Summary
Vi beskriver operasjonsteknikk og decellulariseringsprosess for sammensatte rottebakben. Decellularisering utføres ved bruk av lavkonsentrasjon natriumdodecylsulfat gjennom et ex vivo maskinperfusjonssystem.
Abstract
Pasienter med alvorlige traumatiske skader og vevstap krever komplisert kirurgisk rekonstruksjon. Vascularized composite allotransplantation (VCA) er en utviklende rekonstruktiv vei for overføring av flere vev som en sammensatt underenhet. Til tross for den lovende naturen til VCA, er de langsiktige immunosuppressive kravene en betydelig begrensning på grunn av økt risiko for maligniteter, endeorgantoksisitet og opportunistiske infeksjoner. Vevsteknikk av acellulære komposittstillas er et potensielt alternativ for å redusere behovet for immunsuppresjon. Her beskrives anskaffelsen av en rotte hindlimb og dens påfølgende decellularisering ved bruk av natriumdodecylsulfat (SDS). Anskaffelsesstrategien som presenteres er basert på arteria femoralis. Et maskinperfusjonsbasert bioreaktorsystem ble konstruert og brukt til ex vivo decellularisering av bakbenet. Vellykket perfusjonsdecellularisering ble utført, noe som resulterte i et hvitt gjennomsiktig lignende utseende av bakbenet. Et intakt, perfusabelt, vaskulært nettverk i hele bakbenet ble observert. Histologiske analyser viste fjerning av nukleært innhold og bevaring av vevsarkitektur på tvers av alle vevsrom.
Introduction
VCA er et fremvoksende alternativ for pasienter som krever kompleks kirurgisk rekonstruksjon. Traumatiske skader eller tumorreseksjoner resulterer i volumetrisk vevstap som kan være vanskelig å rekonstruere. VCA tilbyr transplantasjon av flere vev som hud, bein, muskel, nerver og kar som en sammensatt transplantat fra en donor til en mottaker1. Til tross for sin lovende natur er VCA begrenset på grunn av langsiktige immunosuppressive regimer. Livslang bruk av slike legemidler resulterer i økt risiko for opportunistiske infeksjoner, maligniteter og endeorgantoksisitet 1,2,3. For å bidra til å redusere og / eller eliminere behovet for immunsuppresjon, viser vevskonstruerte stillaser som bruker decellulariseringsmetoder for VCA, stort løfte.
Vevsdecellularisering innebærer å beholde den ekstracellulære matriksstrukturen mens du fjerner det cellulære og nukleære innholdet. Dette decellulariserte stillaset kan fylles ut igjen med pasientspesifikke celler4. Imidlertid er bevaring av ECM-nettverket av sammensatte vev en ekstra utfordring. Dette skyldes tilstedeværelsen av flere vevstyper med varierende vevstettheter, arkitekturer og anatomiske steder i et stillas. Den nåværende protokollen tilbyr en kirurgisk teknikk og en decellulariseringsmetode for en rotte bakben. Dette er en proof-of-concept-modell for å anvende denne vevsteknikkteknikken på sammensatte vev. Dette kan også føre til påfølgende innsats for å regenerere sammensatte vev gjennom recellularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cadaveric mannlige Lewis rotter (300-430 g) hentet fra Toronto General Hospital Research Institute ble brukt til alle eksperimenter. For alle kirurgiske prosedyrer ble sterile instrumenter og forsyninger brukt til å opprettholde aseptisk teknikk (se materialtabellen). Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer fra Animal Care Committee ved Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canada). Totalt fire bakben ble decellularisert.
1. Presurgical forberedelse
- Forbered 50 ml 5% heparinisert saltvann. Fra en 50 ml saltvannspose, ta ut 2,5 ml saltoppløsning med en 5 ml sprøyte og kast. Bruk en 5 ml sprøyte til å tilsette 2,5 ml heparin i saltvannsposen. Snu saltvannsposen for å blande innholdet.
- Plasser en kadaverisk rotte i en liggende stilling under en blå pute. Barber bakbenet og lyskeområdet omkrets ved hjelp av en elektrisk barbermaskin og fjern hår.
- Ta rotta til kirurgisk stasjon og bruk Povidone jodskrubbeløsning ved hjelp av en gasbind til bakbenet og lysken. Påfør deretter 70% isopropylalkohol for å tørke av skrubbeløsningen ved hjelp av gasbind.
- Kast den blå matten fra trinn 1.2 og bytt til nye, sterile hansker.
2. Innkjøp av rotte hindlimb
- Lag et hudinnsnitt ved hjelp av et # 10 kirurgisk blad og en # 3 bladløper langs inngangsbåndnivået, som beveger seg fra en lateral til en medial retning (figur 1A). Bruk Adson tang for å holde den omkringliggende huden for å sikre et jevnt snitt.
- Når det underliggende fettet blir utsatt, bruk stump disseksjon for å forsiktig dissekere gjennom fettet. Finn de overlegne epigastriske karene.
- Bruk mikroscissorer til å dissekere proksimalt og eksponere den underliggende lårbenet, arterien og venen på lyskebåndsnivå.
- Under et disseksjonsmikroskop, identifiser lårbenskarene og disseker arterien og venen proksimalt ved hjelp av fine tang for å oppnå tilstrekkelig lengde fra bifurkasjonspunktene i arterielt nettverk (figur 1B).
- Ligate lårarterien og venen separat ved hjelp av 6-0 suturer.
- Utfør circumferensiell disseksjon rundt resten av bakbenet uten å forstyrre de ligerte lårbenene.
- Transekt lårbenet midt i lengden ved hjelp av en beinkutter.
- For å isolere bakbenet fullt ut, transekt de ligerte lårbenene under ligaturene ved hjelp av mikroscissors.
- Kanylere lårarterien ved hjelp av et 24 G angiokateter under disseksjonsmikroskopet. Bruk fine tang for å sette kanylen forsiktig inn. Skyll med heparinisert saltvann til klar utstrømning observeres fra lårbenet.
- Fest kanylen ved å binde en sutur rundt det kanylerte karet og en annen sutur distalt rundt selve kanylen. Sørg for at kanylen er plassert proksimalt for å forhindre blokkering av bifurkasjonspunktene.
- Senk de anskaffede bakbenene i fosfatbufret saltvann (PBS) til decellularisering.
Figur 1: Innkjøp av rottebakben. (A) Merking av hudinnsnitt på inguinal ligamentnivå fra lateral til medial. (B) Utsikt over femoralvenen og lårarterien, som har blitt dissekert proksimalt mot lyskebåndet, indikert med den stiplede linjen. Forkortelser: L = lateral; M = mediale; FV = femoral vene; FA = femoral arterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Fremstilling av løsninger
- I en 6 L glassflaske, lag et 5 L vaskemiddelreservoar med 0,25% natriumdodecylsulfat (SDS) ved å oppløse 12,5 g SDS-pulver i 5 liter ultrarent destillert vann. Dekk åpningen på kolben med parafilm for å forsegle den.
- I en 1 L glassburk, lag 1 liter 0,25% SDS-løsning separat ved å oppløse 2,5 g SDS i 1 liter ultrarent destillert vann. Tilsett en rørestang for å blande løsningen på en magnetisk omrører til all SDS er oppløst.
- Forbered 1 liter 1x PBS vaskeoppløsning med 1% antibiotika-antimykotisk (AA) løsning. I en 1 L kolbe, tilsett 990 ml 1x PBS-løsning og 10 ml AA.
- Separat, i en 500 ml glassburk, lag 1x PBS + 1% AA-løsning igjen ved å bruke 495 ml 1x PBS-løsning og 5 ml AA.
- Klargjør 200 ml 1% pereddiksyre (PAA) / 4% etanol (EtOH) løsning. Forbered denne løsningen under en avtrekkshette.
4. Bioreaktor og perfusjonskretskonstruksjon
MERK: Se figur 2 for konfigurasjon av bioreaktor og perfusjonskrets gjennom de listede trinnene.
- I et 500 ml kammer (plastbeholder) bor du tre hull (1/4 tommer) på de merkede stedene i figur 2: Port A er innløpslinjen, port B er etterfyllingslinjen, og port C er utløpslinjen. Fjern og kast overflødig plast. Spray og tørk av kammeret med 70% etanol.
- Skjær tre 5 cm lange silikonrør og sett en halvveis inn i hver port på kammeret. Koble til en mannlig Luer-kontakt på åpningen av port A som vender mot innsiden av kammeret og en kvinnelig Luer-kontakt i den andre enden av røret utenfor kammeret.
- Koble en kvinnelig Luer-kontakt ved port B og port C på endene av rørene som vender ut av kammeret.
- I et lufttett lokk for plastbeholderen bor du ett hull på overflaten av lokket.
- Klipp et silikonrør på 3 cm og sett det inn i hullet på lokket. Forsikre deg om at ca. 2 cm av røret er plassert ut av lokket, som vist i figur 2.
- Steriliser både kammeret og lokket med slangen.
- Klipp to 30 cm silikonrør med saks. Koble en 1/16 inn til en 1/8 i kontakt på den ene enden av hvert rør.
- Separat kuttes to 12 cm silikonrør ved hjelp av saks. Koble en 1/16 inn til en 1/8 i kontakt på den ene enden av begge rørene. Koble en mannlig Luer-kontakt i den andre enden av det ene røret og en kvinnelig Luer-kontakt til det andre røret.
- Steriliser alt rørmaterialet fra trinn 4.7 og trinn 4.8. Inkluder to 3-trinns pumpeslanger (1,85 mm) i steriliseringen.
- Forbered tre 3-veis stoppekraner, ett sprøytefilter, to 1 ml serologiske pipetter og en 10 ml sprøyte for decellulariseringsoppsettet. Fjern filteret fra de 1 ml serologiske pipettene.
Figur 2: Fremstilling av bioreaktor- og perfusjonskretskonstruksjon. Apparat vist av perfusjonskretsen inkludert (A) peristaltisk pumpe og (B) tilsvarende kassetter for både innløps- og utløpsledninger. (C, D) Silikonrør på 12 cm og 30 cm er også vist med respektive kontakter. (E) Rør for peristaltisk pumpe (1,85 mm). Bioreaktorkammer med merkede porter for (F) innstrømning, (G) etterfyllingsport og (H) utstrømning. (I) Bioreaktorlokk vist med ventilasjonsport. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Decellularisering av rotte bakben
- Plasser det steriliserte kammeret og skru på tre engangs 3-veis stoppekraner ved innløps-, utløps- og etterfyllingslinjene. Forsikre deg om at stoppekranen for påfyllingsporten er avkortet ved de resterende to portene for å forhindre lekkasje.
- Fest rørene i trinn 4.8 til stoppekranene ved innløps- og utløpslinjene.
- Koble peristaltisk rør til rørene i trinnet ovenfor. Fest kassetten på den peristaltiske slangen og legg den på den peristaltiske pumpen. Ikke fest kassettene med slangen på plass ennå.
- Koble ett rør fra trinn 4.7 til enden av den peristaltiske slangen på utløpsledningen fra trinnet ovenfor. Koble en 1 ml serologisk pipette i den andre enden. Heng enden festet med en serologisk pipette i avfallsbeholderkolben.
- Gjenta trinn 4.7 for innløpslinjen. Heng enden av røret festet til den serologiske pipetten inn i vaskemiddelbeholderen. Forsegl åpningen av vaskemiddelbeholderkolben med parafilm umiddelbart. Se figur 3A,B for en oversikt over decellulariseringskretsen.
- Tilsett 0,25% SDS fra 1 L glasskrukke (trinn 3.2) i bioreaktorkammeret på halvveis nivå.
- Ta den anskaffede bakbenet ved hjelp av Adson tang og heng den forsiktig inn i bioreaktorkammeret.
- Bruk to par Adson-tang til å lede den kanylerte delen av bakbenet til innløpslinjen. Mens du holder kanylen med ett par tang, bruk det andre tangparet til å vri og feste innløpslinjen til kanylen. Forsikre deg om at kanylen ikke trekkes eller vris for å forhindre dekanylering.
- Når den er sikret, legg til mer 0,25% SDS fra 1 L glassburken for å senke lemmen helt ned etter behov. Sørg for at utløpsporten også er nedsenket i bioreaktorreservoaret for å sikre at jevn utstrømning opprettholdes (figur 3C).
- Fest et engangssprøytefilter til ventilasjonsporten på lokket på bioreaktorkammeret, med henvisning til trinn 4.4 og trinn 4.5.
- Fest lokket på bioreaktoren og sørg for at kammeret er forseglet fra alle sider (figur 3B).
- For å fjerne luft fra slangen og klargjøre perfusjonskretsen, bruk en ny 10 ml sprøyte til engangsbruk for å trekke vaskemiddel fra vaskemiddelbeholderen ved hjelp av 3-veis stoppekranen ved innløpsledningen.
- Når den er trukket, bruk den samme væsken til å sette inn i 3-veis stoppekranen ved utløpsledningen. Sørg for at det er vaskemiddel tilstede i hele slangen ved både innløps- og utløpsledningene.
- Trykk ned og fest kassettene med slangen i den peristaltiske pumpen. Slå på den peristaltiske pumpen med strømknappen.
- På den peristaltiske pumpeskjermen fortsetter du til den andre fanen ved hjelp av piltasten for å stille inn perfusjonshastigheten for den første kanalen. Inngangsstrømningshastighet som leveringsmåte og sett perfusjonshastigheten til 1 ml / min. Forsikre deg om at strømningsretningen er riktig i henhold til apparatoppsettet. Gjenta for den andre kanalen.
- Kalibrer den peristaltiske pumpen for å sikre at mengden væske som leveres gjennom innløpsledningen og/eller tas fra utløpsledningen, strømmer med en jevn hastighet mellom de to. Kontroller at slange-ID-en er satt til 1,85 mm.
- Begynn decellularisering via maskinperfusjon ved 1 ml / min for både innløps- og utløpslinjene ved å trykke på strømknappen på tastaturet. Overvåk og sørg for at strømmen er jevn og pågående både ved innløps- og utløpslinjene.
- Fortsett decellularisering og overvåk daglig. Bruk 1 liter på 0,25 % SDS (trinn 3.2) til å etterfylle bioreaktorreservoaret gjennom påfyllingsporten etter behov. Se etter et hvitt, gjennomsiktig utseende av vevet, som vil vises innen dag 5, noe som indikerer decellularisering av rottens bakben.
Figur 3: Oversikt over perfusjonsdecellulariseringsbioreaktorkrets av rottebakben. (A) Skjematisk fremstilling av bioreaktorperfusjonskrets. Blå piler indikerer retningen på vaskemiddel og avfallsstrøm. (B) Oversikt over decellulariseringskretsen med bioreaktor som inneholder rotte bakben. SDS-reservoaret (venstre kolbe) fører inn i den peristaltiske pumpen og inn i innløpsrøret til bioreaktoren. Utløpet er koblet til avfallsbeholderen (høyre kolbe) gjennom den peristaltiske pumpen. (C) (I) Bioreaktor som inneholder rotte bakben med innløpsrør koblet til den kanylerte lårarterien. (II) Etterfylling port plassert i hjørnet for perfusing vaskemiddel. (III) Utstrømningsrør suspendert i suspensjonsreservoar. Forkortelse: SDS = natriumdodecylsulfat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Vask og sterilisering etter decellularisering
- Etter bekreftelse av decellularisering, erstatt vaskemiddelbeholderen med 1x PBS + 1% AA-reservoaret. Forsegl åpningen av kolben med parafilm. Begynn 1x PBS + 1% AA-perfusjon ved 1 ml / min og fortsett i 2 dager.
- Erstatt 1x PBS + 1% AA-reservoar med 200 ml 0,1% PAA / 4% EtOH-reservoar og begynn perfusjon ved 1 ml / min i 2 timer.
- Koble bakbenet fra innløpslinjen ved hjelp av to par sterile Adson-tang, der den ene tangen vrir innløpslinjen og den andre holder kanylen. Sørg for at kanylen ikke trekkes for å forhindre dekanylering.
- Oppbevar lemmet i en 500 ml glasskrukke inneholdende 1x PBS + 1% AA ved 4 °C inntil videre bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anskaffelsesprotokollen var vellykket i å isolere og kanylere de vanlige lårarteriene for påfølgende perfusjonstrinn. De representative disseksjonsbildene i figur 1A,B viser snittplassering og eksponering av lårbenskarene med tilstrekkelig avstand fra bifurkasjonspunktene. Figur 2 viser apparatet som kreves for tilberedning av bioreaktor og perfusjonskrets. Endepunktet for decellularisering ble bestemt ved å observere et hvitt, gjennomsiktig utseende av vevet. Ex vivo maskin perfusjonssystemet var vellykket i perfusjonsdecellulariseringen av rottebakbenet. En enkeltpass, lukket systemkrets ble opprettholdt (figur 3). Den opprinnelige baklemmens grove morfologi endret seg til et hvitt, blekt utseende etter 5 dager med 0,25 % SDS-perfusjon (figur 4).
Fjerning av cellulært innhold ble observert når det ble farget med hematoksylin og eosin (H&E) i lårbenene, huden, nerven, beinet og muskelen der ingen kjerner ble funnet. Strukturene i hver vevstruktur ble analysert i forhold til innfødt vev. Både decellularisert lårarterie og vene viste tap av nukleært innhold over alle lag og omkringliggende bindevev, gitt mangel på blåfargede kjerner, ellers tilstede i de innfødte karene (figur 5A, B og figur 5D, E). Tunica intima, media og adventitia av både lårvenen og arteriene ble opprettholdt i de decellulære karene (figur 5D, E). Lårbensnerven viste bevaring av vevsstruktur, inkludert endoneurium (figur 5C og figur 5F). Benet beholdt sin overordnede vevsstruktur etter decellularisering, med et observerbart tap av fargede kjerner av osteocytter fra beinet og fra omkringliggende endosteum- og periosteumlag (figur 5G og figur 5J). Huden viste et tap av celler fra epidermis og dermis. Dermis viste tilbakeholdte kollagenfibre, lik innfødt hudvev (figur 5H og figur 5K). Til slutt viste det tverrgående synet av skjelettmuskulatur tap av kjerner som ellers befinner seg i periferien av endomysium. Myofiberinnholdet forble beholdt innenfor respektive fascikler etter decellularisering (figur 5I og figur 5L). Det ble også utført DNA-kvantifisering ved hjelp av Picogreen, der DNA-innholdet ble signifikant redusert over lårbein, nerve, hud, muskel og bein (figur 6).
Figur 4: Grov morfologi hos innfødte og decellulariserte bakben hos rotter. (A) Arteria femoralis i native hindlimb kanylert med 24 G angiokateter etter anskaffelse. (B) Hvitt, gjennomsiktig utseende av bakben etter 5 dager med decellularisering med 0,25% SDS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Histologisk farging av rottebakvevet ved bruk av hematoksylin og eosin. H&E-farget innfødt (topppanel) og decellularisert (bunnpanel) (A, D) vena femoralis og (B, E) arterie, (C, F) nerve, (G, J) bein, (H, K) hud og (I, L) muskel. Tap av kjerner og cellulært innhold synlig i alle decellulariserte prøver. Skalastenger = 200 μm (kar, nerve, bein) og 300 μm (hud, muskel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: DNA-kvantifisering av innfødt og decellularisert rotte bakbenvev. DNA-innholdet reduseres over innfødte og decellulære kar, nerve, muskel, hud og bein, uttrykt i ng / mg tørrvekt. Vev ble tørket og fordøyd i papain over natten ved 65 °C. DNA ble fluorescerende påvist med PicoGreen. Det ble utført flere uparret t-test. Data presentert som gjennomsnitt ± SD. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: N = innfødt; D = decellularisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotte hindlimbs er nyttige som eksperimentelle modeller i VCA5. Vevsteknikk av acellulære stillaser representerer det første trinnet i å takle manglene ved langsiktige immunsuppresjonsregimer assosiert med VCA. Bruken av kompositttransplantater utgjør en ekstra utfordring gitt tilstedeværelsen av flere vev, som hver har unike funksjonelle, immunogene og strukturelle egenskaper. Den nåværende protokollen viser en vellykket metode for å skaffe acellulære sammensatte rotte bakben. Disse stillasene kan videreutvikles og representerer en proof-of-concept-modell for VCA.
For å sikre vellykket innkjøp og decellularisering er det ulike kritiske trinn i de kirurgiske og decellulariseringsfasene. For å sikre systemisk fordeling av vaskemiddelet og sterilantløsningen gjennom den opprinnelige vaskulaturen, inkluderer de kritiske trinnene ligering av de epigastriske karene, samt å oppnå tilstrekkelig avstand fra bifurkasjonspunktene i det arteriovenøse nettverket før ligering av lårbenene. Den beskrevne steriliseringsprosedyren bidrar til å redusere biobyrden for recellulariseringseksperimenter der et sterilt miljø er nødvendig for cellevedlegg, overlevelse og vekst6.
Vi presenterer også et perfusjonsbioreaktorsystem som ble designet for å implementere decellularisering. Kritiske komponenter inkluderer evnen til kontinuerlig perfusjon ved hjelp av en peristaltisk pumpe og tillater enkeltpassperfusjon av vaskemiddelet og sterilanten gjennom den kanylerte arterien. Den peristaltiske pumpen ble også satt til en pulsatil strømning, som ligner på fysiologiske forhold. Til slutt ble det inkludert en påfyllingsport for etterfylling av suspensjonsreservoaret i bioreaktoren uten å utsette bakbenet for det ytre miljø. Dette bioreaktorsystemet er derfor fordelaktig, da det kan decellularisere og sterilisere en rotte bakben ex vivo i et lukket system, single-pass mote. Komponentene i kretsen er autoklaverbare og kan steriliseres før hver decellulariseringssyklus. Gitt tettheten og relativt stor tilstedeværelse av muskler i bakbenet, ble både vaskemiddelperfusjons- og nedsenkingsmetoder innlemmet i utformingen av denne ex vivo-kretsen for å hjelpe til med å få tilgang til og decellularisere muskelen.
Selv om bioreaktorkammeret og decellulariseringskretsen ble nøye designet og skreddersydd for rottehindlimben, har den en reproduserbar design som kan modifiseres når man tilpasser denne protokollen for andre vev. Ytterligere modifikasjoner kan omfatte å inkorporere en boblefelle i perfusjonskretsen for å sikre at strømningshastigheten ikke forstyrres på grunn av luftbobler 7,8. Videre inkorporerte vi ikke et trykkovervåkingssystem for å overvåke perfusjonstrykket gjennom hele varigheten av decellularisering. Det er mulig for perfusjonstrykk å svinge på grunn av intraluminalt cellulært rusk. Nylig rapporterte Cohen og medarbeidere midlertidige svingninger i perfusjonstrykk under SDS-perfusjon i en tilnærming for å generere vaskulær kimærisme i rottebakbenet, ved bruk av en lignende målstrømningshastighet på 1-2 ml / min. Perfusjonstrykket ble stabilisert etter behandling for potensielle tresko9. For fremtidige perfusjonssystemdesignmodifikasjoner for den nåværende protokollen, kan inkorporering av en trykkmonitor være informativ for eventuelle intraluminale okklusjoner og indikere behovet for behandling for å forhindre skade på vaskulaturen.
I denne modellen ble utstrømningen observert under og etter decellularisering. For å sikre levedyktighet og funksjonalitet av stillasene, er vaskulær patency nødvendig for levering av oksygen og næringsstoffer til forskjellige vev i en sammensatt graft10. Med potensialet i denne decellulariseringsprotokollen som utvides til ytterligere recellulariseringsstudier, er observasjonen av utstrømning kritisk, slik at det decellulære vaskulære treet kan bli repopulated og refunksjonalisert under recellularisering. Vaskulær avbildning kan brukes etter decellularisering for å bekrefte vaskulær patency.
Til dags dato har det blitt utført få studier på decellularisering av rottebakbenet, med begrensede resultater på suksessen på tvers av hvert av vevsrommene 9,11. De representative resultatene i denne studien viser virkningen av decellularisering på tvers av alle vevsrom som er tilstede i bakbenet. Den kirurgiske metoden opprettholder også store mengder muskler og hud som kan serielt biopsieres og brukes til videre analyser. I tillegg antyder denne protokollen en mindre giftig decellulariseringsmetode ved å bruke en lavere SDS-konsentrasjon enn det som vanligvis brukes i decellulariseringsprotokoller for kompositt og isolert vev12. Det foreslåtte ex vivo bioreaktorsystemet kan også tilpasses for andre vev og modeller.
Avslutningsvis tilbyr den foreslåtte protokollen en pålitelig og reproduserbar kirurgisk teknikk og decellulariseringsmetode for rottehindlimbs ved bruk av et ex vivo maskinperfusjonssystem. Fremtidige applikasjoner inkluderer repopulating dette stillaset med vevsspesifikke celler og undersøke veier for regenerering av funksjonell kapasitet i vev som bein, muskel og nerve. Fremtidige studier kan også karakterisere den ekstracellulære matrisen, oppbevaring av den opprinnelige vaskulaturen og biokjemiske egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Figur 3A ble opprettet i BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
References
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
