Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64063
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London
* These authors contributed equally

Summary

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Abstract

Se pueden utilizar varios métodos para visualizar células individuales en todo el cuerpo de peces cebra embrionarios vivos, larvales o juveniles. Mostramos que los peces vivos con membranas plasmáticas marcadas con fluorescencia se pueden escanear en un microscopio de escaneo láser confocal para determinar el volumen de tejido muscular y el número de fibras musculares presentes. Se describen y validan enfoques eficientes para la medición del número y tamaño de células en animales vivos a lo largo del tiempo contra métodos de segmentación más arduos. Se describen métodos que permiten el control de la actividad eléctrica muscular y, por lo tanto, contráctil. La pérdida de la actividad contráctil del músculo esquelético redujo en gran medida el crecimiento muscular. En larvas, se describe un protocolo que permite la reintroducción de la actividad contráctil evocada eléctricamente modelada. Los métodos descritos minimizan el efecto de la variabilidad interindividual y permitirán el análisis del efecto de estímulos eléctricos, genéticos, farmacológicos o ambientales en una variedad de parámetros de crecimiento celular y fisiológico en el contexto del organismo vivo. Posteriormente se puede realizar un seguimiento a largo plazo de los efectos medidos de una intervención definida en los primeros años de vida en los individuos.

Introduction

El crecimiento regulado del tejido, que comprende el aumento del número de células (hiperplasia) y / o el tamaño de las células (hipertrofia), es un factor crucial en el desarrollo, la regeneración y la adaptación ecológica y evolutiva. A pesar de los enormes avances en la comprensión genética molecular de la biología celular y del desarrollo en las últimas décadas, la comprensión mecanicista de la regulación del tamaño de los tejidos y órganos todavía está en su infancia. Una de las razones de esta laguna en el conocimiento es la dificultad de cuantificar el crecimiento de tejidos en organismos vivos con la precisión espacial y temporal necesaria.

Varios aspectos del crecimiento de organismos enteros se pueden medir repetidamente a lo largo del tiempo, revelando curvas de crecimiento para cada individuo 1,2,3,4,5. Los métodos de exploración cada vez más sofisticados, como la absorciometría dual de rayos X (DXA), la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM), permiten el seguimiento del crecimiento de órganos completos y otras regiones del cuerpo (por ejemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) en individuos individuales, tanto humanos como en organismos modelo 6,7,8,9,10 . Sin embargo, estos métodos aún no tienen la resolución para revelar células individuales y, por lo tanto, los vínculos entre los comportamientos celulares y el crecimiento a nivel de tejido han sido difíciles de discernir. Para establecer tales vínculos, los estudios tradicionales a menudo se han basado en cohortes de animales individuales similares, algunos de los cuales se sacrifican en puntos de tiempo sucesivos y luego se analizan en detalle citológico. Tales enfoques requieren promediar los cambios observados entre grupos de individuos (preferiblemente similares, pero no obstante variables) y, por lo tanto, sufren de una falta de resolución temporal y espacial, lo que dificulta encontrar eventos correlacionados a nivel celular que sugieran causa y efecto.

Los estudios sobre organismos modelo de invertebrados, inicialmente en C. elegans y D. melanogaster, han eludido estos problemas mediante el desarrollo de microscopía óptica para lograr la resolución celular y medir con precisión el crecimiento a lo largo del tiempo en individuos individuales. Tales estudios han revelado comportamientos de linaje celular sorprendentemente invariantes en el crecimiento de estos pequeños organismos modelo 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, muchos animales, incluidos todos los vertebrados, tienen linajes celulares indeterminados y controlan el crecimiento de los tejidos mediante misteriosos procesos de retroalimentación que sirven para convertir el programa de crecimiento codificado genéticamente en un organismo tridimensional funcional con todos sus tejidos y órganos constituyentes adecuadamente emparejados en tamaño. Para comprender estos complejos procesos de crecimiento, es deseable obtener imágenes de tejidos u órganos completos a lo largo del tiempo en individuos individuales que puedan manipularse experimentalmente mediante intervenciones genéticas, farmacológicas u otras en el momento de su elección y el efecto se analice posteriormente.

Cada músculo esquelético vertebrado tiene un tamaño, forma y función definidos, e interacciones bien caracterizadas con tejidos adyacentes, como huesos, tendones y nervios. Algunos músculos son pequeños, se encuentran justo debajo de la piel y, por lo tanto, son buenos candidatos para estudios de imágenes de alta resolución. Al igual que la mayoría de los órganos, cada músculo crece a lo largo de la vida embrionaria, postnatal y juvenil, antes de alcanzar un tamaño adulto estable. El músculo, sin embargo, también tiene una capacidad única para cambiar de tamaño durante la vida adulta, dependiendo del uso y la nutrición18, y esta propiedad tiene un gran impacto en la aptitud del organismo, el rendimiento deportivo y la vida independiente. La pérdida de masa muscular y de función en la vejez, la sarcopenia, es un tema de creciente preocupación para las sociedades que se enfrentan a una población envejecida 19,20,21.

Nosotros y otros nos hemos centrado en el crecimiento de bloques definidos de tejido muscular esquelético en el cuerpo segmentariamente repetitivo de larvas de pez cebra, como un sistema aparentemente cerrado que contiene varios cientos de células en las que se puede observar y manipular el crecimiento, mantenimiento y reparación de tejidos 22,23,24,25,26. Si bien se ha informado previamente de algunos trabajos cuantitativos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, no se dispone de un método detallado y validado para medir el crecimiento muscular en detalle celular en organismos vertebrados individuales a lo largo del tiempo. Aquí se describe un protocolo eficiente sobre cómo realizar tales mediciones repetidas, junto con la validación, y se proporciona un ejemplo de su uso para analizar los cambios en el crecimiento hipertrófico e hiperplásico en respuesta a la actividad eléctrica alterada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toda la investigación descrita se realizó de conformidad con las directrices institucionales y bajo licencias adecuadas del Ministerio del Interior del Reino Unido de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y modificaciones posteriores. Los embriones/larvas deben criarse a 28,5 °C hasta completar la gastrulación, pero luego pueden mantenerse a 22-31 °C para controlar la velocidad de desarrollo. El pescado puede ser escaneado o estimulado a temperatura ambiente.

1. Anestesiar larvas de pez cebra

  1. Cruza peces adultos reporteros fluorescentes adecuados como Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referencia 36 o Tg(α-actina:mCherry-CAAX)pc22Tg referencia37 y recolecta embriones como se describe38.
  2. En el momento de la elección, como 2 días después de la fertilización (dpf), anestesiar brevemente los embriones utilizando un medio de pescado que contenga tricocaína (ya sea agua de pescado o medio E3) y detectar EGFP o mCherry bajo un microscopio de fluorescencia, como un Leica MZ16F. Si uno tiene muchos embriones, seleccione aquellos con la señal más brillante. Devolver los embriones al medio normal de pescado inmediatamente después del cribado.

2. Montaje de peces para escaneo confocal

  1. Encienda el sistema de escaneo láser confocal y los láseres, para permitir que el sistema se estabilice durante 30-60 minutos.
    NOTA: Aquí, utilizamos un microscopio Zeiss LSM 5 Exciter con soporte de materiales verticales (que mejora la distancia de trabajo) equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x / 1.0 W.
  2. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% (LMA) y manténgala en un bloque de calor a 37 °C para uso repetido en un tubo de 1,5 ml. Para evitar el choque térmico, retire la alícuota LMA del bloque de calor y déjela enfriar justo por encima del ajuste antes de aplicarla a la larva, probando contra la piel para juzgar la temperatura adecuada, como cuando se evalúa la temperatura de la leche de fórmula para bebés.
  3. Seleccione los peces que se montarán y anestesiar transitoriamente cada pez a su vez con Tricaine (0,6 mM en medio de pescado).
  4. Tome una placa de Petri de 60 mm de diámetro que haya sido recubierta con una capa de agarosa al 1% y colóquela en el escenario de un microscopio de disección.
  5. Transfiera la larva con una pipeta de plástico Pasteur de 1 ml a la placa de Petri recubierta de 60 mm y retire la mayor cantidad posible de medio transferido. Luego, aún usando la pipeta Pasteur, coloque de 5 a 10 gotas de LMA sobre el pez y colóquelo rápidamente horizontalmente en vista lateral con pinzas (o una aguja de vidrio fino pulido al fuego) antes de que la LMA se asiente. Para obtener imágenes óptimas, es deseable colocar la larva cerca de la superficie superior de la LMA.
    1. Alternativamente, utilizando una pipeta Pasteur de plástico de 1 ml, recolecte la larva con el menor medio de pescado posible y transfiera la larva a la alícuota de LMA enfriada. Permita que la larva se hunda durante 5 s para que quede completamente rodeada por LMA. Luego, recupere la larva y transfiérala en una gota de LMA a la placa de Petri recubierta de agarosa. Oriente y posicione rápidamente la larva como se describió anteriormente.
  6. Orientar la larva con sus ejes anteroposterior y dorsoventral dentro de los 10° de la horizontal (véase la nota «Sobre el error y su corrección», en el punto 4.6).
    1. Si la larva no está correctamente montada horizontalmente cerca de la superficie de la gota de agarosa, retire y vuelva a incrustar. Las larvas se pueden recuperar fácilmente mediante succión suave con una pipeta microfina de plástico Pasteur de 1 ml, y la LMA se puede eliminar suavemente con Kimwipes. La práctica realmente hace perfecto en el procedimiento de montaje; Pase una tarde incrustando algunas larvas sin importancia antes de probar esto en un experimento real.
      NOTA: Sobre el diseño del microscopio: Muchos laboratorios utilizan microscopios confocales invertidos para obtener imágenes a través de un cubreobjetos. Hemos encontrado que la incrustación repetida y la eliminación de peces mantenidos en agarosa bajo un cubreobjetos para su observación en un microscopio invertido conduce a una mayor pérdida de muestras durante el escaneo repetido que en el procedimiento descrito con un microscopio vertical. Por esta razón, se recomienda el uso de un sistema vertical, si está disponible. Sin embargo, una clave para los datos de alta calidad es la selección y el uso adecuados de parámetros objetivos y de escaneo, un tema demasiado grande para discutirlo aquí.

3. Escaneo confocal

  1. Cuando la LMA se haya fijado, inunde el plato con alrededor de 10 ml de medio de pescado que contenga tricocaína. Si planea capturar pilas confocales, deje que el pez montado descanse durante al menos 10 minutos antes de proceder al escaneo, ya que se produce algo de hinchazón de agarosa.
  2. Cargue el plato de muestra en la etapa del sistema confocal, localice la larva y concéntrese en el somita deseado. Se puede elegir Somite 17 debido a su facilidad de localización cerca del respiradero anal y facilidad de obtención de imágenes. Verifique contando somitas desde anterior.
    NOTA: El primer somite está fusionado detrás de la oreja y no tiene borde anterior, pero se puede observar fácilmente que tiene fibras musculares estriadas.
  3. Configure como si fuera a capturar una pila Z definiendo la parte superior (es decir, justo encima de la piel) y la parte inferior (es decir, justo debajo de la notocorda, para incluir todo el somite, incluso si el pez está montado ligeramente sesgado). Tanto el lado izquierdo como el derecho se pueden capturar como se desee. Esto asegurará que todos los escaneos rápidos de YZ capturen la(s) región(es) deseada(s).
  4. Capture una imagen XY de la siguiente manera. Oriente el área de escaneo con respecto a los peces, según lo permita el software confocal. Coloque el pez con el eje anteroposterior paralelo al eje X de la imagen y el eje dorsoventral paralelo al eje Y con somita 17 en el centro del campo, como se muestra en el Archivo complementario 1. Concéntrese en un plano de nivel medio en el miotomo superior en el que todas las mitades de somite epaxial e hipaxial junto con los mioseptos verticales y horizontales sean visibles y capture una imagen XY de alta resolución. Recuerde nombrar y guardar la imagen.
  5. Capture una o más imágenes YZ de la siguiente manera. En los Resultados representativos (a continuación) se compara la precisión de los métodos de 2 y 4 cortes. En el enfoque de 2 cortes, se emplean escaneos XY e YZ individuales. En el enfoque de 4 cortes, se promedian tres escaneos YZ para dar una estimación más precisa del volumen del miotoma. Si el software confocal lo requiere, vuelva a orientar el campo de escaneo.
    1. Dibuje una línea dorsal a ventral precisa a través del somite elegido perpendicular al eje anteroposterior del pez en una posición anteroposterior seleccionada. Realice un escaneo de línea Z-stack.
    2. Repita la exploración de la línea YZ tres veces en posiciones anteroposteriores definidas a lo largo del miotomo seleccionado para capturar YZa, YZm e YZp. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Asigne un nombre y guarde estas imágenes junto con la imagen XY relacionada.
      NOTA: En la selección de planos YZ: El miotomo tiene forma de V y su forma cambia durante el crecimiento. Para obtener la evaluación más precisa del volumen del miotomo 17 con el método de 4 cortes, coloque YZa en la punta anterior del miotomo, YZp en las puntas posteriores del miotomo en los extremos dorsal y ventral, e YZm a medio camino entre YZa e YZp. Suponiendo que el somite se estrecha uniformemente, la media de las mediciones de cada sección YZ representará el miotomo como un todo. Para el método de 2 cortes, la exploración YZ única debe colocarse en el extremo posterior del miotabique horizontal, que corresponde aproximadamente al centro anteroposterior del miotomo de interés (como YZm). Alternativamente, se puede tomar un conjunto de tres secciones YZ en la parte anterior, media y posterior del miotabique horizontal, pero, como se muestra a continuación, dicha medición sobrestimará ligeramente o subestimará el volumen del miotomo (para somitas rostral y caudal, respectivamente, debido a la disminución gradual del miotoma). Fundamentalmente, la consistencia en el posicionamiento de los planos de corte YZ entre los peces y los experimentos es clave para la reproducibilidad.

4. Análisis

  1. Como el miotomo cambia de tamaño a lo largo del pez de manera gradual, siempre trabaje con el mismo somite en estudios comparativos.
  2. Para medir y calcular el volumen del miotomo, utilice el software confocal (como los archivos .lsm creados con el software de microscopio Zeiss ZEN) o el software de análisis universal de imágenes de código abierto, como Fiji / ImageJ.
    NOTA: Si cambia los formatos de archivo, asegúrese de que el tamaño del paso Z se transfiera correctamente, ya que no todo el software puede leer correctamente los formatos de archivo confocal propietarios. Por ejemplo, para importar una imagen de escaneo de línea ZEN a Fiyi, utilice primero el comando Archivo/Exportar para exportar como .tif en la ventana Imagen de resolución completa - formato de plano único y, a continuación, impórtela a Fiyi. Aunque YZ scan.lsm se puede abrir directamente en Fiji, las imágenes YZ resultantes generalmente se comprimen en la dimensión Z debido a una evaluación incorrecta del tamaño del paso Z.
  3. Análisis mediante ZEN
    1. Primero, abra los archivos XY scan.lsm en ZEN. Vaya a la pestaña Gráficos y seleccione la herramienta Línea. Dibuje una línea entre los dos mioseptos verticales del somite 17 que abarque toda la longitud del miotomo (paralelo al eje anteroposterior del pez). Marque la casilla M para mostrar los valores de la medición (Longitud = 89,71 μm, consulte el Archivo complementario 2).
    2. Abra los archivos scan.lsm de YZ . En la pestaña Gráficos , seleccione la herramienta Curva cerrada . Dibuja alrededor del perímetro del miotomo. Una vez completado, marque la casilla M, esto revelaría el valor de la medición (Área = 11980.01 μm2, consulte el Archivo Suplementario 3).
    3. Registre los valores de cada medición manualmente en una hoja de cálculo. Promedie las mediciones de CSA según sea necesario. El volumen del miotomo se puede calcular como Volumen = longitud del miotomo x CSA, es decir, 89.71 μm x 11980.01 μm2 = 1.075 x 106 μm3.
  4. Análisis mediante Fiji/ImageJ
    1. Abra los archivos XY scan.lsm en Fiji/ImageJ. Compruebe si las imágenes XY abiertas directamente en Fiji están correctamente calibradas en escala, como debería ser.
    2. Seleccione la herramienta Línea recta en los iconos. Dibuje una línea a lo largo del somite 17 como se describe en el paso 4.3.1. Para definir los parámetros de medición, vaya a Analizar, seleccione Establecer medidas... y marque las casillas siguientes Área y Etiqueta de visualización. Para medir, simplemente presione la tecla de acceso rápido M, o vaya al menú Analizar y seleccione Medir. Una ventana emergente resultante enumera todos los valores de medición (es decir, Longitud = 90,023 μm; consulte el Archivo complementario 4). Los resultados se pueden guardar en forma de .csv y abrir en Microsoft Excel o similar para su posterior análisis.
    3. Para medir CSA en las imágenes YZ, abra las imágenes YZ en .tif formato como se describe en el paso 4.2.
    4. Calibre las imágenes YZ .tif, ya que no están calibradas cuando se exportan. Los parámetros para la calibración se pueden obtener en ZEN yendo a la Información de las imágenes seleccionadas: registre los valores de Escala X (0,489 μm) y Escala Z (0,890 μm; consulte el Archivo complementario 5). A continuación, mientras las imágenes están abiertas en Fiji, vaya a Imagen y seleccione Propiedades.... Entrada 0,489 μm para el ancho de píxel y la altura de píxeles, y 0,890 μm para la profundidad de vóxel. Marque la casilla Global para aplicar la calibración universalmente si se prevé la medición repetida de imágenes YZ (consulte el Archivo complementario 6).
      NOTA: Asegúrese de que todas las imágenes YZ se capturen utilizando los mismos parámetros de escaneo; reinicie Fiji/ImageJ o modifique los valores de calibración si se requiere un nuevo conjunto de calibración.
    5. Para medir el CSA de las imágenes YZ calibradas, seleccione la herramienta Selecciones de polígonos en los iconos. Dibuje alrededor del perímetro del somita y presione M para revelar los valores de la medición (Área = 11980.395 μm2; consulte el Archivo suplementario 7). El volumen del miotomo se puede calcular como Volumen = longitud del miotomo x CSA, es decir, 90.023 μm x 11980.395 μm2 = 1.079 x 106 μm3.
    6. Repita las mediciones en las otras imágenes XY e YZ. Se recomienda utilizar el mismo software para todas las mediciones dentro de una serie experimental para mayor consistencia. La estimación de volumen de cada software es similar pero no idéntica debido a las distintas herramientas de dibujo, es decir, ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 y Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3. El crecimiento del miotomo entre dos puntos de tiempo (es decir, 3 a 4 dpf) se puede calcular como: (Volumen 4 dpf - Volumen 3 dpf) / Volumen 3 dpf × 100%.
      NOTA: Sobre el error y su corrección. Durante el montaje, el pez debe orientarse con su plano sagital (es decir, los ejes anteroposterior y dorsoventral) lo más cerca posible de la horizontal, para evitar la guiñada y el balanceo, respectivamente. Esto se debe a que tanto la longitud del miotomo L medida a partir de la exploración XY como la CSA medida a partir de una exploración YZ se sobreestimarán si el pez muestra guiñada (rotación alrededor del eje dorsoventral) debido al montaje anteroposterior oblicuo. Ni el cabeceo ni el balanceo durante el montaje deben afectar a las mediciones después del escaneo, como se describe en la sección 3. Sin embargo, la rotación dorsoventral (rollo) degrada la calidad de la imagen. La trigonometría simple muestra que hasta 10° de guiñada dará un error del 3% en la medición del volumen, ya que L y CSA medidos aumentan en proporción a (cosq)-1, donde q es el ángulo alejado de la horizontal anteroposterior (guiñada). 15° y 20° de descuento darán un 7% y un 13% de sobreestimación del volumen, respectivamente.
      Como la notocorda es cilíndrica, la inclusión de toda la notocorda en el escaneo YZ se puede usar para calcular el ángulo y la extensión de la oblicuidad a partir de la orientación y magnitud de los ejes mayor y menor y, por lo tanto, corregir la L y CSA medidas para maximizar la precisión. CSA corregido = CSA medido x Eje Notocorda menor/Eje Notocorda mayor. L corregido = L medido x eje Notocorda menor/eje Notocorda en dirección Z del microscopio.
      Una consideración adicional permite una corrección adicional de L. A medida que el miotomo crece, se inclina en el plano coronal (normal al eje dorsoventral) de tal manera que el miotomo medial es ligeramente anterior al miotomo lateral. Visto desde dorsal, los mioseptos verticales en los lados izquierdo y derecho forman un amplio chevron que apunta anterior. Si la guiñada es baja, esta morfología no afecta a la medición de L. Pero si la guiñada es significativa, la corrección trigonométrica se vuelve desafiante y un mejor enfoque es medir True L directamente estimando las coordenadas XYZ de los dos puntos donde los mioseptos verticales anterior y posterior se encuentran con la notocorda en el mioseptum horizontal. La trigonometría simple permite el cálculo de L verdadero a partir de estas coordenadas como L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Las debilidades de este último enfoque son que a) la selección de los puntos puede variar con el operador y b) no se conserva ningún registro visual de los puntos elegidos. Esta consideración no afecta a la corrección de la CSA.

5. Método opcional: eliminar y reintroducir la actividad eléctrica muscular

  1. Crear una cámara de estimulación.
    1. Tome una placa de pocillo de 6 x 35 mm, cree dos aberturas pequeñas (<5 mm de diámetro, 1 cm de separación) a cada lado de cada pocillo (consulte la figura 1) utilizando un soldador estrecho.
      NOTA: Manipule el soldador caliente con cuidado y trabaje en una campana extractora de humos si lo desea para evitar inhalar vapor.
    2. Enhebra un par de alambres de plata o platino (~20 cm de largo) a través de las aberturas de cada pocillo (ver Figura 1). El material adhesivo reutilizable (por ejemplo, BluTack) se puede aplicar cerca de las aberturas para mantener los cables en su lugar y garantizar una separación de 1 cm entre los cables (consulte la figura 1).
  2. A 3 dpf, divida el pescado en tres condiciones: medio de pescado Control, Inactivo e Inactivo + Stim.
    1. Para los grupos Inactivo e Inactivo+Stim, anestesiar las larvas a las 72 horas después de la fertilización (hpf) con Tricaine (0,6 mM).
      NOTA: Siguiendo la referencia38, las alícuotas congeladas de tricaína se descongelan y diluyen (40 μL/ml de medio de pescado, hasta una concentración final de 0,6 mM) antes de añadirlas al pescado. No agregue tricaína directamente en el agua que contiene peces, ya que algunos peces podrían recibir dosis altas. Las existencias de tricocaína deben usarse dentro de un mes y nunca volver a congelarse.
    2. Para el medio de pescado Peces de control, déjelos sin anestesia.
  3. En momentos seleccionados después del inicio de la exposición a tricaína (es decir, a 80 hpf), prepare el grupo Inactivo + Stim para la estimulación.
    1. Preparar 60 mL de agarosa al 2% (1,2 g de agarosa en polvo en 60 mL de medio de pescado), y derretir completamente usando microondas, enfriar, añadir tricaína y verter 4 mL en cada pocillo de la cámara de estimulación (Figura 1).
    2. Agregue inmediatamente peines de 4 pocillos hechos a medida entre los electrodos (creados cortando plásticos (por ejemplo, polipropileno) de las dimensiones deseadas y pegándolos con Superglue; consulte la Figura 1). Espere 10 minutos para que el gel se asiente. Retire los peines con cuidado para crear cuatro pozos rectangulares.
    3. Llenar cada pocillo con agua tricaína y colocar una sola larva Inactive+Stim anestesiada en cada pocillo utilizando una micropipeta, con su eje anteroposterior perpendicular a los electrodos (ver Figura 1).
    4. Verifique bajo el microscopio fluorescente de disección si cada pez está completamente anestesiado dentro de cada pocillo de la cámara.
  4. Conecte un estimulador electrofisiológico ajustable generador de patrones a la cámara a través de un controlador de polaridad, utilizando clips de cocodrilo conectados a cada uno de los electrodos en un lado de la cámara (ver Figura 1).
    NOTA: El controlador de polaridad se utiliza para invertir la polaridad cada 5 s, a fin de evitar la electrólisis y la corrosión de los electrodos.
  5. Estimular a los peces. Por ejemplo, 1s con un tren de 200, pulsos de 20 V, con una duración de pulso de 0,5 ms y separación de pulsos de 4,5 ms, una vez cada 5 s proporciona un régimen efectivo de resistencia a la contracción tetánica repetida.
  6. Verifique regularmente bajo el microscopio para confirmar que los peces están siendo estimulados; El estímulo eléctrico de ejemplo debe inducir una contracción bilateral visible y un ligero movimiento, una vez cada 5 s.
  7. Para un régimen de resistencia/alta fuerza, estimule a los peces a una frecuencia alta durante un combate de 5 minutos, tres veces, con cada combate separado por 5 minutos de descanso.
    NOTA: Mientras los peces en un lado de la cámara están descansando, los clips de cocodrilo se pueden conectar al par de electrodos en el otro lado de la cámara, y esos peces adicionales estimulados.
  8. Después de la estimulación, retire cuidadosamente el pescado de cada pocillo enjuagándolos suavemente con una pipeta de plástico y regrese a la incubadora en un medio de pescado fresco que contenga tricaína.
  9. Vierta el agua tricaína desde dentro de la cámara y use fórceps para cortar y quitar la agarosa de cada pozo. Enjuague los pocillos con agua del grifo y deje secar.
    NOTA: Si se utilizan electrodos de alambre de plata, ocasionalmente se puede acumular óxido de plata en la superficie del cable después de un experimento de estimulación. Como el óxido de plata es menos conductor que la plata, para mantener la reproducibilidad, frote cuidadosamente el óxido de plata del cable con Kimwipes antes de volver a utilizar la configuración.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Una medida rápida y precisa del volumen de somita
Se describe un método de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis volumétrico que permite la medición rápida del crecimiento muscular en larvas de pez cebra. El tamaño muscular se puede medir en animales vivos utilizando peces marcados en sus membranas plasmáticas con una GFP dirigida a la membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Las larvas fueron anestesiadas transitoriamente usando tricaína, montadas en agarosa de bajo punto de fusión y fotografiadas usando microscopía de fluorescencia confocal. Somite 17 fue elegido para el análisis del tamaño muscular dada su accesibilidad en la interfaz tronco-cola31. En la práctica, como en teoría, el volumen del miotoma se puede calcular como el producto de la longitud del miotoma (L) y el promedio de tres medidas de área transversal (CSA) (Figura 2A, que se conoce como el método de 4 cortes).

Para validar este método, se obtuvieron pilas Z confocales de miotoma entero de larvas vivas de pez cebra (Figura 2B), y el volumen de somita se calculó multiplicando la suma de 17 áreas de perfil de somita en cada rebanada (80-100 rebanadas) por la distancia entre cortes (1-1.2 μm). Se observó una fuerte correlación entre los métodos de cálculo de 4 cortes y la pila completa (Figura 2C). Sin embargo, el método de 4 cortes generalmente dio una estimación de volumen ligeramente mayor (~ 2% más grande en promedio) (Figura 2D). Esta diferencia podría deberse a a) la oblicuidad de las muestras que dan una medición de volumen erróneamente grande o b) la observación de que los miotomas del pez cebra se estrechan a lo largo del eje anteroposterior, siendo más pequeños hacia la cola del animal. Como las mediciones de YZa, YZm e YZp CSA son hacia la porción anterior del chevron del miotomo somite 17 (Figura 2A), esta última interpretación se probó mediante análisis volumétrico de los miotomas de somitas 16 y 18. Cada somite era aproximadamente un 7% más grande que el que estaba detrás (Figura 2E). Un análisis posterior reveló que un método de 2 cortes que requiere solo una medición YZ, ubicado en el centro del somite donde las mitades epaxial e hipaxial se encuentran en el mioseptum horizontal (YZm) y el corte XY, da una estimación razonablemente precisa del volumen del miotomo (Figura 2F, G). El enfoque de 2 cortes permite una adquisición de datos más rápida cuando las limitaciones de tiempo limitan el número de peces que se pueden escanear. En resumen, estos datos muestran que el volumen del miotoma se puede medir de forma rápida y precisa en larvas vivas de pez cebra. Las larvas individuales se midieron con éxito, repetidamente, durante un período de 6 días con este método.

Para el estudio comparativo del crecimiento de una unidad de tejido identificada, el método descrito proporciona estimaciones de volumen confiables y precisas. Sin embargo, para obtener volúmenes absolutos precisos, se pueden aplicar una serie de modificaciones. Primero, se puede corregir los errores causados por el montaje oblicuo, ya sea inclinando el plato o la etapa del microscopio para obtener mejores cortes transversales YZ y XY parasagitales durante la obtención de imágenes o mediante el uso del perfil de notocorda en rodajas YZ; el eje menor de sección transversal revela el diámetro real del notocordio cilíndrico, mientras que su eje mayor revela el ángulo y la magnitud de la oblicuidad (véase la nota del punto 4.6). En segundo lugar, la ubicación de la sección XY e YZ durante el escaneo debe seleccionarse para reflejar, con precisión, el miotomo (s) deseado (s). (Véase la nota del punto 4.6). Tenga en cuenta, sin embargo, que la forma de los chevrones del miotomo cambia dependiendo de la etapa de desarrollo y esto debe tenerse en cuenta al seleccionar las exploraciones YZ. Por último, para determinar si los cambios en el miotomo 17 reflejan el crecimiento muscular en todo el eje, los miotomas más adentro de las regiones del tronco o la cola pueden medirse mediante el método descrito.

Mediciones repetidas revelan crecimiento de somita
Una ventaja del método descrito es la facilidad de repetir el análisis en peces individuales. Los embriones y larvas individuales pueden ser incrustados, medidos y liberados repetidamente sin sufrir efectos obvios a largo plazo (Figura 2H). El miotomo crece detectablemente tanto en L como en CSA entre 2 y 5 dpf, lo que lleva a un aumento constante del volumen (Figura 2H). El crecimiento se visualizó de esta manera entre 1 y 8 dpf y las larvas también se liberaron después de la obtención de imágenes y crecieron hasta la edad adulta. Se espera que sean posibles análisis posteriores al período larvario tardío, aunque los efectos de las imágenes repetidas en el comportamiento de alimentación deberían monitorearse cuidadosamente en comparación con los hermanos que no se obtienen imágenes. Es importante destacar que el desarrollo de la pigmentación puede oscurecer las imágenes. Mientras que la pigmentación no es un problema en peces correctamente orientados, ya que las rayas de melanóforos no impiden las mediciones requeridas, el pigmento puede ser más problemático en muestras montadas oblicuamente. Se anticipa el uso de líneas mutantes de pigmentación, como roy;mitfa39, lo que extendería la ventana de tiempo de las mediciones de crecimiento hasta que se alcancen los límites de la profundidad de escaneo confocal practicable.

Otra ventaja del procedimiento descrito es la facilidad de análisis detallado del crecimiento de fibras individuales en comparación con todo su miotomo en períodos cortos. Mediante el etiquetado en mosaico de fibras mediante inyección de ADN, se desarrolló un método para detectar la adquisición y el crecimiento nuclear en fibras individuales identificadas durante 4 h, y luego permitir el reanálisis en momentos posteriores (Figura 2I). Además, el crecimiento de todo el miotomo se puede medir durante 12 h o menos26 (y los datos no se muestran). Al medir repetidamente el mismo pez, se elimina la variabilidad interindividual y un pequeño número de animales puede producir resultados estadísticamente robustos26.

Las manipulaciones que cambian el volumen de somite se pueden detectar fácilmente
El protocolo actual permite interrogar los cambios en el crecimiento muscular bajo diversas condiciones biológicas y fisiológicas, como la inactividad física alterada. La tricaína anestésica, que bloquea los potenciales de acción nerviosa al inhibir los canales de Na+ 40 dependientes de voltaje, se utilizó para inducir la inactividad muscular en larvas de β-actina:HRAS-EGFP . Como se mostró anteriormente 26, la inactividad durante24 h entre el tercer y cuarto dpf redujo en gran medida el volumen del miotoma, lo que indica que el crecimiento muscular larvario depende de la actividad (Figura 3A). El efecto de la inactividad también se puede investigar utilizando otros métodos de detección que revelan la estructura del somite, como mCherry-CAAX (ya sea en una línea transgénica o por inyección de ARNm) o por inmersión nocturna de larvas en colorante BODIPY (Figura 3A). Este último enfoque, si bien elimina la necesidad de cruzar peces sobre fondos transgénicos o inyectar embriones, no se puede utilizar para mediciones repetidas debido a la toxicidad de BODIPY. Por lo tanto, el método actual permite medir de manera reproducible los cambios en el volumen del tejido muscular.

Como se describió anteriormente, los métodos de marcado genético se pueden utilizar para realizar mediciones repetidas del volumen del miotoma, lo que permite el seguimiento del cambio en el tamaño muscular durante días sucesivos en peces individuales. Como los peces individuales y las puestas enteras en la misma etapa de desarrollo difieren en el volumen absoluto del miotomo (Figura 3A; tal vez debido al tamaño o la salud de los huevos), la capacidad de medir el crecimiento de cada individuo reduce los efectos de la variación individual al permitir análisis estadísticos de muestras pareadas. La medición repetida del mismo pez reduce el número de peces necesarios para detectar efectos de forma robusta. Para ilustrar este efecto, los resultados del análisis del crecimiento de cada individuo de 3 a 4 dpf en poblaciones de larvas activas e inactivas se compararon con el análisis de las mismas dos poblaciones utilizando solo la medida única del tamaño del miotomo hecha a 4 dpf. De laico a laico, se observó una mayor variación en la reducción aparente del tamaño del miotoma al medir el volumen del miotoma a 4 dpf solo en comparación con la medición del volumen de 4/3 dpf para cada individuo (Figura 3B). Tenga en cuenta el mayor rango de reducción (68% -91%) en las mediciones de solo 4 dpf, en comparación con el método de 4/3 dpf (78% -89%) y la débil correlación entre las dos medidas. Aunque, como se esperaba, la reducción media en las 13 réplicas biológicas fue similar en cada evaluación (Figura 3C) siendo 82,62 ± 1,01% (media ± SEM, n = 13) para el método 4/3 dpf y 82,31 ± 1,92% para el método de 4 dpf solamente, el error estimado con el método de 4 dpf solo fue casi el doble que con el método de 4/3 dpf. Por lo tanto, cuantificar el crecimiento individual a través de mediciones repetidas es el método más preciso, al eliminar la variabilidad del tamaño entre peces dentro de la misma puesta, como se demostró anteriormente26. No obstante, como no se observó una diferencia significativa en la reducción en el volumen del miotoma causada por la inactividad al medir el volumen del miotoma solo a 4 dpf (Figura 3C), los datos sugieren que ~ 6-8 peces son suficientes para promediar la diferencia de tamaño interindividual dentro de una puesta. Claramente, cuando los cambios de tamaño son pequeños, se prefiere el método de 4/3 dpf.

Análisis de las bases celulares del crecimiento
El miotomo CSA está determinado por el número de fibras musculares y el tamaño de la fibra. El número de fibras se puede estimar contando el número de fibras rápidas y lentas en tres secciones YZ (YZ A, YZ M, YZ P). Aunque las regiones de dos miotomos adyacentes están contenidas en tales secciones YZ, como lo demuestra la presencia de mioseptos verticales (VM) en la mayoría de las secciones (Figura 2A), estos recuentos reflejan con precisión el número de fibra. El conteo excesivo ocurre en las máquinas virtuales debido a la disminución de pares de fibras de cada segmento adyacente en la máquina virtual (Figura 4A). Tal conteo excesivo se puede explicar usando la siguiente ecuación: Número de fibra = Recuento total de fibra - (fibras en contacto con VM) / 2 referencia33. Además, el volumen promedio de fibra se puede determinar dividiendo el volumen del miotomo por el número de fibras. Hemos utilizado estos análisis para revelar que la actividad controla ambos aspectos celulares del crecimiento (Figura 4B, C).

