לבעיה.

השיטות המתוארות יושמו בתחילה כדי לנתח את תפקיד הפעילות החשמלית בצמיחת שרירים, נושא עם היסטוריה ארוכה של ניתוח במגוון רחב של מינים (שנסקרו בשנת18). לשם כך, שיטות פשוטות לחסימת פעילות המופעלת באופן אנדוגני מתוארות בפירוט ומוחלפות בגירוי חשמלי מבוקר בזחל דגי הזברה. היתרונות של גישה זו הם הסרת בקרות משוב עצביות40, חיסול ההשפעות של תזונה משתנה והיכולת לנתח השפעות היממה על הצמיחה עצמה, ולא על פרוקסי גדילה, כגון תחלופת חלבון26. מכיוון שדפוסים שונים של פעילות חשמלית מעוררים תגובות שרירים שונות, מווסתים את סוג הסיבים, גודלם וחילוף החומרים 41,42,43,44,45,46,47,48, השיטות הנוכחיות פותחות את דגי הזברה לניתוחים כאלה.

השיטות המתוארות מציעות חבילת טכניקות שבהן ניתן לנתח היבטים רבים של פיזיולוגיה של השרירים, ביולוגיה של התא ופתולוגיה ברזולוציה טמפורלית ומרחבית חסרת תקדים על ידי ניצול דגי הזברה שטרם נחקרו יחסית. הגישות הנוכחיות יכולות להיות מיושמות בבירור על מינים אחרים, אזורים בגוף ושלבי התפתחות. הצמיחה המוקדמת המהירה של זחלי דגי זברה הופכת את הגילוי של השפעות חריפות של מניפולציות על צמיחת רקמות ומורפוגנזה לאזורי מחקר אטרקטיביים במיוחד. יתר על כן, שריר דג הזברה נמצא כשותף למנגנוני גדילה ובקרות שונים עם יונקים. בעוד שדגי זברה הם בעלי חוליות המשמרים היבטים רבים של גנטיקה מולקולרית של שרירים, תאים וביולוגיה התפתחותית עם בני אדם, ישנם גם הבדלים משמעותיים בשליטה על גדילת השרירים. לדוגמה, סוגי סיבים איטיים ומהירים מופרדים מרחבית בצורה ברורה יותר בדגים והעצבנות של השרירים מראה הבדלים. יתר על כן, יש לזכור כי עד כה, הצלחנו רק לנתח את השלבים המוקדמים של הפיתוח. ניתוחים דומים בשלבים מאוחרים יותר צפויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים חבים חוב עמוק למאמציהם של חברי המעבדה של יוז, ד"ר סיטראמיה אטילי, יאנה קות', פרננדה בג'נקה, ויקטוריה ויליאמס, יניב היניטס, ג'ורג'יה ברגמין וולדימיר סנטקוב לפיתוח הפרוטוקולים המתוארים, ולהנרי רוהל, כריסטינה האמונד, דייוויד לנגנאו ופיטר קארי על שיתוף פלסמידים או קווי דגי זברה. SMH הוא מדען של המועצה למחקר רפואי (MRC) עם מענק תוכנית G1001029, MR/N021231/1 ו-MR/W001381/1. תואר שני החזיק בתוכנית הכשרה לדוקטורט MRC מקינגס קולג 'בלונדון. עבודה זו נהנתה מהקלט הטריגונומטרי של דייוויד מ. רובינסון, חוקר, מנטור וחבר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive, Blu Tack Bostik - -
Aerosol vacuum  - - -
Agarose Sigma-Aldrich A9539 -
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414 Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater Cole-Parmer SBH130 -
BODIPY FL C5-ceramide Thermo Scientific D3521 To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires - - -
Fiji/imageJ National Institutes of Health, NIH - -
Fish medium, Fish water - - Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium - - E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope Leica Leica MZ16F Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle World Precision Instruments, Inc. 1B100-6 To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator Grass Instruments S88 Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 13258179 -
Laser scanning microscope (LSM)  Zeiss Zeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		 LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate Thermo Scientific 140675 -
Objective, 20×/1.0W water immersion Zeiss - -
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL Starlab Group E1414-0100 -
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL Starlab Group E1414-1100 -
Petri dish, 60 mm Sigma-Aldrich P5481 -
Plasmid, CMV-Cerulean Christina L. Hammond (University of Bristol) pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX Henry Roehl (University of Sheffield) - For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller  Hoefer Scientific Instruments PC750 -
Soldering iron - - -
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc - -
Watchmaker forceps, No. 5 - - -
Wire, Platinum Goodfellow PT005142/12 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver Acros Organics 317730010 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) - ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) - ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP - - ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software Zeiss - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 184
מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, … More

Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity. J. Vis. Exp. (184), e64063, doi:10.3791/64063 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter