Summary
Vi beskriver den kirurgiske teknik og decellulariseringsproces for sammensatte rottebagben. Decellularisering udføres ved anvendelse af natriumdodecylsulfat med lav koncentration gennem et ex vivo-maskinperfusionssystem .
Abstract
Patienter med alvorlige traumatiske skader og vævstab kræver kompleks kirurgisk rekonstruktion. Vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA) er en udviklende rekonstruktiv vej til overførsel af flere væv som en sammensat underenhed. På trods af VCA's lovende karakter er de langsigtede immunsuppressive krav en betydelig begrænsning på grund af den øgede risiko for maligniteter, slutorgantoksicitet og opportunistiske infektioner. Vævsteknik af acellulære kompositstilladser er et potentielt alternativ til at reducere behovet for immunsuppression. Heri beskrives indkøb af en rottebaglimb og dens efterfølgende decellularisering ved anvendelse af natriumdodecylsulfat (SDS). Den præsenterede indkøbsstrategi er baseret på den fælles lårbensarterie. Et maskinperfusionsbaseret bioreaktorsystem blev konstrueret og anvendt til ex vivo-decellularisering af bagbenet. Vellykket perfusion decellularisering blev udført, hvilket resulterede i et hvidt gennemskinneligt-lignende udseende af bagbenet. Et intakt, perfusabelt, vaskulært netværk i hele bagbenet blev observeret. Histologiske analyser viste fjernelse af nukleart indhold og bevarelse af vævsarkitektur på tværs af alle vævsrum.
Introduction
VCA er en ny mulighed for patienter, der kræver kompleks kirurgisk rekonstruktion. Traumatiske skader eller tumorresektioner resulterer i volumetrisk vævstab, der kan være vanskeligt at rekonstruere. VCA tilbyder transplantation af flere væv såsom hud, knogle, muskler, nerver og kar som et sammensat transplantat fra en donor til en modtager1. På trods af sin lovende karakter er VCA begrænset på grund af langsigtede immunsuppressive regimer. Livslang brug af sådanne lægemidler resulterer i øget risiko for opportunistiske infektioner, maligniteter og slutorgantoksicitet 1,2,3. For at hjælpe med at reducere og / eller eliminere behovet for immunsuppression viser vævskonstruerede stilladser ved hjælp af decellulariseringsmetoder til VCA meget lovende.
Vævsdecellularisering indebærer bevarelse af den ekstracellulære matrixstruktur, samtidig med at det cellulære og nukleare indhold fjernes. Dette decellulariserede stillads kan genbefolkes med patientspecifikke celler4. Det er imidlertid en ekstra udfordring at bevare ECM-netværket af sammensatte væv. Dette skyldes tilstedeværelsen af flere vævstyper med varierende vævstætheder, arkitekturer og anatomiske placeringer i et stillads. Den nuværende protokol tilbyder en kirurgisk teknik og en decellulariseringsmetode til en rotte bagben. Dette er en proof-of-concept-model til anvendelse af denne vævstekniske teknik på sammensatte væv. Dette kan også medføre efterfølgende bestræbelser på at regenerere sammensatte væv gennem recellularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kadaveriske mandlige Lewis rotter (300-430 g) opnået fra Toronto General Hospital Research Institute blev brugt til alle eksperimenter. Til alle kirurgiske procedurer blev sterile instrumenter og forsyninger brugt til at opretholde aseptisk teknik (se materialetabellen). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fra Animal Care Committee ved Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canada). I alt fire bagben blev decellulariseret.
1. Prækirurgisk forberedelse
- Forbered 50 ml 5% hepariniseret saltvand. Fra en 50 ml saltvandspose tages 2,5 ml saltopløsning ud ved hjælp af en 5 ml sprøjte og kasseres. Brug en 5 ml sprøjte til at tilføje 2,5 ml heparin til saltvandsposen. Vend saltvandsposen om for at blande dens indhold.
- Placer en kadaverrotte i liggende stilling under en blå pude. Barber bagbenet og lyskeområdet omkreds ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og fjern hår.
- Bring rotten til den kirurgiske station og påfør Povidone jodskrubbeopløsning ved hjælp af en gasbind til bagbenet og lyskeområdet. Påfør derefter 70% isopropylalkohol for at tørre skrubbeopløsningen af med gasbind.
- Kassér den blå pude fra trin 1.2 og skift til nye, sterile handsker.
2. Indkøb af rotte bagben
- Lav et hudsnit ved hjælp af et # 10 kirurgisk blad og en # 3 blade runner langs det inguinale ledbåndsniveau, der bevæger sig fra en lateral til en medial retning (figur 1A). Brug Adson tang til at holde den omgivende hud for at sikre et glat snit.
- Når det underliggende fedt er udsat, skal du bruge stump dissektion til omhyggeligt at dissekere gennem fedtet. Find de overlegne epigastriske kar.
- Brug mikrosaks til at dissekere proximalt og udsætte den underliggende lårbensnerve, arterie og vene på lyskebåndsniveau.
- Under et dissektionsmikroskop identificeres lårbenskarrene og dissekerer arterien og venen proximalt ved hjælp af fine tang for at opnå tilstrækkelig længde fra bifurcationspunkterne i arterielt netværk (figur 1B).
- Læg lårbensarterien og venen separat ved hjælp af 6-0 suturer.
- Udfør omkredsdissektion omkring resten af bagbenet uden at forstyrre de ligerede lårbenskar.
- Transect lårbenet midt i længden ved hjælp af en knogleskærer.
- For fuldt ud at isolere bagbenet skal du transect de ligerede lårbenskar under ligaturerne ved hjælp af mikrosakse.
- Kanylat lårbensarterien ved hjælp af et 24 G angiokateter under dissektionsmikroskopet. Brug fine tang til at indsætte kanylen forsigtigt. Skyl med hepariniseret saltvand, indtil der observeres klar udstrømning fra lårbenet.
- Fastgør kanylen ved at binde en sutur omkring det kanylede kar og en anden sutur distalt omkring selve kanylen. Sørg for, at kanylen er placeret proximalt for at forhindre blokering af bifurcationspunkterne.
- Nedsænk de indkøbte bagben i fosfatbufferet saltvand (PBS) indtil decellularisering.
Figur 1: Indkøb af rottebagben. (A) Mærkning af hudsnit på lyskebåndsniveau fra lateral til medial. (B) Visning af lårbensvenen og lårbensarterien, som er blevet dissekeret proximalt mod det lyske ledbånd, angivet med den stiplede linje. Forkortelser: L = lateral; M = medial; FV = lårbensvene; FA = lårbensarterie. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Fremstilling af opløsninger
- I en 6 L glaskolbe fremstilles et 5 L vaskemiddelreservoir med 0,25% natriumdodecylsulfat (SDS) ved at opløse 12,5 g SDS-pulver i 5 liter ultrarent destilleret vand. Dæk kolbens åbning med parafilm for at forsegle den.
- I en 1 L glasbeholder fremstilles 1 liter 0,25% SDS-opløsning separat ved at opløse 2,5 g SDS i 1 liter ultrarent destilleret vand. Tilsæt en rørestang for at blande opløsningen på en magnetisk omrører, indtil alt SDS er opløst.
- Forbered 1 liter 1x PBS-vaskeopløsning med 1% antibiotisk-antimykotisk (AA) opløsning. I en 1 L kolbe tilsættes 990 ml 1x PBS-opløsning og 10 ml AA.
- Separat, i en 500 ml glasbeholder, forberede 1x PBS + 1% AA opløsning igen ved hjælp af 495 ml 1x PBS opløsning og 5 ml AA.
- Forbered 200 ml 1% pereddikesyre (PAA) / 4% ethanol (EtOH) opløsning. Forbered denne opløsning under en røghætte.
4. Konstruktion af bioreaktor og perfusionskredsløb
BEMÆRK: Se figur 2 for konfigurationen af bioreaktoren og perfusionskredsløbet i de anførte trin.
- I et 500 ml kammer (plastbeholder) bores tre huller (1/4 tommer) på de mærkede steder i figur 2: Port A er indløbslinjen, port B er genopfyldningslinjen, og port C er udløbslinjen. Fjern og kassér overskydende plast. Sprøjt og tør kammeret af med 70% ethanol.
- Skær tre 5 cm lange silikonerør og indsæt en halvvejs i hver port i kammeret. Tilslut et Luer-hanstik på åbningen af port A, der vender mod indersiden af kammeret, og et hun-Luer-stik i den anden ende af røret uden for kammeret.
- Tilslut et hun-Luer-stik ved port B og port C på enderne af rørene, der vender ud af kammeret.
- I et lufttæt låg til plastbeholderen bores et hul på lågets overflade.
- Skær et 3 cm silikonerør og indsæt det i lågets hul. Sørg for, at ca. 2 cm af røret er placeret ud af låget, som vist i figur 2.
- Steriliser både kammeret og låget med slangen.
- Skær to 30 cm silikonerør ved hjælp af en saks. Tilslut en 1/16 ind til et 1/8 in-stik i den ene ende af hvert rør.
- Skær separat to 12 cm silikonerør ved hjælp af en saks. Tilslut en 1/16 ind til en 1/8 i stik i den ene ende af begge rør. Tilslut et Luer-hanstik i den anden ende af det ene rør og et hun-Luer-stik til det andet rør.
- Steriliser alt slangemateriale fra trin 4.7 og trin 4.8. Medtag to 3-stop pumpeslanger (1,85 mm) i steriliseringen.
- Forbered tre 3-vejs stophaner, et sprøjtefilter, to 1 ml serologiske pipetter og en 10 ml sprøjte til decellulariseringsopsætningen. Fjern filteret fra de 1 ml serologiske pipetter.
Figur 2: Forberedelse af bioreaktor og perfusionskredsløbskonstruktion. Viste apparater fra perfusionskredsløbet, herunder (A) peristaltisk pumpe og (B) tilsvarende kassetter til både indløbs- og udløbsledninger. (C, D) Silikoneslange på 12 cm og 30 cm vises også med respektive stik. (E) Slanger til peristaltisk pumpe (1,85 mm). Bioreaktorkammer med mærkede porte til (F) tilstrømning, (G) genopfyldningsport og (H) udstrømning. (I) Bioreaktorlåg vist med ventilationsport. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Decellularisering af rotte bagben
- Placer det steriliserede kammer og skru på tre engangs 3-vejs stophaner ved indløb, udløb og genopfyldningslinjer. Sørg for, at stophanen til genopfyldningsporten er begrænset til de resterende to porte for at forhindre lækage.
- Fastgør rørene fremstillet i trin 4.8 til stophanerne ved indløbs- og udløbsledningerne.
- Tilslut peristaltiske slanger til rørene i ovenstående trin. Fastgør kassetten på den peristaltiske slange, og læg den på den peristaltiske pumpe. Fastgør ikke kassetterne med slanger på plads endnu.
- Tilslut et rør fra trin 4.7 til enden af den peristaltiske slange på udløbsledningen fra ovenstående trin. Tilslut en 1 ml serologisk pipette i den anden ende. Enden fastgøres med en serologisk pipette i affaldsbeholderkolben.
- Gentag trin 4.7 for indløbslinjen. Suspender enden af røret, der er fastgjort til den serologiske pipette, ind i vaskemiddelbeholderen. Forsegl straks åbningen af vaskemiddelbeholderkolben med parafilm. Se figur 3A,B for en oversigt over decellulariseringskredsløbet.
- Der tilsættes 0,25% SDS fra 1 L glasbeholderen (trin 3,2) ind i bioreaktorkammeret halvvejs.
- Tag den indkøbte bagben ved hjælp af Adson-tang og suspender den forsigtigt i bioreaktorkammeret.
- Brug to par Adson-tang til at styre den kanyleret del af bagbenet til indløbslinjen. Mens du holder kanylen med et par tang, skal du bruge det andet par tang til at vride og fastgøre indløbslinjen til kanylen. Sørg for, at kanylen ikke trækkes eller vrides for at forhindre decannulation.
- Når den er sikret, skal du tilføje mere 0.25% SDS fra 1 L glasbeholderen for at nedsænke lemmen helt efter behov. Sørg for, at udløbsporten også er nedsænket i bioreaktorreservoiret for at sikre, at der opretholdes en ensartet udstrømning (figur 3C).
- Fastgør et sprøjtefilter til engangsbrug til ventilationsporten på låget af bioreaktorkammeret, jf. trin 4.4 og trin 4.5.
- Fastgør låget på bioreaktoren, og sørg for, at kammeret er forseglet fra alle sider (figur 3B).
- For at fjerne luft fra slangen og prime perfusionskredsløbet skal du bruge en ny engangssprøjte til 10 ml til at trække vaskemiddel fra vaskemiddelbeholderen ved hjælp af 3-vejs stophanen ved indløbslinjen.
- Når den er trukket, skal du bruge den samme væske til at indsætte i 3-vejs stophanen ved udløbslinjen. Sørg for, at der er vaskemiddel til stede i hele slangen ved både indløbs- og udløbsledningerne.
- Tryk ned og fastgør kassetterne med slangen i peristaltisk pumpe. Tænd for peristaltic-pumpen ved hjælp af tænd / sluk-knappen.
- På peristaltisk pumpeskærm skal du fortsætte til den anden fane ved hjælp af piletasten for at indstille perfusionshastigheden for den første kanal. Input flow rate som leveringsmåde og indstil perfusionshastigheden til 1 ml / min. Sørg for, at strømningsretningen er korrekt i henhold til apparatets opsætning. Gentag for den anden kanal.
- Kalibrer den peristaltiske pumpe for at sikre, at mængden af væske, der leveres gennem indløbsledningen og/eller tages fra udløbsledningen, flyder med en ensartet hastighed mellem de to. Sørg for, at slange-id'et er indstillet til 1,85 mm.
- Begynd decellularisering via maskinperfusion ved 1 ml/min for både indløbs- og udløbsledninger ved at trykke på tænd/sluk-knappen på tastaturet. Overvåg og sørg for, at flowet er ensartet og løbende ved både indløbs- og udløbsledningerne.
- Fortsæt decellularisering og overvåg dagligt. Brug 1 L 0,25% SDS (trin 3.2) til at genopfylde bioreaktorreservoiret gennem genopfyldningsporten efter behov. Se efter et hvidt, gennemskinneligt udseende af vævet, som vises på dag 5, hvilket indikerer decellularisering af rottens bagben.
Figur 3: Oversigt over perfusionsdecellularisering bioreaktorkredsløb af rotte bagben. (A) Skematisk repræsentation af bioreaktorperfusionskredsløb. Blå pile angiver retningen af vaskemiddel og affaldsstrøm. (B) Oversigt over decellulariseringskredsløbet med bioreaktor indeholdende rottebagben. SDS-reservoiret (venstre kolbe) fører ind i peristaltisk pumpe og ind i bioreaktorens indløbsrør. Udstrømningen er forbundet til affaldsbeholderen (højre kolbe) gennem den peristaltiske pumpe. (C) (I) Bioreaktor indeholdende rotte bagben med indløbsrør forbundet med den kandæmpede lårbensarterie. (II) Genopfyldningsport placeret i hjørnet til perfusering af vaskemiddel. (III) Udstrømningsrør suspenderet i ophængningsbeholder. Forkortelse: SDS = natriumdodecylsulfat. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Vask og sterilisering efter decellularisering
- Efter bekræftelse af decellularisering udskiftes vaskemiddelbeholderen med 1x PBS + 1% AA-reservoiret. Forsegl kolbens åbning med parafilm. Begynd 1x PBS + 1% AA-perfusion ved 1 ml / min og fortsæt i 2 dage.
- Udskift 1x PBS + 1% AA-reservoiret med 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH-reservoir, og begynd perfusion ved 1 ml/min i 2 timer.
- Frakobl bagbenet fra indløbslinjen ved hjælp af to par sterile Adson-tang, hvor det ene par tang vrider indløbslinjen og det andet holder kanylen. Sørg for, at kanylen ikke trækkes for at forhindre decannulation.
- Opbevar lemmen i en 500 ml glasbeholder indeholdende 1x PBS + 1% AA ved 4 °C indtil videre brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Indkøbsprotokollen havde succes med at isolere og kannulere de fælles lårbensarterier til efterfølgende perfusionstrin. De repræsentative dissektionsbilleder i figur 1A,B viser snitstedet og eksponeringen af lårbenskarrene med tilstrækkelig afstand fra bifurcationspunkterne. Figur 2 viser det apparat, der kræves til fremstilling af bioreaktoren og perfusionskredsløbet. Endepunktet for decellularisering blev bestemt ved at observere et hvidt, gennemskinneligt udseende af vævet. Ex vivo-maskinperfusionssystemet havde succes med perfusionsdecellularisering af rottebagbenet. Et enkeltpas, lukket system kredsløb blev opretholdt (figur 3). Den indfødte bagbens bruttomorfologi ændrede sig til et hvidt, blegt udseende efter 5 dage med 0,25% SDS-perfusion (figur 4).
Fjernelsen af cellulært indhold blev observeret, når det blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) i lårbenskarrene, huden, nerven, knoglen og musklen, hvor der ikke blev fundet kerner. Strukturerne i hver vævsstruktur blev analyseret i forhold til indfødt væv. Både decellulariseret lårbensarterie og vene viste tab af nukleart indhold på tværs af alle lag og omgivende bindevæv i betragtning af manglen på blåfarvede kerner, der ellers var til stede i de oprindelige kar (figur 5A, B og figur 5D, E). Tunica intima, medier og adventitia af både lårbenet og arterierne blev opretholdt i de decellulariserede kar (figur 5D, E). Lårbensnerven viste bevarelse af vævsstrukturen, herunder endoneurium (figur 5C og figur 5F). Knoglen bevarede sin overordnede vævsstruktur efter decellularisering med et observerbart tab af farvede kerner af osteocytter fra knoglen og fra omgivende endosteum- og periosteumlag (figur 5G og figur 5J). Huden viste et tab af celler fra epidermis og dermis. Dermis viste tilbageholdte kollagenfibre, svarende til naturligt hudvæv (figur 5H og figur 5K). Endelig viste det tværgående billede af skeletmuskulatur tab af kerner, der ellers var placeret i periferien af endomysium. Myofiberindholdet forblev bevaret inden for respektive fascikler efter decellularisering (figur 5I og figur 5L). DNA-kvantificering ved hjælp af Picogreen blev også udført, hvor DNA-indholdet blev signifikant reduceret på tværs af lårbenskarrene, nerven, huden, musklerne og knoglerne (figur 6).
Figur 4: Grov morfologi af indfødte og decellulariserede rottebagben . (A) Lårbensarterie af indfødt bagben kanelleret med et 24 G angiocatheter efter indkøb. (B) Hvidt, gennemskinneligt udseende af bagben efter 5 dages decellularisering med 0,25% SDS. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histologisk farvning af rotte bagbensvæv ved anvendelse af hæmatoxylin og eosin. H&E-farvet indfødt (toppanel) og decellulariseret (bundpanel) (A, D) lårbensvene og (B, E) arterie, (C, F) nerve, (G, J) knogle, (H, K) hud og (I, L) muskel. Tab af kerner og cellulært indhold synligt i alle decellulariserede prøver. Skalastænger = 200 μm (kar, nerve, knogle) og 300 μm (hud, muskel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: DNA-kvantificering af naturligt og decellulariseret rottebagbensvæv. DNA-indholdet reduceres på tværs af indfødte og decellulariserede kar, nerve, muskler, hud og knogler, udtrykt i ng / mg tørvægt. Væv blev tørret og fordøjet i papain natten over ved 65 °C. DNA blev fluorescerende påvist ved hjælp af PicoGreen. Flere uparrede t-tests blev udført. Data præsenteret som gennemsnit ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: N = indfødt; D = decellulariseret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotte bagben er nyttige som eksperimentelle modeller i VCA5. Vævsteknik af acellulære stilladser repræsenterer det første skridt i at løse manglerne ved langsigtede immunsuppressionsregimer forbundet med VCA. Brugen af sammensatte transplantater udgør en ekstra udfordring i betragtning af tilstedeværelsen af flere væv, der hver har unikke funktionelle, immunogene og strukturelle egenskaber. Den nuværende protokol viser en vellykket metode til opnåelse af acellulære sammensatte rottebagben. Disse stilladser kan videreudvikles yderligere og repræsenterer en proof-of-concept-model for VCA.
For at sikre vellykket indkøb og decellularisering er der forskellige kritiske trin i de kirurgiske og decellulariseringsfaser. For at sikre systemisk fordeling af vaskemidlet og sterilopløsningen gennem den indfødte vaskulatur indbefatter de kritiske trin ligering af de epigastriske kar samt opnåelse af tilstrækkelig afstand fra bifurcationspunkterne i det arteriovenøse netværk inden ligering af lårkarrene. Den beskrevne steriliseringsprocedure hjælper med at reducere biobyrden for recellulariseringseksperimenter, hvor et sterilt miljø er nødvendigt for cellebinding, overlevelse og vækst6.
Vi præsenterer også et perfusionsbioreaktorsystem, der er designet til at implementere decellularisering. Kritiske komponenter omfatter evnen til kontinuerlig perfusion ved hjælp af en peristaltisk pumpe og tillader enkeltpasperfusion af vaskemiddel og sterilt middel gennem den kanellerede arterie. Den peristaltiske pumpe blev også indstillet til en pulsatil strømning, svarende til fysiologiske forhold. Endelig blev der inkluderet en genopfyldningsport til genopfyldning af suspensionsreservoiret i bioreaktoren uden at udsætte bagbenet for det ydre miljø. Dette bioreaktorsystem er derfor fordelagtigt, da det kan decellularisere og sterilisere en rotte bagben ex vivo på en lukket system, single-pass måde. Komponenterne i kredsløbet er autoklaverbare og kan steriliseres før hver decellulariseringscyklus. I betragtning af tætheden og den relativt store tilstedeværelse af muskler i bagbenet blev både vaskemiddelperfusions- og nedsænkningsmetoder indarbejdet i designet af dette ex vivo-kredsløb for at hjælpe med at få adgang til og decellularisere musklen.
Selvom bioreaktorkammeret og decellulariseringskredsløbet blev omhyggeligt designet og skræddersyet til rottens bagben, har det et reproducerbart design, der kan ændres, når denne protokol tilpasses til andre væv. Yderligere ændringer kan omfatte inkorporering af en boblefælde i perfusionskredsløbet for at sikre, at strømningshastigheden ikke forstyrres på grund af luftbobler 7,8. Desuden inkorporerede vi ikke et trykovervågningssystem til overvågning af perfusionstrykket i hele decellulariseringsperioden. Det er muligt for perfusionstryk at svinge på grund af intraluminal cellulært affald. For nylig rapporterede Cohen et al. midlertidige udsving i perfusionstrykket under SDS-perfusion i en tilgang til at generere vaskulær kimerisme i rottens bagben ved hjælp af en lignende målstrømningshastighed på 1-2 ml / min. Perfusionstrykket blev stabiliseret efter behandling for potentielle træsko9. For fremtidige perfusionssystemdesignændringer til den nuværende protokol kan inkorporeringen af en trykmonitor være informativ om eventuelle intraluminale okklusioner og indikere behovet for behandling for at forhindre skade på vaskulaturen.
I denne model blev udstrømningen observeret under og efter decellularisering. For at sikre stilladsernes levedygtighed og funktionalitet kræves vaskulær patency til levering af ilt og næringsstoffer til forskellige væv i et sammensat transplantat10. Da potentialet i denne decellulariseringsprotokol udvides til yderligere recellulariseringsundersøgelser, er observationen af udstrømning kritisk, så det decellulariserede vaskulære træ kan genbefolkes og refunktionaliseres under recellularisering. Vaskulær billeddannelse kan bruges efter decellularisering til at bekræfte vaskulær patency.
Til dato er der kun udført få undersøgelser af decellularisering af rottebagbenet, med begrænsede resultater på succesen på tværs af hvert af vævsrummene 9,11. De repræsentative resultater i denne undersøgelse viser virkningen af decellularisering på tværs af alle vævsrum, der er til stede i bagbenet. Den kirurgiske metode opretholder også store mængder muskler og hud, der kan biopsieres serielt og bruges til yderligere analyser. Derudover antyder denne protokol en mindre toksisk decellulariseringsmetode ved at anvende en lavere SDS-koncentration end den, der typisk anvendes i decellulariseringsprotokoller for sammensatte og isolerede væv12. Det foreslåede ex vivo-bioreaktorsystem kan også tilpasses til andre væv og modeller.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den foreslåede protokol tilbyder en pålidelig og reproducerbar kirurgisk teknik og decellulariseringsmetode for rottebagben ved hjælp af et ex vivo-maskinperfusionssystem . Fremtidige anvendelser omfatter genbefolkelse af dette stillads med vævsspecifikke celler og undersøgelse af muligheder for regenerering af funktionel kapacitet i væv som knogler, muskler og nerve. Fremtidige undersøgelser kan også karakterisere den ekstracellulære matrix, tilbageholdelsen af den indfødte vaskulatur og biokemiske egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Figur 3A blev oprettet i BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