Es evidente en la Figura 2A que las fibras varían en tamaño a través del miotomo, una realidad que no se refleja en las mediciones de volumen de fibra promedio calculadas. Al dibujar alrededor de cada fibra de somita 17 de dos peces, se demostró que el área de la sección transversal de fibra medida oscilaba entre 28 μm 2 y 217 μm2 (Figura 4D). En realidad, sin embargo, muchas fibras están inclinadas oblicuamente dentro del miotomo, por lo que tales medidas de CSA no reflejan el verdadero CSA de una fibra perpendicular a su eje largo. Por el contrario, debido a los diferentes ángulos de las fibras dentro del miotomo, todas las fibras que corren en orientaciones que no están alineadas anteroposteriormente tienen longitudes que difieren de la longitud del miotoma. A pesar de estas advertencias, que solo pueden eludirse mediante la segmentación completa del miotomo en volúmenes de fibra única o mediante el cálculo después de medir el ángulo de oblicuidad de cada fibra, los CSA medidos proporcionan una estimación de la diversidad de tamaño de fibra en cada pez. Por ejemplo, las fibras individuales disminuyeron en CSA con inactividad, lo que resultó en un desplazamiento hacia la izquierda en la curva de frecuencia acumulada con respecto a las larvas de control activas (no anestesiadas) (Figura 4E). Como los peces inactivos tienen ~ 10 fibras menos que los peces activos (Figura 4B), las 10 fibras más pequeñas de peces activos no anestesiados (suponiendo que sean las nuevas) o las 10 más grandes (como el extremo alternativo) se omitieron de la comparación, lo que mostró que la mayor pérdida del volumen del miotomo se debe a la falta de crecimiento de fibra. en lugar de fallar la formación de nuevas fibras (Figura 4F). Tomados en conjunto, estos datos muestran que el método descrito permite una investigación detallada del papel de la actividad física en la formación y el crecimiento del tejido muscular.

Reimposición de la actividad por estimulación eléctrica
La actividad física es necesaria para el crecimiento muscular (Figura 3A). Se describe un método para reimponer contracciones musculares mediante estimulación eléctrica en larvas inactivas, evocando una fuerte respuesta contráctil (Figura 5A, Archivo Suplementario 8). Aunque aquí se describen parámetros precisos de estimulación (Figura 5B) para activar al máximo la musculatura, el protocolo puede modificarse (cambiando la amplitud actual, la frecuencia, la duración del pulso, etc.) para controlar la activación muscular y la dosis de ejercicio. Por lo tanto, el método actual proporciona un estímulo de actividad controlada con un comportamiento estandarizado entre los episodios de actividad, superando una limitación importante de los modelos animales actuales de ejercicio18.

Los métodos descritos demuestran el potencial del uso de larvas de pez cebra para estudiar diversos aspectos del crecimiento muscular (por ejemplo, hiperplasia e hipertrofia). En particular, se ha demostrado que la miogénesis en larvas de pez cebra es susceptible de análisis a través de la inactividad inducida farmacológicamente y la contractilidad inducida eléctricamente. El enfoque permite el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales la actividad física conduce al crecimiento muscular in vivo.

Figure 1
Figura 1: Diseño de una cámara de estimulación para la reintroducción de la actividad eléctrica muscular a las larvas de pez cebra. Una placa de cultivo celular de 6 pocillos equipada con electrodos permite el mantenimiento de larvas en pocillos hechos con gel de agarosa al 2%. Los peines personalizados de 4 pozos están hechos para crear pocillos rectangulares (dimensiones como se indica) en agarosa para mantener la posición y orientación de las larvas de peces individuales, y para evitar que entren en contacto con los cables plateados durante las contracciones vigorosas tras la estimulación eléctrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Medición del volumen muscular en larvas transgénicas (H,I) de α-actina:mCherry-CAAX (A,B,E) o β-actina:HRAS-EGFP (H,I). Larvas fotografiadas desde la vista lateral y mostradas dorsal a la parte superior, anterior a izquierda en los paneles superiores (A, B, E). (A) En el método de 4 cortes, el volumen del miotomo se calculó multiplicando la longitud del somita 17 (L) medido entre mioseptos verticales (VM) en un plano XY (flecha azul) por el promedio de tres áreas de sección transversal (CSA) medidas en planos YZ (YZm, YZa e YZp; líneas amarillas discontinuas). (B) En el método Full Stack, se midió el área del miotomo somite 17 (ejemplos delineados en amarillo) en cada rebanada de una pila Z completa de una larva de pez cebra viva y la suma de las áreas miotomales se multiplicó por la distancia entre cortes. (C) Alta concordancia entre los métodos 4-slice y Full Stack. Los colores denotan peces individuales β-actina: HRAS-EGFP (cuadrados) o α-actina: mCherry-CAAX (círculos). (D) El volumen del miotomo es ligeramente, pero significativamente, mayor cuando se calcula utilizando el método de 4 cortes. (E) En las larvas de pez cebra estrechas, los somitas más anteriores son más grandes que los somitas posteriores, según lo medido por el método de 4 cortes. (F,G) Fuerte correlación entre las mediciones de volumen realizadas utilizando el promedio de tres secciones CSA (método de 4 cortes) o un solo YZm CSA (método de 2 cortes). Los valores p muestran los resultados de dos pruebas t de cola con igual varianza (D, G) o ANOVA unidireccional con pruebas post hoc de Bonferroni (E). ns, no significativo. (H) Medición del volumen del miotomo 16, longitud (L) y área de sección transversal (CSA) de 2 a 5 dpf en tres peces individuales (colores) que expresan β-actina: HRAS-EGFP y miog: H2B-mRFP. Las imágenes YZm del individuo verde en cada punto de tiempo se muestran arriba. (I) Crecimiento de una sola fibra medido por segmentación automatizada de umbral constante. Un pez β-actina:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP marcado mosaicamente mediante inyección de un plásmido CMV:cerúleo en la etapa de 1-2 células. Una sola fibra marcada con Cerúleo en somita 10 se escaneó repetidamente con pilas XYZ completas de alta resolución en un Zeiss LSM880. Las imágenes mostradas son cortes individuales representativos (izquierda) y la proyección del volumen segmentado tridimensional (derecha). Cada punto de datos en el gráfico representa un solo escaneo de la misma fibra, a 3 dpf (0 h), después de 4 h y a 5 dpf (54 h). Se realizaron exploraciones triplicadas y segmentadas por punto de tiempo para mostrar la reproducibilidad. Las puntas de flecha blancas apuntan a núcleos de fibra; Tenga en cuenta que se agregan dos núcleos entre 3 y 5 DPF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Crecimiento muscular dependiente de la actividad en somite 17. (A) La actividad inhibidora durante 24 h mediante la aplicación de tricaína (rosa) entre 3 y 4 dpf reduce el volumen del miotomo tanto en líneas transgénicas como en peces no transgénicos teñidos con BODIPY en comparación con los controles de vehículos en hermanos (azul). Volumen cuantificado por el método de 4 cortes. La forma del símbolo indica experimentos replicados de distintas capas (réplicas biológicas). Los símbolos grandes denotan valores de SEM ± media. Pequeños símbolos débiles muestran el volumen de larvas individuales replicadas. (B) Comparación de la reducción del volumen del miotoma en peces inactivos en comparación con hermanos control determinada por la medición única del volumen del miotomo a 4 dpf (4 dpf solamente, esquema superior) o cambio en el volumen del miotoma entre 3 y 4 dpf (4/3 dpf, esquema inferior). Cada símbolo representa el volumen medio del miotomo 17 en ~5 peces inactivos de una sola puesta dividido por el volumen medio del miotomo 17 de ~5 hermanos de control activo. (C) No se observó diferencia en la reducción media del crecimiento muscular en peces inactivos, cuando se midió solo con los métodos de 4 dpf o 4/3 dpf. Los números dentro de las barras representan el número total de peces analizados. Los valores p muestran los resultados de ANOVA de dos vías con pruebas post hoc de Bonferroni (A) o prueba t de dos colas con varianza desigual (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cambios a nivel celular en el crecimiento muscular causados por la inactividad. (A) Esquema que muestra cómo se produce el conteo excesivo en las máquinas virtuales debido al doble conteo de fibras estrechas donde se encuentran los miotomas azul y rojo. Tenga en cuenta que el recuento promedio de fibra es 6, pero el verdadero valor medio es 5.5. El recuento corregido da una mejor aproximación. (B,C) El número de fibra (B) y el volumen promedio de fibra (C) se reducen en larvas inactivas (rosa) en comparación con las larvas activas (bue). La forma del símbolo indica experimentos replicados de distintas capas (réplicas biológicas). Los símbolos grandes denotan valores de SEM ± media. Los símbolos débiles más pequeños muestran el valor de las larvas replicadas individuales. Los números dentro de las barras representan el número total de peces analizados. (D) En larvas individuales, se delineó cada perfil de fibra en el miotomo 17 y se determinó CSA. Los recuadros muestran la media ± SEM. Los valores p muestran los resultados de ANOVA bidireccional con pruebas post hoc de Bonferroni (B, C) o prueba t de dos colas con igual varianza (D). (E,F) Curvas de frecuencia acumuladas que muestran la distribución del tamaño de la fibra en larvas control activas (azul) e inactivas (rosa). La comparación de todas las fibras (E), o después de la omisión de fibras pequeñas o, en el extremo alternativo, grandes (F) muestra que el aumento del tamaño de la fibra, no el aumento en el número de fibras, explica principalmente el crecimiento impulsado por la actividad del miotoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La estimulación eléctrica breve evoca contracciones musculares tetánicas en larvas de pez cebra anestesiadas . (A) Imágenes secuenciales (capturadas del video en el Archivo Suplementario 8) que muestran cómo la estimulación eléctrica desencadena contracciones máximas de una larva anestesiada a 3 dpf. Escala de tiempo en segundos. Los cuadros rojos indican los movimientos al inicio de tres trenes sucesivos de estimulación 1 s. Cada imagen es una exposición de 40 ms. (B) Esquema que muestra el régimen de estimulación eléctrica, en el que se administra un tren de 1 s de 200 impulsos eléctricos de alta frecuencia y 20 V cada 5 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Esquemas de imágenes capturadas de larvas perfectamente (arriba a la izquierda) e imperfectamente montadas con respecto al marco de referencia XYZ del microscopio (ejes negros). Miótomo (verde), notocorda (amarillo), tubo neural (bronceado), parámetros miotomales medidos (rojo), parámetros de notocorda medidos (flechas negras) y rotaciones de peces posibles o reales (azul). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Captura de pantalla que muestra la medición de la longitud del somita a partir de imágenes XY en ZEN. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Captura de pantalla que muestra la medición CSA de imágenes YZ en ZEN. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Captura de pantalla que muestra la medición de la longitud del somite de imágenes XY en Fiji/ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario: Captura de pantalla que muestra la extracción de parámetros de calibración para imágenes YZ de ZEN. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: Captura de pantalla que muestra la calibración de imágenes YZ en Fiji/ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 7: Captura de pantalla que muestra la medición de CSA a partir de imágenes YZ en Fiji / ImageJ. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 8: Video representativo que muestra la contracción muscular evocada por estimulación eléctrica directa (longitud 1 s) de una larva de 3 dpf anestesiada con tricaína. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí presentamos un método para la estimación precisa y eficiente del volumen muscular de larvas vivas de pez cebra en etapas o en variantes genéticas en las que la pigmentación no es un gran obstáculo para la obtención de imágenes y cuando la anestesia transitoria y / o la inmovilización son bien toleradas. Mientras que hemos empleado microscopía confocal de escaneo láser, los enfoques descritos son aplicables a la microscopía confocal de disco giratorio o de hoja de luz y a cualquier otro método que cree pilas de imágenes en distintos planos focales. Se describe una serie de enfoques cada vez más sofisticados para la estimación del tamaño del tejido y el contenido celular. Cada método tiene ventajas y limitaciones, que mostramos que se pueden cuantificar. Una limitación importante en el estudio del crecimiento tisular es la dificultad de analizar los cambios de crecimiento en tiempo real a medida que las tasas de crecimiento se alteran en respuesta a una serie de eventos moleculares o subcelulares catalizados por estímulos administrados de forma aguda. Además, la variación individual puede crear problemas cuando se comparan individuos separados. El enfoque actual permite la medición del crecimiento del tejido durante períodos de menos de un día en individuos vivos individuales. La aplicación del enfoque puede contemplarse en el plazo mínimo.

Los métodos descritos permiten análisis que hasta ahora eran impracticables. Usando el método de 4 cortes, la porción de imagen del ensayo de crecimiento muscular puede completarse en un tamaño de muestra de alrededor de 20 peces en una hora por un operador capacitado. Esto está en marcado contraste con el método Full Stack convencional, que toma al menos 3 horas para el mismo número de peces (es decir, tres veces más). Si se requieren imágenes de alta resolución para análisis subcelulares posteriores, el método Full Stack puede requerir fácilmente 30 minutos por pez, lo que hace que los ensayos de crecimiento de cohortes de animales en una etapa de desarrollo similar sean imposibles. Por el contrario, los métodos de 2 o 4 cortes permiten una captura rápida de imágenes de alta calidad. Pasando a la consideración del análisis de imágenes, las ventajas del método de 2 o 4 cortes para ahorrar tiempo al operador (en ausencia de segmentación automatizada de imágenes) sobre el método Full Stack son enormes. Cada pez requiere aproximadamente 20 minutos para el análisis Full Stack, pero solo 3-4 minutos para el análisis de 4 cortes. El tiempo del operador se puede conservar aún más utilizando el método de 2 cortes casi tan preciso. Por lo tanto, el método descrito es eficiente y, por lo tanto, aumenta la flexibilidad en el diseño experimental.

La principal limitación de los métodos de 4 o 2 cortes es que ambos métodos son estimaciones, debido a la forma de chevron superpuesta de somitas (por ejemplo, el volumen de regiones de dos somitas vecinas (por ejemplo, miotomo 16 y 17). Se ha demostrado que esto puede sobreestimar el volumen real del miotomo 17 en alrededor del 2%, dependiendo precisamente de dónde se seleccionaron las rebanadas YZ . Además, el rastreo manual de los bordes de somita durante las mediciones podría contribuir a las variaciones en las estimaciones, aunque se encontró poca diferencia entre los experimentadores (no se muestran los datos). Los errores de medición pueden abordarse utilizando algoritmos de umbral, filtrado y segmentación para adquirir área de superficie de una manera más objetiva y reproducible. Sin embargo, las personalizaciones seguirán siendo necesarias para tener en cuenta las variaciones en la fluorescencia de fondo (como debido a la incrustación y / o el grosor de la LMA) y el nivel de expresión de las proteínas de fluorescencia de larvas individuales a lo largo del tiempo. Tenga en cuenta que tales mediciones automatizadas serán aún más desafiantes si se utiliza un informador no específico del músculo, como la línea β-actina: HRAS-EGFP . Sin embargo, en muchas circunstancias, por ejemplo, cuando se comparan los efectos de las manipulaciones entre peces sometidos a diferentes tratamientos que se espera que afecten a todo el tejido muscular, la inexactitud puede ser irrelevante. Sin embargo, si se requiere una precisión máxima para la comparación con los números de fibra o nucleares contados únicamente a partir del miotomo 17, por ejemplo, los métodos de "corte" pueden mejorarse. Esto se puede lograr utilizando el arduo método Full Stack, mediante corrección matemática multiplicando los volúmenes medidos de 4 cortes por 0,98, o moviendo la ubicación de los escaneos YZ CSA posteriormente para reflejar con mayor precisión el verdadero CSA del miotomo 17.

Una segunda limitación del método es su sensibilidad a la orientación de montaje de los peces. En la práctica, los operadores expertos pueden orientar a los peces dentro de límites razonables la mayor parte del tiempo, incluso cuando trabajan rápidamente para incrustar muchas muestras. Se pueden prever modificaciones en el equipo en la etapa del microscopio que permitirían la corrección de la guiñada y el balanceo antes del escaneo. Sin dicho aparato, se describe un método para cuantificar la desorientación que luego se puede utilizar para corregir los volúmenes medidos. Además, incluso si la desorientación aumenta la variabilidad en el volumen medido y, por lo tanto, reduce la posibilidad de observar tamaños de efecto pequeños, en muchas situaciones dicha variación afectará de manera similar a las muestras de control y experimentales. Por lo tanto, los resultados falsos positivos son poco probables, si los operadores son conscientes del problema.

Los métodos descritos se han aplicado inicialmente para analizar el papel de la actividad eléctrica en el crecimiento muscular, un tema con una larga historia de análisis en una amplia gama de especies (revisado en18). Con este fin, se describen en detalle métodos simples para bloquear la actividad desencadenada endógenamente y se reemplazan con estimulación eléctrica controlada en la larva del pez cebra. Las ventajas de este enfoque son la eliminación de los controles de retroalimentación neuronal40, la eliminación de los efectos de la nutrición alterada y la capacidad de analizar los efectos circadianos sobre el crecimiento mismo, en lugar de sobre los proxies de crecimiento, como el recambio de proteínas26. A medida que los diferentes patrones de actividad eléctrica desencadenan distintas respuestas musculares, regulando el tipo, tamaño y metabolismo de la fibra 41,42,43,44,45,46,47,48, los métodos actuales abren el pez cebra a tales análisis.

Los métodos descritos ofrecen un conjunto de técnicas con las que se pueden analizar muchos aspectos de la fisiología muscular, la biología celular y la patología en una resolución temporal y espacial sin precedentes aprovechando el pez cebra relativamente inexplorado. Los enfoques actuales podrían aplicarse claramente a otras especies, regiones del cuerpo y etapas de desarrollo. El rápido crecimiento temprano de las larvas de pez cebra hace que la detección de los efectos agudos de las manipulaciones sobre el crecimiento tisular y la morfogénesis sean áreas de estudio particularmente atractivas. Además, se ha demostrado que el músculo del pez cebra comparte varios mecanismos de crecimiento y controles con los mamíferos. Si bien el pez cebra son vertebrados que conservan muchos aspectos de la genética molecular muscular, las células y la biología del desarrollo con los humanos, también existen diferencias significativas en el control del crecimiento muscular. Por ejemplo, los tipos de fibra lenta y rápida están más claramente segregados espacialmente en los peces y la inervación del músculo muestra diferencias. Además, hay que tener en cuenta que, hasta ahora, solo hemos podido analizar las primeras etapas de desarrollo. Se prevén análisis similares en etapas posteriores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores están profundamente en deuda con los esfuerzos de los miembros del laboratorio de Hughes, los doctores Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin y Vladimir Snetkov para el desarrollo de los protocolos descritos, y con Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau y Peter Currie por compartir plásmidos o líneas de pez cebra. SMH es un científico del Consejo de Investigación Médica (MRC) con subvenciones del programa G1001029, MR / N021231 / 1 y MR / W001381 / 1 de apoyo. MA tuvo una beca de doctorado del Programa de Formación Doctoral MRC del King's College de Londres. Este trabajo se benefició de la aportación trigonométrica de David M. Robinson, erudito, mentor y amigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive, Blu Tack Bostik - -
Aerosol vacuum  - - -
Agarose Sigma-Aldrich A9539 -
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414 Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use.
Block heater Cole-Parmer SBH130 -
BODIPY FL C5-ceramide Thermo Scientific D3521 To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation.
Crocodile clips and wires - - -
Fiji/imageJ National Institutes of Health, NIH - -
Fish medium, Fish water - - Circulating system water collected from the fish facility.
Fish medium, E3 medium - - E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water).
Fluorescence microscope Leica Leica MZ16F Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable.
Glass needle World Precision Instruments, Inc. 1B100-6 To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation.
Grass stimulator Grass Instruments S88 Stimulators of other kind are also expected to be suitable.
Kimwipes, Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 13258179 -
Laser scanning microscope (LSM)  Zeiss Zeiss LSM 5 Exciter
Zeiss LSM 880		 LSM of other kind are also expected to be suitable.
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate Thermo Scientific 140675 -
Objective, 20×/1.0W water immersion Zeiss - -
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL Starlab Group E1414-0100 -
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL Starlab Group E1414-1100 -
Petri dish, 60 mm Sigma-Aldrich P5481 -
Plasmid, CMV-Cerulean Christina L. Hammond (University of Bristol) pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage.  Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX Henry Roehl (University of Sheffield) - For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used);
synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage.
Pulse Controller  Hoefer Scientific Instruments PC750 -
Soldering iron - - -
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM.
Volocity Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc - -
Watchmaker forceps, No. 5 - - -
Wire, Platinum Goodfellow PT005142/12 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver.
Wire, Silver Acros Organics 317730010 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results).
Zebrafish, myog:H2B-mRFP David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) - ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) - ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP - - ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
ZEN software Zeiss - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
  2. Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
  3. Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
  4. Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
  5. Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
  6. Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
  7. Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
  8. Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
  9. Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
  10. Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
  11. Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
  12. Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
  13. Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  14. Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
  15. Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
  16. Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
  17. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  18. Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
  19. Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
  20. Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
  21. Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
  22. Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
  23. Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
  24. Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
  25. Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
  26. Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
  27. Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
  28. Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
  29. Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
  30. Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
  31. Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
  32. Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
  33. Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
  34. Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
  35. Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
  36. Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
  37. Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
  38. Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  39. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  40. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
  41. Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
  42. Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
  43. Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
  44. Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
  45. Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
  46. Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
  47. Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
  48. Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).

Tags

Biología del desarrollo Número 184
Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, … More

Attwaters, M., Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity. J. Vis. Exp. (184), e64063, doi:10.3791/64063 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter