Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Bu yazıda, ara yüz morfolojisini görselleştirirken ara yüz gerilimi ve yüzey dilatasyonel reolojisinin eşzamanlı ölçümlerini yapmak için bir mikrotensiyometre/konfokal mikroskobun tasarımı ve çalışması anlatılmaktadır. Bu, teknoloji ve fizyolojide önemli olan arayüzlerin yapı-özellik ilişkilerinin gerçek zamanlı olarak inşasını sağlar.

Abstract

Yüzey-aktif moleküllerin sıvı-sıvı arayüzlerine adsorpsiyonu doğada her yerde bulunur. Bu arayüzlerin karakterize edilmesi, yüzey aktif madde adsorpsiyon oranlarının ölçülmesini, denge yüzey gerilimlerinin toplu yüzey aktif madde konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak değerlendirilmesini ve yüzey geriliminin dengeyi takiben ara yüzey alanındaki değişikliklerle nasıl değiştiğini ilişkilendirmeyi gerektirir. Yüksek hızlı konfokal mikroskopla floresan görüntüleme kullanılarak arayüzün eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, yapı-fonksiyon ilişkilerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Kılcal basınç mikrotensiyometresinde (CPM), kılcal damarın ucunda 1 mL hacimli bir sıvı haznesinde yarım küre şeklinde bir hava kabarcığı sabitlenir. Kabarcık arayüzü boyunca kılcal basınç, Laplace denklemine dayalı model tabanlı basınç, kabarcık eğriliği veya kabarcık alanı kontrolüne izin veren ticari bir mikroakışkan akış kontrolörü aracılığıyla kontrol edilir. Langmuir oluğu ve kolye damlası gibi önceki tekniklerle karşılaştırıldığında, ölçüm ve kontrol hassasiyeti ve tepki süresi büyük ölçüde geliştirilmiştir; kılcal basınç değişimleri milisaniyeler içinde uygulanabilir ve kontrol edilebilir. Kabarcık arayüzünün dinamik tepkisi, kabarcık genişledikçe ve büzüldükçe ikinci bir optik lens aracılığıyla görselleştirilir. Kabarcık konturu, kabarcık eğriliği yarıçapını, R'yi ve sonuçları geçersiz kılacak dairesellikten sapmaları belirlemek için dairesel bir profile uygundur. Laplace denklemi, arayüzün dinamik yüzey gerilimini belirlemek için kullanılır. Dengeyi takiben, dilatasyon modülünü belirlemek için kabarcık yarıçapını (0.001-100 döngü / dak frekansları) salınımına sokmak için bilgisayar kontrollü mikroakışkan pompa tarafından küçük basınç salınımları uygulanabilir Sistemin genel boyutları, mikrotensiyometrenin yüksek hızlı bir konfokal mikroskobun merceğinin altına sığacak kadar küçüktür.

Introduction

Yüzey aktif madde filmlerinin kapladığı hava-su arayüzleri günlük yaşamda her yerde bulunur. Yüzey aktif madde-su enjeksiyonları, tükenmiş alanlardan petrol geri kazanımını arttırmak için kullanılır ve kaya gazı ve petrol için hidrolik kırılma çözümleri olarak kullanılır. Gaz-sıvı köpükler ve sıvı-sıvı emülsiyonlar, yağlayıcılar ve temizlik maddeleri olarak birçok endüstriyel ve bilimsel proseste ortaktır ve gıdalarda yaygındır. Arayüzlerdeki yüzey aktif maddeler ve proteinler, paketleme, depolama ve uygulama sırasında antikor konformasyonlarını stabilize eder 1,2,3,4,5, gözdeki gözyaşı filmi stabilitesi 6,7,8 ve pulmoner mekanik9,10,11,12,13,14, 15.

Arayüzlere adsorbe olan yüzey aktif ajanların veya yüzey aktif maddelerin ve özelliklerinin incelenmesi, birçok farklı deneysel teknikle uzun bir geçmişe sahiptir 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Son zamanlarda ortaya çıkan bir gelişme, diğer yaygın yöntemlerden önemli ölçüde daha az malzeme kullanırken, çok daha küçük uzunluk ölçeklerinde, yüksek kavisli arayüzlerde ara yüzey özelliklerinin incelenmesine izin veren kılcal basınç mikrotensiyometresidir (CPM) 9,23,24,25. Konfokal floresan mikroskobu (CFM), CPM 22'deki hava-su arayüzlerinde veya Langmuir oluklarında 20,26,27,28,29'daki lipitlerin ve proteinlerin morfolojisini incelemek için kullanılabilir. Burada bir CPM ve CFM, biyolojik ve teknolojik arayüzler için yapı-işlev ilişkileri geliştirmek üzere morfolojik fenomenleri dinamik ve denge ara yüzey özelliklerine bağlamak için birleştirilmiştir.

CPM-CFM'nin erişebildiği ara yüzey aktif madde sistemlerinde çok sayıda önemli parametre vardır. CPM'de, 30-200 μm çapında bir hava kabarcığı bir cam kılcal tüpün ucuna sabitlenir. CPM'nin önceki versiyonlarında, kabarcığın içi ve dışı arasındaki kılcal basınç farkı bir su sütunu ve salınımlı şırınga pompası 9,30 ile kontrol edildi; burada açıklanan yeni versiyon, bunları daha yüksek hassasiyetli, bilgisayar kontrollü bir mikroakışkan pompa ile değiştiriyor. Yüzey gerilimi (γ), ΔP = 2γ / R Laplace denklemi aracılığıyla, pompa tarafından ayarlanan arayüz boyunca basınç düşüşünden, ΔP ve kabarcığın eğrilik yarıçapının optik analizinden, R'den belirlenir. Arayüzün dinamik yüzey gerilimi, çözünür bir yüzey aktif madde içeren dökme bir sıvı ile temas halinde yeni bir kabarcığın oluşturulmasını takiben 10 ms zaman çözünürlüğü ile belirlenebilir. Yüzey aktif madde adsorpsiyon dinamikleri, difüzyon, yüzey kapsamı ve kütle konsantrasyonu ile denge yüzey gerilimi arasındaki ilişki de dahil olmak üzere yüzey aktif maddenin temel özelliklerini belirlemek için klasik Ward-Tordai denklemi 10,31 ile tanımlanabilir. Bir denge yüzey gerilimi elde edildikten sonra, ara yüzey alanı, kabarcık yüzey alanındaki küçük değişikliklerin neden olduğu yüzey gerilimindeki değişiklikleri kaydederek, Equation 1dilatasyonel modülü ölçmek için salınımlı olabilir, A32. Dolaşık polimerler veya proteinler gibi kendi iç yapılarını geliştiren daha karmaşık arayüzler için, yüzey gerilimi, daha genel bir yüzey gerilimi 4,33, Equation 2ile değiştirilir.

Solunum sırasındaki akciğer stabilitesi, alveolar hava-sıvı arayüzünde hem düşük yüzey geriliminin hem de yüksek dilatasyonel modülün korunmasına doğrudan bağlı olabilir 9,10. Tüm iç akciğer yüzeyleri, doku hidrasyonunu korumak için sürekli, mikron kalınlığında bir epitel astar sıvısı filmi ile kaplanmıştır34. Bu epitel astar sıvısı öncelikle sudur, tuzlar ve diğer çeşitli proteinler, enzimler, şekerler ve akciğer yüzey aktif maddesi içerir. Herhangi bir kavisli sıvı-buhar arayüzünde olduğu gibi, alveolusun (veya kabarcığın) iç kısmında daha yüksek olan basınçla kılcal bir basınç indüklenir. Bununla birlikte, yüzey gerilimi akciğerlerin her yerinde sabit olsaydı, Laplace denklemi, ΔP = 2γ / R, daha küçük alveollerin daha büyük alveollere göre daha yüksek bir iç basınca sahip olacağını ve daha küçük alveollerin gaz içeriğini daha büyük, daha düşük basınçlı alveollere akmaya zorladığını gösterir. Bu, "Laplace Kararsızlığı" olarak bilinir9,35. Net sonuç, en küçük alveollerin çökeceği ve sıvı ile doldurulacağı ve akciğerin bir kısmının çökmesine neden olacak şekilde yeniden şişirilmesi zorlaşacak ve diğer kısımların aşırı şişeceğidir, her ikisi de akut solunum sıkıntısı sendromunun (ARDS) tipik semptomlarıdır. Bununla birlikte, düzgün çalışan bir akciğerde, alveolus ara yüz bölgesindeki hava-epitelyal sıvı arayüzü solunum sırasında genişledikçe ve büzüldükçe yüzey gerilimi dinamik olarak değişir. Eğer Equation 3, veya Equation 4, Laplace basıncı azalan yarıçapla azalır ve Laplace dengesizliğini ortadan kaldırmak için artan yarıçapla artar, böylece akciğer9'u stabilize eder. Bu nedenle, Equation 5ve frekansa, tek katmanlı morfolojiye ve bileşime ve alveoler sıvı kompozisyonuna nasıl bağlı olduğu akciğer stabilitesi için gerekli olabilir. CPM-CFM ayrıca ara yüzey eğriliğinin yüzey aktif madde adsorpsiyonu25, tek katmanlı morfoloji 22 ve dilatasyonel modül9 üzerindeki etkilerinin ilk gösterimlerini sağlamıştır. CPM'deki rezervuarın küçük hacmi (~ 1 mL), sıvı fazın hızlı bir şekilde tanıtılmasına, çıkarılmasına veya değiştirilmesine izin verir ve gerekli miktarda pahalı protein veya yüzey aktif maddeyi en aza indirir10.

CPM-CFM görüntüsündeki kontrast, floresan olarak etiketlenmiş lipitlerin veya proteinlerin küçük fraksiyonlarınınarayüz 16,27'de dağılmasından kaynaklanmaktadır. İki boyutlu yüzey aktif madde monokatmanları genellikle yüzey gerilimi veya yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak yanal faz ayrımı sergiler, π 0 γ temiz bir sıvı-sıvı arayüzünün yüzey gerilimi ile yüzey faktan kaplı bir arayüz arasındaki farktır γ. π, Equation 6 saf sıvı yüzey gerilimini düşürmek için hareket eden arayüzdeki yüzey aktif madde moleküllerinin etkileşimlerinin neden olduğu 2-D "basınç" olarak düşünülebilir. Düşük yüzey basınçlarında, lipit monokatmanları sıvı benzeri düzensiz bir durumdadır; bu, sıvı genişlemiş (LE) faz olarak bilinir. Yüzey basıncı arttıkça ve lipit molekülü başına düşen alan azaldıkça, lipitler birbirleriyle birlikte yönlendirilir ve uzun menzilli sıralı sıvı yoğunlaştırılmış (LC) faz 16,20,27'ye birinci dereceden bir faz geçişine geçebilir. LE ve LC fazları çeşitli yüzey basınçlarında bir arada bulunabilir ve floresan etiketli lipitler LC fazından dışlanıp LE fazına ayrıldığı için görselleştirilebilir. Böylece, CFM16 ile görüntülendiğinde LE fazı parlak ve LC fazı karanlıktır.

Bu makalenin amacı, kombine konfokal mikroskop mikrotensiyometresini oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli adımları tanımlamaktır. Bu, okuyucunun adsorpsiyon çalışmaları yapmasına, yüzey gerilimini, reolojik davranışı ölçmesine ve mikron ölçekli bir hava / su veya yağ / su arayüzünde aynı anda ara yüzey morfolojisini incelemesine olanak tanır. Bu, gerekli kılcal damarların nasıl çekileceği, kesileceği ve hidrofobikleştirileceği, basınç, eğrilik ve yüzey alanı kontrol modlarının kullanımı için talimatlar ve çözünmeyen yüzey aktif maddenin mikrotensiyometre kavisli arayüze ara yüz transferi hakkında bir tartışmayı içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kılcal tüplerin hazırlanması

  1. Kılcal damarı bir kılcal çektirmeye yerleştirin ve ucunda ~ 1 μm dış çapa (OD) sahip iki konik kılcal damar yapmak için istenen çekme programını çalıştırın.
    NOT: Çekmeden önce kılcal damarın OD'si, mikrotensiyometre hücresindeki kılcal tutucuya sığacak şekilde belirtilen OD olmalıdır. Kılcal damarın iç çapı (ID) değişebilir, ancak çekmeyi takiben kılcal damarın kritik yarıçapını etkileyecektir. Bir çekme programı seçilir, böylece elde edilen konik başlangıçta kılcal OD ve ID'yi hızlı bir şekilde azaltır, daha sonra istenen kılcal OD ve ID'nin yakınında bir yarıçapa ulaşır ve daha sonra çapı daha yavaş azaltır. Bu, ID'de 30-100 μm'lik kullanılabilir bir kılcal damar elde etmek için puanlanabilen daha büyük bir kılcal uzunluk yaratacaktır.
  2. 30-100 μm'lik bir kimlik elde etmek ve ucu kırmak için kılcal damarın ucunu istenen noktada puanlayın. Kılcal damar artık ucunda istenen yarıçapın bir OD'sine ve ID'sine sahip olacaktır (Şekil 1A). Kılcal damarlar 2. adıma kadar saklanabilir.
    NOT: Kılcal damarın kesme kenarı 90° temiz bir mola olmalıdır. Kesme kenarındaki herhangi bir kusur, kabarcığın kılcal damar ve zayıf yüzey özelliği ölçümlerine kötü sabitlenmesine yol açacaktır. Konik kılcal uçlar çok hassastır. Çözeltilerden başka herhangi bir şeyle temas ederlerse (örneğin, şişe duvarları, hava nozulu) imha edilirler.

2. Kılcal damarların hidrofobikleşmesi

  1. Çekilmiş cam kılcal damarları, asit temizleme çözeltisini, plastik cımbızları, deiyonize (DI) suyu, hidrofobibizasyon çözeltisini (etanolde% 2 silane), vakum pompasını ve etanol çözeltisini toplayın. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
    DİKKAT: Asit temizleme solüsyonu akut toksiktir, cilt ve göz korozyonuna / tahrişine neden olur, oksitleyicidir. Hidrofobizasyon çözeltisi bir cilt / göz / solunum tahriş edicidir. Göz koruyucu, laboratuvar önlükleri ve eldivenler giyin ve duman davlumbazındaki solüsyonlarla çalışın.
  2. Kılcal damarı asitle temizleyin
    NOT: Kılcal damarın asit ile temizlenmesi, kılcal damar içindeki organik kalıntıları giderir ve cam yüzeyi, kılcal hidrofobik hale getiren silanizasyon reaksiyonu için hazırlar.
    1. Cımbızla geniş ucuna sıkıca yakın bir kılcal damar tutun.
    2. Konik ucu asit temizleme çözeltisine batırarak hortumu vakum pompasından kılcal damarın geniş ucuna takın. Bu, çözeltiyi kılcal damar içine emecektir.
      NOT: Kılcal hortumun ucuna, kılcal uçla daha iyi oturması için bir pipet ucu takılabilir.
    3. Asit temizleme çözeltisi kılcal damarın yaklaşık yarısını doldurduğunda durun.
      NOT: Kılcal ucun asit temizleme çözeltisinden çıkarılmasından sonra, kılcal damarın dışındaki çözelti genellikle kılcal ucun yakınında bir boncuk oluşturur. Fazla çözeltiyi çıkarmak için kılcal damarı çözelti şişesinin boynuna hafifçe dokunun.
    4. Asit temizleme çözeltisinin kılcal damarlarda en az 30 dakika kalmasına izin verin ve sıvının tıkaçının kılcal damarın konik ucunda kalmasını sağlayın.
    5. Kılcal damarı cımbızla sıkıca tutarak ve sıvıyı kılcal damarın büyük ucundan çıkarmak için vakum hortumunu kullanarak asit temizleme solüsyonunu kılcal damardan çıkarın.
  3. Kılcal damarı durulayın
    1. Kılcal damarın konik ucunu DI suyuna batırın, asit temizleme çözeltisine batırılmış herhangi bir dış yüzeyi kaplayacak kadar derine batırılmasını sağlayın. Uç suya batırılmışken, DI suyunu kılcal damardan çekmek için vakum hortumunu kullanın. Kılcal damarı sudan çıkarın ve kalan suyu vakum hortumuyla çıkarın.
    2. Yukarıdaki adımı en az 4 kat tekrarlayın.
  4. DI suyu yerine etanol koyarak adım 2.3'ü tekrar uygulayın.
  5. Etanol kılcal damarın içinden tamamen buharlaşana kadar sürekli olarak emme uygulayın. Kılcal damar, etanol buharlaşmaya başladığında dokunmak için bulanık ve serin hale gelecektir, ancak 30 ila 45 s'den sonra temizlenecektir.
  6. Kılcal damarı hidrofobikleştirme çözeltisi ile kaplayın
    1. Kılcal damarın geniş ucunu etanol çözeltisindeki ~% 2 silana kısaca batırın. Kılcal hareket, kaplama çözeltisinin kılcal damar içinde yükselmesine neden olur. Kılcal damar içinde ~ 1 cm boyutunda bir tıkaç yükseldikten sonra kılcal damarı çözeltiden çıkarın.
    2. Kılcal damarı, konik uç aşağı bakacak şekilde yönlendirin, böylece kaplama çözeltisinin yerçekimi ile konik uca doğru düşmesine izin verin.
    3. Kaplama çözeltisinin kılcal damarda en az 3 dakika kalmasına izin verin.
      NOT: Konik ucun iç kısmıyla temas eden kaplama çözeltisinin tapasında hava kabarcıkları olmamalıdır. Bir hava kabarcığı varsa, kılcal iç kısım muhtemelen adım 2.5'te yeterince kurutulmamıştır. Bunu gidermek için, 2.4-2.6 arasındaki adımları gerektiği gibi yineleyin.
  7. Kılcal damarları etanol 1x ile adım 2.3 ile aynı şekilde durulayın.
  8. Hidrofobik kaplamayı kılcal damar üzerine yerleştirin
    1. Temiz ve kuru parıltılı şişeleri 120 °C'ye ayarlanmış bir vakumlu fırına yerleştirin. Kaplanmış kılcal damarları, şişenin tabanına dayanan geniş uçlu şişelere (ideal olarak şişe başına bir kılcal damar) yerleştirin. Hidrofobik silan tabakasının kılcal damarlara kalıcı olarak bağlanmasını sağlamak için kılcal damarların fırında en az 6 saat (gece boyunca tercih edilen) kalmasına izin verin. Kılcal damarlar 4. adıma kadar saklanabilir.

3. Numune hazırlama ve depolama

  1. Kirlenmeyi önlemek için yüzey aktif madde ve florofor çözeltilerini temiz asitle yıkanmış şişelerde karıştırın ve saklayın.
    NOT: Ticari olarak temin edilebilen lipitler en yüksek saflıkta olmalı ve kullanım arasında - 20 ° C'de depolanmalıdır. Eski veya kontamine lipitler genellikle sonuçların çoğaltılmasının zor olmasına neden olur.

4. Mikrotensiyometrenin kurulması

  1. BGBM hücresini Şekil 2'de açıklandığı gibi birleştirin.
    1. Kılcal damarın büyük tarafını, hücrenin alt tarafına doğru itinceye kadar CPM hücresinin üstüne yerleştirin.
    2. Kılcal damarı sabitlemek için PEEK fişini yavaşça sıkın ve ardından tüpü mikroakışkan pompadan kılcal damarın büyük tarafına takın. Konik kılcal uca dokunmamaya dikkat edin.
  2. Gerektiğinde, rezervuar değişimi ve/veya sıcaklık kontrol hortumlarını CPM hücresi üzerindeki ilgili giriş ve çıkışlara takın (Şekil 2); aksi takdirde, kullanılmayan giriş ve çıkışları takın.
  3. CPM hücresini konfokal mikroskop aşamasına takın, kabaca CFM hedefi, CPM kamera ve CPM ışık kaynağı ile hizalayın (Şekil 3).
  4. Pompanın önerilen çalışma basıncında (burada kullanılan mikroakışkan pompa için 150 mbar) mikroakışkan pompaya gaz akışını açın ve kılcal damara akışın açık olduğundan emin olun.
  5. CPM sanal arabirimini (Ek Kodlama Dosyası 1: Mikrotensiyometre Sanal Interface.vi) kılcal basınç salınım frekansı ve genliği sıfıra ayarlanmış olarak Basınç Kontrolü modunda çalıştırmaya başlayın (Şekil 4-7). Şekil 4'te sanal arabirimin ekran görüntüsü gösterilmektedir. DI suyu ve ~35 μm'lik kılcal yarıçap için, ~20 mbar'lık bir basınç, kılcal damara su girmemesini sağlar.
  6. CPM hücresini pipet kullanarak suyla doldurun.
  7. Mikrotensiyometre kamerayı kullanarak kılcal uca odaklanın.
  8. CFM ile kılcal uca odaklanın. Kılcal damarı bulmakta zorluk çekiyorsanız, CFM hedefini bulmak için CPM kamerayı kullanın. Bu, CFM hedefi ile kabarcık arasındaki mesafeyi yaklaşık olarak belirlemeye yardımcı olacak ve doğru çalışma mesafesine ulaşacaktır.
  9. Anulus (yeşil sektör projeksiyonu) kabarcık üzerinde ortalandıktan sonra, odağı kabarcık kenarının net bir şekilde görülebilmesi için manuel olarak ayarlayın (Şekil 4-3).
    NOT: Annulusun konumu, başlangıç ve bitiş açısı ile iç ve dış yarıçapları, görünüm penceresinin altındaki menüden ayarlanabilir.
  10. Balonu Sıfırla'ya tıklayın ve yeni bir kabarcığın oluştuğundan emin olun (biri eski kabarcık patlamasını duyabilecek ve yeni kabarcık kontrol paneli görüntüleme penceresinden gözlemlenebilecektir; Şekil 4-3). Kabarcık açılmazsa, görüntüleme penceresinin altındaki Kabarcık Sıfırlama sekmesinde Sıfırlama Basıncını veya Sıfırlama Gecikme Süresi'ni artırın . Yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m (tuzlu su veya su/hava kabarcıkları için) olup olmadığını kontrol edin (Şekil 4-9).
  11. Suyu doğrudan hücreye şırınga yoluyla çıkarın (Şekil 3-13), boşaltın ve tekrar takın. Örnek, denemeyi çalıştırmak için yüklenmeye hazırdır.

5. Adsorpsiyon çalışması

  1. CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi istediğiniz numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda ilk yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.
  2. Yeni oluşturulan kabarcığın yarıçapını belirleyin ve bu değeri merkez çizgisi alan kontrolüne girin (Şekil 4-7) ve Alan Kontrolü sekmesine tıklayarak kontrol türünü alan kontrolü olarak değiştirin (Şekil 4-8).
    NOT: Sabit basınç kontrolü de kullanılabilir, ancak bu, arayüzün yüzey gerilimi değiştikçe kabarcık yarıçapının sürekli değişmesine neden olur. Bu değişen alan, yüzey aktif madde adsorpsiyon oranlarının analizini zorlaştırabilir ve çalışma sırasında kabarcığın patlamasına neden olabilir.
  3. Konfokal videoyu kaydetmeye başlayın.
  4. Balonu Sıfırla'ya tıklayın (Şekil 4-5) ve hemen Veri Topla'ya tıklayın (Şekil 4-6). Düğmedeki sinyal ışığı yeşile döner.
  5. Veri kayıt hızını, Şekil 4-6'da gösterilen çubuğu kaydırarak numunenin konsantrasyonuna göre ayarlayın. Daha yavaş adsorpsiyonlar için daha yavaş bir kayıt hızı kullanın. Bu, daha yüksek bir kayıt hızı erken dönemde istenirse bir çalıştırmanın ortasında ayarlanabilir, ancak dosya boyutunu küçültmek için uzun çalışmalar için daha yavaş bir hız tercih edilir.
  6. Deneyin bitiminden sonra (son bir yüzey gerilimi platosuna ulaşıldığında), doğru dosya yolunu seçerek (Şekil 4-1) ve Kaydet düğmesine tıklayarak (Şekil 4-2) dosyayı kaydedin.
  7. Kaydı CFM'de de durdurun ve kaydedin.

6. Salınım/gevşeme çalışması

  1. CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.
  2. Örnek arayüze tamamen adsorbe edilene kadar bekleyin. Bu, yeni bir kabarcık arayüzü ile baştan başlamak yerine doğrudan bir adsorpsiyon çalışmasından sonra gerçekleştirilebilir.
  3. Uygun sekmeyi seçerek (Şekil 4-8) ve istenen taban çizgisi değerini, salınım yüzdesini ve salınım sıklığını girerek (Şekil 4-7) salınımın bir basınç salınımı mı, alan salınımı mı yoksa eğrilik salınımı mı olacağına karar verin.
    NOT: Testere dişi, kare ve üçgen dalga alanı salınımlarına Diğer Alan Salınımı sekmesindeki açılır menüden de erişilebilir.
  4. Konfokal videonun kaydını başlatın ve CPM yazılımında Veri Topla'ya (Şekil 4-6) tıklayın.
  5. Salınımı başlatın. En iyi sonuçlar için en az yedi döngü kaydettiğinizden emin olun. Her salınım döngüsü için yeterli sayıda veri noktası vermek üzere bir veri toplama hızı seçin (Şekil 4-6).
  6. Diğer salınım genlikleri veya frekansları isteniyorsa, deney sırasında değerleri değiştirin.
  7. Sonuçları adım 5.6 ve 5.7'deki gibi kaydedin.

7. Solvent değişim çalışması

  1. CPM yazılımını basınç kontrol modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.
    NOT: Solvent değişim çalışmasından önce adsorpsiyon ve/veya salınım çalışmaları yapılabilir.
  2. Giriş tüpünü istenen değişim çözeltisinin şişesiyle (Şekil 3-11) peristaltik pompaya bağlayın (Şekil 3-10).
  3. Videonun kaydını konfokal yazılımda başlatın ve CPM yazılımında Veri Topla'ya (Şekil 4-6) tıklayın.
  4. Peristaltik pompa hızını ayarlayın. Bu, sıvı değişim hızını kontrol edecektir ve deneyin gerekliliklerine, yani çözücünün ne kadar hızlı değiştirilmesi gerektiğine göre seçilmelidir.
  5. Birden fazla sıvının değiştirilmesi gerekiyorsa, peristaltik pompayı durdurun ve girişi başka bir değişim çözümüne bağlayın.
  6. Değişim bittikten sonra (~20 dakika), sonuçları adım 5.6 ve 5.7'deki gibi kaydedin.

8. Çözünmeyen yüzey aktif madde adsorpsiyonu

NOT: Adsorbe edilecek yüzey aktif madde rezervuar sıvısında çözünür değilse, bu yöntem hücrenin hava/su arayüzünden kabarcık yüzeyine bir monolayer aktarmak için kullanılabilir. Birçok çift katmanlı oluşturan lipit, tuzlu su çözeltisinde neredeyse çözünmez ve rezervuar çözeltisinde asılı kaldığında kendiliğinden kabarcığa emilmez.

  1. CPM yazılımını Basınç Kontrolü modunda tutan otoklavlanmış bir pipet kullanarak hücreyi numuneyle doldurun. Yeni bir kabarcık arayüzü oluşturulduğunda yüzey geriliminin yaklaşık 73 mN/m olduğundan emin olun.
  2. Uçucu bir organik çözelti içindeki bir çözeltiden hücrenin hava-su arayüzünde tek katmanlı çözünmez bir yüzey aktif madde biriktirin. Bir şırınga kullanarak, arayüze küçük damlacıklar bırakın ve çözücünün lipiti ince bir film olarak geride bırakarak buharlaşmasına izin verin.
    DİKKAT: Kloroform, fosfatidilkolinler ve yağ asitleri gibi fosfolipitler için bir çözücü olarak kullanılır. Serpme çözeltileri genellikle çözücünün mL'si başına 0.01-0.02 mg lipittir. Kloroform akut toksiktir, cilt ve göz tahrişine neden olabilir ve kanserojendir. Uygun göz koruması, laboratuvar önlüğü ve eldivenler giyin ve çözeltiyi bir duman başlığında yapın.
  3. Kabarcığın merkez çizgisi basınç kontrolü (Şekil 4-7) ile yüzey alanını neredeyse düz olana kadar azaltın. Bu, yüzey aktif madde adsorbe edildikten sonra kabarcığın patlamasını önler.
  4. Hava/su arayüzü kılcal damarın ucundan geçene kadar rezervuar sıvısını doğrudan hücreye şırınga yoluyla hücreden çıkarın. Bir şırınga pompası kullanılabilirken, bu adım şırıngayı manuel olarak kullanarak elde edilebilir.
  5. Rezervuar sıvı yüksekliğini başlangıç seviyesine yükseltin.
    NOT: Uç yeniden suya batırıldıktan sonra, şimdi arayüzde adsorbe edilen yüzey aktif madde nedeniyle kabarcık daha büyük olacaktır. Tek katman artık salınım veya çözücü değişim deneyleri için hazır olacaktır.

9. Temizle

  1. CFM'yi kapatın.
  2. Basınç Kontrolü moduna geçin.
  3. Pipet kullanarak numuneyi hücreden çıkarın. Hücreyi DI suyuyla yükleyin ve kabarcıkların kılcal damardan sürekli kaçmasına ve kılcal ucu temizlemesine neden olmak için basıncı ~ 50 mbar'a yükseltin. Bu işlemi 2 kat tekrarlayın.
  4. Sol üst köşedeki kırmızı düğmeye tıklayarak emniyet valfini kapatın ve CPM'yi kapatın, açık ve mavi basınç kontrol panelini kapatın ve basınç kaynağını kapatın.
  5. Hücreyi konfokal mikroskop aşamasından çıkarın. Hücreyi etanol ve DI suyu ile durulayın. Kılcal tüpü CPM hücresinden çıkarın.

10. Hücrenin temizlenmesi

  1. Hücreyi sökün. DI su altında durulamaya devam ederken iç duvarı bir diş fırçasıyla fırçalayın. Parçaları etanol içine batırın ve ~ 30 dakika boyunca sonikleştirin.
  2. Tüm parçaları birkaç kez DI suyuyla durulayın. Parçaları azot gazı ile üfleyerek veya vakumlu fırında kurutarak kurutun.

11. Salınım analizi

  1. CPM sanal arabiriminden kaydedilen istediğiniz dosyayı seçerek Dilatational_Rheology_Analysis.m kodunu (Ek Kodlama Dosyası 2) çalıştırın. Örnek veriler ek dosyalara dahil edilir.
  2. Basınç ve zaman grafiği Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi görünecektir. Salınımın başladığı noktaya sol tıklayın ve salınımın bittiği yere tekrar sol tıklayın. Veriler birden çok salınım içeriyorsa, tüm salınımlar için bu işlemi yineleyin.
    1. Tüm başlangıç ve bitiş noktaları sol tıklatıldığında, fareyi herhangi bir yere sağ tıklatın. Örneğin, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, 1, 2, 3 ve 4 numaralı noktalara sol tıklama ve ardından sağ tıklama yapılabilir.
      NOT: Kod, dilatasyon modülünü ve faz açısını hesaplar ve sonuçlar orijinal dosya konumundaki yeni bir .csv dosyasına yazılır. Örnek verilerin sonuçları, Ek Kodlama Dosyası 2'de verilen kod sonuçlarında görülebilir. MATLAB ayrıca Ek Şekil 2'de gösterildiği gibi verilerin birkaç grafik gösterimini de oluşturacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ölçüm hatasının önemli bir kaynağı, kesme işleminden (Şekil 5A,B) veya kaplama işleminden (Şekil 5D) kusurları olan kılcal damarlardan kaynaklanmaktadır. Her iki kusur türü de optik görüntü analiz sistemi tarafından kabarcık şeklinin ve boyutunun belirlenmesinde hatalara yol açarak yanlış yüzey gerilimi değerlerine yol açar. Kılcal damarı CPM'ye yerleştirmeden önce optik mikroskop altında çekildikten ve kaplandıktan sonra her yeni kılcal damarı dikkatlice incelemek önemlidir. Yanlış kesilmiş bir kılcal damar atılmalıdır, ancak kötü kaplanmış bir kılcal damar, kılcal damarın ucundaki kabarcık iğnelemesini iyileştirmek için asitle temizlenebilir ve yeniden kaplanabilir (Protokolün 2. adımı). Kılcal damarlar, uç kesim kılcal damara mükemmel bir şekilde dik ise (Şekil 5C) ve kabarcık pimleri doğrudan kılcal damarın ucundaysa (Şekil 5E) en iyi şekilde çalışır. Kılcal damar üzerindeki hidrofobik kaplama, kullanımla sabitlemede daha az etkili olacak ve kılcal damarın yeniden temizlenmesini ve yeniden kaplanmasını gerektirecektir.

Sürfaktan adsorpsiyonu ve zamanı temsili veriler Şekil 6'da sunulmuştur. Yüzey aktif madde adsorpsiyonunu ölçmek için kullanılan bir kolye veya sapsız damlalar gibi önceki deneysel teknikler, yüzey gerilimindeki değişimin adsorpsiyon30,36,37 sırasında kabarcık alanının değişmesine neden olduğu için kılcal basıncı dinamik olarak ayarlamak için bir mekanizmaya sahip değildi. Aslında, daha büyük kabarcıklar ve damlalar için, kılcal basınç bağımsız olarak ölçülmediğinden ve kılcal basınç damla veya kabarcık yüzeyine göre değiştiğinden, arayüz şeklinin analizinden yüzey gerilimini belirlemek için kabarcık veya damla şeklindeki (ve dolayısıyla yüzey alanındaki) değişiklikler gereklidir37. Bu aynı zamanda adsorpsiyonun analizini de zorlaştırır, çünkü yüzey aktif madde arayüze adsorbe oldukça, yüzey gerilimi azalır ve Laplace denklemini karşılamak için kabarcığın yüzey alanının artması gerekir, bu da dengeye ulaşmak için adsorbe etmek için ek yüzey aktif madde gerektirir. CPM'de, sabit bir kılcal basınç, yüzey gerilimi çok fazla azalırsa kabarcığın kılcal damardan dışarı çıkmasını önlemek için yüzey aktif madde adsorpsiyonundan önce ilk kabarcık yarıçapının küçük bir aralıkta olmasını gerektirir. Yüzey aktif madde adsorpsiyon dinamikleri genellikle yüzey aktif madde moleküllerinin sabit ara yüzey alanının temiz bir arayüzüne adsorpsiyonunu tanımlayan klasik Ward-Tordai denklemi31 tarafından modellenir. Ward-Tordai denklemi değişen yüzey alanını hesaba katmak için değiştirilebilirken, bu ek parametreler getirir ve analizi büyük ölçüde karmaşıklaştırır38,39.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, kılcal basıncı dinamik olarak ayarlayarak adsorpsiyon işlemi boyunca kabarcığın eğriliğini (ve yüzey alanını) sabit tutan Laplace denklemi kullanılarak model tabanlı bir geri besleme döngüsü geliştirilmiştir. Yüzey geriliminin değişim hızında önemli farklılıklar vardır, çünkü kabarcığın alanı sürekli artmaz. Adsorpsiyon sırasında kabarcık alanındaki değişiklikler, yüzey gerilimi ilk başta yavaşça değiştiği ve daha sonra dengelenmeden önce hızla hızlandığı için zamanla sabit değildir. Ek bir komplikasyon, bölgedeki fraksiyonel değişimin başlangıçtaki kabarcık yarıçapına bağlı olmasıdır. Sabit kabarcık yarıçapının ek bir yararı, kabarcık yüzeyi sabit kaldıkça arayüzün görüntülenmesinin basitleştirilmesidir ve bu da CFM'nin odaklanmasını kolaylaştırır. Adsorpsiyon işlemi sırasında, yüzey aktif madde arayüze adsorbe olurken (Video 1), arayüzden gelen floresan sinyali artar. Yüzey aktif madde yüzey alanları oluşturuyorsa, bu alanların22'yi oluşturduğu ve büyüdüğü gözlemlenebilir.

Alan salınımları sırasında yüzey gerilimindeki değişiklikler Şekil 7'de gösterilmiştir. CPM'nin önceki versiyonlarında, kabarcık kılcal basıncında salınımlar yapıldı; Bununla birlikte, kılcal basınçta bir sinüs dalgası üretmek, ikisi Laplace denklemi ile ilişkili olduğu için doğrudan yüzey alanında bir sinüs dalgasına dönüşmez. Laplace denklemini kullanan model tabanlı bir geri besleme döngüsünden yararlanarak, salınımlar kılcal basınçtan ziyade alanda oluşturulur ve bu da daha geniş bir genlik aralığında analiz edilmesi ve toplanması daha kolay olan verilere yol açar. Sonuç olarak, bu yöntemden toplanan yüzey gerilimi ve alan verileri, yüzey aktif madde tabakasının ara yüzey dilatasyon modülünü doğrudan hesaplamak için kullanılabilir: Equation 7 (Şekil 8), burada Equation 8 sistemin toplam gerilimi ve τgerilme, basit yüzey aktif madde çözeltilerinde genellikle bulunmayan izotropik olmayan deviatorik strestir 4,33. Böylece, basit bir yüzey aktif madde sistemi için, Equation 9. Yüzey-aktif proteinler gibi elastik ağların oluşturulabildiği arayüzler için, ekstra gerilmeler sıklıkla mevcuttur ve bu nedenle dilatasyon modülünü tanımlarken hesaba katılmalıdır. Video 2, fosfolipit tek katmanlı olarak sürekli renkli bir LE faz matrisinde siyah LC alanlarının hareketinin bir CFM videosunu göstermektedir. Arayüzdeki farklı LC etki alanları, kavisli kabarcık22,40 üzerinde salınımlar gerçekleştiğinde arayüzü kapsayan bir dallanma ağı halinde yeniden düzenlenir. Diğer Alan Salınımları sekmesi, Ek Şekil 3'te görüldüğü gibi testere dişi, kare ve üçgen dalgalar oluşturmak için kullanılabilir ve Sıkıştırma sekmesi sabit oranlı alan sıkıştırma ve genişletmeye izin verir.

Solvent değişim çalışmaları için, önce bir yüzey aktif maddenin arayüze adsorbe olmasına izin verilir ve daha sonra rezervuar sıvısı, ikinci bir yüzey aktif türün bu arayüzle temas etmesine izin verecek şekilde değiştirilir. İkinci yüzey aktif madde, arayüzdeki orijinal yüzey aktif madde ile rekabet ettiği için yüzey gerilimindeki değişimi incelemek mümkündür. Yüzey dilatasyonel modülü genellikle CFM aracılığıyla yüzey morfolojisi ile birlikte yüzey aktif madde değişiminin daha hassas bir probudur. Şekil 9 , yüzey gerilimi, yüzey dilatasyon modülü ve yüzey morfolojisindeki değişimi, böyle bir çözücü değişimi gerçekleşirken göstermektedir. Böyle bir değişimin özellikleri değişebilirken, üç özellikten herhangi birinde yapılan bir değişiklik, ikinci bileşenin tek katmana entegrasyonunu veya birincil bileşenin yığına çözülmesini gösterebilir. CFM görüntülerinden arayüzle etkileşimini gözlemlemek için ikincil türlere ikinci bir floresan etiketi eklenebilir.

Figure 1
Şekil 1: Kılcal Damar Tedavisi . (A) Kılcal damarın skorlamasını gösteren resim. Cam puanlama seramiği, sabit tutmak için bir kelepçede tutulur. (B) Kılcal damarın asitle temizlenmesi. Asit temizleme çözeltisi, vakum pompası ile kılcal damara çekilir. (C) Kılcal damarın hidrofobikleşmesi. Kılcal damarın içinde tutulan silan çözeltisi fişi Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Hücre yapısı. (1) Büyük alüminyum hücre tutucu, (2) Floroelastomer conta (toplamda dört), (3) cam slayt (toplamda iki), (4) PEEK hücresi ve (5) küçük alüminyum hücre tutucu. Monte edildiğinde, her cam kızağın her iki tarafına bir floroelastomer conta yerleştirilir. Hücre vidalar ve cıvatalarla birlikte tutulur. PEEK hücresinin yakınlaştırılmış görüntüsü, çeşitli bağlantı noktalarının yerlerini gösterir: (6) kılcal bağlantı noktası, (7) çözücü değişim girişi, (8) çözücü değişim çıkışı ve (9,10) sıcaklık kontrol ceketi giriş ve çıkışı. Boruyu veya kılcal damarı hücreye bağlamak için bir PEEK fişi kullanılabilir. Kullanılmayan bağlantı noktaları, kanalsız fişlerle tamamen kapatılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: CPM/CFM şeması, ölçeklendirilmemesi. (1) CPM hücresi, (2) ucunda kabarcık bulunan kılcal tüp, (3) konfokal mikroskop hedefi, (4) filtreli mikroskop kamera hedefi, (5) CPM ışık kaynağı, (6) mikroakışkan pompa, (7) emniyet valfi, (8) sıvı değişim girişi, (9) sıvı değişim çıkışı, (10) peristaltik pompa, (11) değişim sıvısı rezervuarı, (12) sıvı değişim atığı, (13) doğrudan hücre şırıngasına, (14) sıcaklık kontrol ceketi giriş ve çıkışı ve (15) sıcaklık kontrollü rezervuar ve pompa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: CPM sanal arayüzü. (1) verilerin kaydedileceği dosya yolu; (2) sistem parametreleri, yorumlar ve Kaydet düğmesine basın. Bu alandaki tüm alanlar son veri dosyasına kaydedilir; (3) CPM kamera görüntüsü; (4) görüntü analizini, annulus ölçümünü, kabarcık sıfırlamayı ve saniyedeki kare sayısını izlemeyi kontrol eden ayarlar; (5) Kabarcık Sıfırlama düğmesi; (6) Veri Topla düğmesi, veri kayıt hızı kontrolü ve veri toplama göstergeleri; (7) tüm çalışma modu merkez hattı değerleri, salınım genliği ve salınım frekansı için kontroller; (8) çalışma modu anahtarı: her sekmeye tıklamak bu kontrol moduna geçer. Her mod, pompaya gönderilen basınç sinyalini "Basınç Sinyali" grafiğinde ve bazı ek kontrollerde gösterir; (9) canlı yüzey gerilimi verileri; (10) canlı basınç verileri; (11) eğrilik verilerinin canlı yarıçapı; (12) canlı yüzey alanı verileri; ve (13) bir salınım etüdü sırasında faz açısını kabaca belirlemek için kullanılabilecek canlı yüzey gerilimi ve yüzey alanı verileri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kılcal Damar Defektleri. (A) ve (B) Yanlış kesilmiş kılcal damarlar; (C) kılcal damarı doğru kesmiş, (D) zayıf veya bozulmuş kaplama nedeniyle kötü tutturmalı kılcal damar ve (E) düzgün sabitlenmiş kılcal damar. D ve E'deki kırmızı oklar , kabarcıkların nereye sabitlendiğini gösterir. En iyi sonuçlar için, kabarcık kılcal uçta sabitlenecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Hem sabit basınç (turuncu) hem de sabit alan (mavi) adsorpsiyonları için adsorpsiyon çalışması mikrotensiyometre sonuçları. Sabit alan adsorpsiyonu için kabarcık yüzey alanı, çalışma boyunca önemli ölçüde artar ve adsorpsiyonun aynı yüzey gerilimine ulaşması daha uzun sürmesine neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Tipik yüzey alanı kontrol salınımı . (A) Basınç, (B) eğrilik ve (C) yüzey alanı verileri. Yüzey alanı verileri bir sinüzoiddir, basınç ve eğrilik verileri ise salınımın orta noktasında olmayan merkez çizgisi değerleriyle kanıtlandığı gibi değildir. Üç değer arasındaki matematiksel ilişki, yalnızca birinin gerçek bir sinüzoid olabileceği anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Analiz sonrası örnek reolojik sonuçlar. ~ 45 μm yarıçaplı kabarcıklar için Lyso PC konsantrasyonlarını arttırmak için frekansın bir fonksiyonu olarak Lyso PC'nin (1-palmitoyl-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfokolin) dilatasyonel modülü. Enflamasyona eşlik eden 0.1 mM Lyso PC > konsantrasyonları, normal ventilasyon / solunum hızları (sarı) aralığında dilatasyonel modülü azaltarak Laplace instabilitesini (noktalı kırmızı çizgi) indüklemek için çapraz geçiş değeri olan 2 ε-γ < 0 yapar. Normal akciğerlerde oluşabilecek düşük Lyso PC ≤0.01 mM konsantrasyonları instabiliteye neden olmaz. >10 rad / sn frekanslarında, tüm Lyso PC konsantrasyonları geçişin üzerindedir ve Laplace kararsızlığına duyarlı olmayacaktır. Katı kırmızı çizgiler teorinin verilere uyumudur. Şekil referans9'dan alınmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: DI suyu ve daha sonra Lyso PC ile değiştirilen akciğer yüzey aktif maddesi için bir çözücü değişim çalışması için CFM ve CPM sonuçları . (A), yüzey geriliminin ve yüzey dilatasyonel modülünün çalışma boyunca nasıl değiştiğini göstermektedir. Grafik dört bölgeye ayrılmıştır: akciğer yüzey aktif maddesi arayüze adsorbe edildiğinde (mavi), LS DI su (yeşil) ile değiştirildiğinde, değişim çözeltisi bir Lyso PC çözeltisine (kırmızı) geçirildiğinde ve hücre Lyso PC çözeltisi ile doldurulduğunda (turuncu). Özelliklerin, arayüzün değiştiğini gösteren çeşitli borsalar boyunca değiştiği görülebilir. (B) değişimden önce arayüze adsorbe edilen akciğer sürfaktan konfokal görüntüsünü gösterir ve (C) Lyso PC çözeltisi ile değişim tamamlandıktan sonra aynı yüzeyi gösterir. Her iki durumda da, beyaz kesikli daire kılcal damarın iç kenarını gösterir. Tek katman üzerindeki etki alanlarının yapısı, çözücü değişiminden sonra büyük ölçüde değişir ve BGBM sonuçlarını doğrular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Akciğer yüzey aktif maddesi için sabit basınç adsorpsiyon çalışmasının konfokal videosu. Yanlış renk, videonun sol tarafındaki renk çubuğuyla z yönündeki mesafeyi gösterir, mor kılcal damarın yakınındaki kabarcığı gösterir ve yeşil kabarcığın üst kısmıdır. Arayüz başlangıçta loş bir şekilde aydınlatılır, çünkü floresan yüzey aktif maddenin sadece bir kısmı adsorbe edilir. Giderek daha fazla yüzey aktif madde adsorbe dönüştükçe, renk yeşile daha fazla kaydıkça kabarcık büyümeye başlar ve arayüz, arayüz boyunca hareket edebilen siyah LC etki alanları ile doldurulur. Çözeltideki yüzey aktif madde agregaları, çözeltide parlak amorf şekiller olarak yüzer ve birkaçı kabarcık arayüzüne yerleşir, parçalanır ve yüzey aktif maddelerini arayüze bırakır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Akciğer yüzey aktif maddesi için salınım çalışmasının konfokal videosu. Yanlış renk, videonun sol tarafındaki renk çubuğuyla z yönündeki mesafeyi gösterir. Yüzey birkaç farklı salınım frekansına maruz kalır ve arayüzdeki karanlık LC alanlarının salınımlar boyunca değiştiği görülebilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Dilatasyonel reolojiyi belirlemek için koddaki bir ara adım örneği. Bu ekran göründüğünde, kullanıcı çözümlemek için salınımın en sol kenarına sol tıklamalı ve ardından en sağdaki kenara sol tıklamalıdır. Birden çok salınım analiz edilebilir, böylece kullanıcı 1, 2, 3 ve 4'e sol tıklayabilir ve ardından bu iki salınımı analiz etmek için sağ tıklayabilir. Gösterilen salınımlar farklı genliklere ve frekanslara sahiptir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Dilatasyonel reoloji kodu tarafından üretilen grafik sonuçlara örnek. Bu, sinüzoidlerin basınç, yarıçap, yüzey alanı ve yüzey gerilimindeki salınımlara uyumunu ve her salınımın Fourier dönüşümünü gösterir. İdeal olarak, Fourier dönüşümündeki ikinci harmonik, yüzey alanı ve yüzey gerilimi için ilk harmoniğin% 10'undan az olmalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Alternatif çalışma modları. (A) Sinüs dalgası, (B) Testere dişi dalgası, (C) Kare dalga, (D) Üçgen dalga, (E) Sabit hız genişlemesi ve (F) Sabit oranlı sıkıştırma. Sıkıştırma ve genişletme modları, çözünmeyen yüzey aktif maddeler için Langmuir tipi izotermlerin oluşturulmasına izin verir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 1: Mikrotensiyometre Sanal Interface.vi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Kodlama Dosyası 2: Dilatational_Rheology_Analysis Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombine CPM / CFM, ara yüz dinamiklerini, dengeyi ve morfolojiyi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, CPM/CFM ile veri elde etmek için gerekli adımları açıklar.

Şekil 2 , belirtilen kılcal damar, çözücü ve ısı değişimi için kanallara sahip hücre tasarımını göstermektedir. Solvent değişimi için giriş hücrenin altında olmalı, çıkış ise en üstte olmalı ve değişim sırasında hücrenin taşmamasına izin vermelidir. Uygulamada, giriş ve çıkış akış hızları aynı peristaltik pompa için biraz farklı olabilir. Bu hücre tasarımıyla ilgili yaygın bir sorun, hücreden sızıntıdır. Bu genellikle hücre ile bağlantılardan biri arasındaki zayıf bir bağlantıdan kaynaklanır, ancak tüm bağlantılar kuru ve sızıntı yapmıyorsa, bunun nedeni hücreyi çevreleyen cıvataların aşırı sıkılması nedeniyle hücrenin cam slaytındaki bir çatlak olabilir.

Şekil 3 , çeşitli pompalar ve hücre arasındaki bağlantıları ve hücrenin CFM ve BGBM hedefleriyle hizalamasını göstermektedir. CPM kamera (4), çalışma sırasında kabarcık şeklini görüntülemek için kullanılır. CPM kamera, CFM heyecan verici lazer ışığının CPM kameraya girmesini önleyen bir optik filtre ile donatılmalıdır. Aksi takdirde, CFM lazer, görüntü analizini kullanarak CPM kameradaki görüntüleri son derece gürültülü ve sığdırılması zor hale getirir. Bir emniyet valfi, kılcal ve mikroakışkan pompayı (7) birbirine bağlar ve hücreden pompaya ulaşan geri akış riski olmadan pompa ve hava basıncı kaynağında değişiklik yapılmasına izin verir. İkinci bir valf (13), rezervuarın içine ve dışına doğrudan sıvı enjeksiyonuna izin vermek için bir şırıngaya erişim sağlar. Bir sızıntı durumunda rezervuara sıvı eklenmesi gerekebilir ve protokolün 8. adımı için (çözünmeyen yüzey aktif madde adsorpsiyonu) veya konfokal hedefe bağlanmışlarsa kılcal damardan temizlenen kabarcıkların çıkarılması gerekebilir.

Her deney sırasında, birkaç önemli adım dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Cihaz çalıştıktan sonra ortaya çıkan sorunların çoğu, kılcal damarın kendisini içerir. Bu nedenle, dikkatli kesim ve kaplama zorlukları en aza indirebilir. Kılcal damarın istenen çapa kesilmesi zor ve düşük verimli bir işlemdir. Kılcal damarın ucundaki herhangi bir çip veya düzensizlik, kabarcık yarıçapının zayıf okunmasına yol açacaktır. Ek olarak, hidrofobik kaplama doğru uygulanmazsa veya zamanla ve kullanımda bozulursa, kabarcık kılcal damarın ucuna düzgün bir şekilde sabitlenmez. Bu, kılcal damarın içine sabitlenmiş gibi görünen veya salınımlı bir çalışma sırasında kılcal damarın içi boyunca kayan kabarcık ile gösterilebilir. İyi kesilmiş ancak düzgün sabitlenmemiş bir kılcal damar yeniden temizlenebilir ve hidrofobik olarak tedavi edilebilir.

Bir diğer önemli adım ve olası hata kaynağı, farklı malzemeler veya aynı malzemenin farklı konsantrasyonları arasındaki hücre rezervuarını, boruyu ve kılcal damarı temizlemektir. Rezervuarda birçok küçük yarık vardır ve yüzey aktif madde, uygun şekilde temizlenmezse daha sonraki zamanlarda alınan ölçümleri adsorbe edebilir ve değiştirebilir. Fazla yüzey aktif malzemenin uzaklaştırılmasını sağlamak için hücrenin tamamen sökülmesi ve ıslatılması genellikle gereklidir. Aynı yüzey aktif maddenin bir dizi konsantrasyonu incelenecekse, en düşük konsantrasyonu kullanarak başlamak daha iyidir.

Bazen, kılcal boruyu konfokal hedefle hizalamak zor olabilir. Mikrotensiyometre kamera, konfokal hedefin hizalanmasına yardımcı olmak için kullanılabilir, ancak CFM hedefinin büyük bir çalışma mesafesi için bu yararlı olmayabilir. Konfokal mikroskop kılcal damarın ucunun ötesine odaklanmışsa, herhangi bir floresan malzemeden yoksun bir bölge olan kılcal kesit de hedefi yönlendirmeye yardımcı olmak için kullanılabilir. Kılcal kabarcık dışarı çıkmazsa, kılcal damara verilen basınçta bir sorun olabilir (normal çalışma altında 150 mbar olması gerekir). Bu, basınç kontrol moduna girerek ve basıncı yüksek bir değere ayarlayarak kontrol edilebilir. Basınç ayarlanan basınca ulaşmazsa, boruda mikroakışkan pompadan bir sızıntı olması veya pompanın yeterli gaz basıncını almaması muhtemeldir. Yüzey bilimini içeren birçok çalışmada olduğu gibi, herhangi bir noktada çözeltilere kirletici malzeme girmemesini sağlamak önemlidir. Okumalar beklendiği gibi değilse (yüzey gerilimi çok düşük başlıyorsa veya çok hızlı azalıyorsa), yeni bir numune yapmak veya iyi çalışılmış bir numune veya saf sıvı kullanmak da sorun gidermede iyi bir erken adımdır.

Diğer deneysel hedeflere ulaşmak için cihazda çeşitli değişiklikler yapılabilir. Kılcal damara yağ veya su eklenebilir, böylece hava-su arayüzleri yerine yağ-su incelenmesine izin verilir39. Bu, pompaya geri akış riskini artırır, bu nedenle ek dikkat gösterilmelidir, hatta pompa ile kılcal damar arasındaki boruya bir yağ tutucu eklemek bile gerekli olabilir.

BGBM/CFM için çeşitli sınırlamalar vardır. CPM, sistemdeki pompa ve optikler için kılcal OD için 20-300 μm olan kılcal boyutta sınırlı bir çalışma aralığına sahiptir. Solvent değişimi41 veya burada açıklanan yöntemi kullanarak arayüze çözünmez yüzey aktif madde eklemek mümkün olsa da, yüzey konsantrasyonu sadece yüzey gerilimine karşı alan izotermleri yapmaktan ve bir Langmuir oluğundan elde edilenlerle karşılaştırılmasından çıkarılabilir. CFM yalnızca floresan malzemeleri algılayabilir, bu nedenle floresan olmayan veya floresan olarak etiketlenmemiş malzemeler görselleştirilemez. Birçok yüzey aktif madde küçük moleküllerdir ve bunları etiketlemek potansiyel olarak özelliklerini değiştirebilir, ancak bu, proteinler veya polimerler gibi daha büyük yüzey aktif moleküller için daha az sorun olmalıdır26,27.

Bu yöntemin, yüzey aktif madde yüklü arayüzlerin önceki CPM ve CFM analizlerine göre birkaç önemli avantajı vardır. En önemlisi, hibrit cihazın çeşitli dinamik ve denge yüzeyi özellikleri ölçülürken arayüzün görselleştirilmesine izin vermesidir. Arayüzün morfolojisindeki değişiklikler doğrudan ara yüz dinamikleri ve reolojik özelliklerle bağlantılı olabilir. Yüzey aktif madde yüklü arayüzlerin önceki CFM'si, düz bir Langmuir oluğu 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47 kullanılarak yapılırken, burada açıklanan yöntem oldukça kavisli arayüzlerde gerçekleştirilebilirken, 22 . Ek olarak, tüm arayüz bir kerede görüntülenebilir, belirli etki alanlarının gerçek zamanlı izlenebilir bir değişimini gösterirken, Langmuir oluğundaki yüzey akışları, konfokal görsel pencerenin içine ve dışına akan etki alanlarına yol açmıştır. Bu aparat üzerindeki yüzey sıkıştırmaları da izotropiktir, Langmuir oluklarındaki bariyerler ise belirli sıkıştırma yönlerine sahiptir. CPM, Langmuir oluğunda mümkün olandan çok daha hızlı alan salınımlarına izin verir.

Bu çalışmadaki yeni eğrilik ve alan bazlı kontrol, CPM30'un önceki sürümlerine göre önemli avantajlara sahiptir. Tipik olarak, kabarcık boyutu sabit bir kılcal basınç ayarlanarak kontrol edildi; dilatasyonel modül ölçümleri için kılcal basınç salınımlıydı. Kılcal basınç sabit tutulduğunda, yüzey aktif madde arayüze adsorbe edildiğinden, kabarcığın yüzey gerilimi azalır. Laplace denklemini karşılamak için, ΔP = 2γ / R, yüzey gerilimi azaldıkça eğrilik yarıçapı da azalmalıdır. BGBM'deki yarım küre şeklindeki kabarcık için, eğriliğin kabarcık yarıçapının azaltılması kabarcık alanını arttırır 9,48:

Equation 10

burada R ckılcal yarıçaptır ve R, eğriliğin kabarcık yarıçapıdır. Kabarcığın değişen yarıçapı, adsorpsiyon sırasında arayüzün alanını değiştirir, bu da Ward-Tordai denklemlerini kullanarak adsorpsiyonun analizini zorlaştırır10,38 Ek olarak, kabarcığın yüzey gerilimi yeterince düşürülürse, kabarcık yarıçapı kılcal yarıçaptan daha küçük hale gelir ve kabarcık dışarı atılır. Bu yeni CPM / CFM'deki geri besleme döngüsü, kabarcık alanını adsorpsiyon boyunca sabit tutar, yani orijinal Ward-Tordai denklemi kullanılabilir, kabarcık fırlatma riski yoktur ve yüzey bölgede artmadığı için adsorpsiyon daha hızlı gerçekleşir. Salınımlı çalışmalar için, basınçta bir sinüs dalgası üretmek, yüzey alanında bir sinüs dalgası üretmez48. Önceki CPM yöntemleri, basınca bağlı salınımın neden olduğu alan değişiminin bir sinüs dalgası48'e yaklaşması için salınımları küçük tutmaya dayanıyordu. Tarif edilen yöntem doğrudan kabarcığın alanını kontrol eder ve ara yüz bölgesinde gerçek sinüs dalgası salınımları oluşturmak için kullanılabilir. Dilatasyon modülünü hesaplamak için gerilimi (yüzey gerilimindeki değişim) ara yüzey gerinimi (yüzey alanındaki değişim) ile doğrudan ilişkilendirmek mümkündür.

Bu protokolün uygulanmasına yardımcı olmak için, mikrotensiyometreyi kontrol eden kodun kısa bir açıklaması burada açıklanmaktadır. Kod, bir döngüdeki üç segmentten oluşur: biri mikroakışkan pompaya komut verir, biri kabarcığın sıfırlama mekanizmasını kontrol eder ve biri kabarcığın yarıçapını ölçer ve hesaplanan değerleri kaydeder. Pompa kontrolörünün üç ana çalışma modu vardır: basınç kontrolü, eğrilik kontrolü ve alan kontrolü. Basınç kontrolünde, kullanıcı doğrudan pompa tarafından oluşturulan basınç için bir ayar noktası girer. Bu mod önemlidir çünkü bir geri bildirim döngüsü gerektirmez ve bu nedenle modların en kararlı olanıdır. Eğrilik kontrolü, belirli bir eğriliğin arayüzünü oluşturmak için hangi basıncın gerekli olduğunu hesaplamak için önceden ölçülen yüzey basıncını ve Laplace denklemini kullanır. Yüzey alanı kontrol modu, küresel kapağın geometrisine dayanarak belirli bir yüzey alanı oluşturmak için hangi eğriliğin gerekli olduğunu hesaplayarak bunun üzerine inşa edilir ve bu da kılcal yarıçapın hassas bir şekilde ölçülmesini gerektirir. Bu iki mod özellikle adsorpsiyon ve salınım çalışmaları için kullanışlıdır, ancak tutarlı yüzey basıncı verilerinin sabit bir akışını gerektirir. Bu nedenle, bu iki denetleyiciye beslemenin daha iyi çalışması için ham verilerden düzeltilmesi gerekebilir. Çözüm yeterince net olmadığında, genellikle oldukça bulanık bir numune nedeniyle, kabarcık arayüzünün iyi bir görüntüsünü elde etmek mümkün olmadığından bu mod düzgün çalışmayacaktır. Salınım kontrolleri de kodun bu bölümüne dahil edilmiştir. Kodun orta bölümü, kabarcığın kılcal damardan temizlenmesini sağlar. Burada, kılcal damarın ayarlanan basıncı yüksek bir değere ayarlanır ve kabarcığın patlamasına ve yeni bir arayüz oluşturulmasına izin veren belirli bir süre boyunca orada tutulur. Kodun son bölümü, balonun kenarını izlemek ve yarıçapını ölçmek için görme alma yazılımı kullanır. Bu yarıçap daha sonra yüzey gerilimini hesaplamak için Laplace denklemi ile birlikte kullanılır ve daha sonra döngünün ilk kısmına beslenir.

Bu hibrid CPM / CFM tekniğinin, hava-su arayüzlerinde model ve klinik akciğer yüzey aktif maddeleri üzerindeki çalışmalarımıza büyük ölçüde faydalı olduğu kanıtlanmıştır. Kabarcık boyutları insan akciğerindeki alveollerdekilere yaklaşır ve ara yüzey eğriliğin akciğer sürfaktan monokatmanlarının morfolojisi ve dinamiği üzerindeki etkileri 9,10,22 olarak gözlemlenebilir. Hibrit cihaz, petrokimyadan ev kimyasallarına, gözyaşı filmlerinden antikor stabilizasyonuna kadar çeşitli uygulamalarla her yerde bulunan diğer yüzey aktif malzemelerin çalışmaları için de önemli olacaktır. Kombine CPM / CFM, fazdan ayrılmış alanlar ölçeğinde dinamik ara yüzey özelliklerini araştırmamıza ve dış koşullar değiştikçe yüzeydeki morfolojileri görselleştirmemize olanak tanır. Bu yöntem özellikle pahalı malzemelerin minimum boyutta numune kullanılmasını gerektiren uygulamalarda kullanışlıdır. Ara yüz dinamiklerinin ve tek katmanlı morfolojinin eşzamanlı olarak gözlemlenmesi, başka herhangi bir teknikle neredeyse imkansızdır, bu da onu ara yüz bilimi alanına geniş çapta uygulanabilir kılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Tüm konfokal mikroskopi görüntüleri Nikon A1RHD Multiphoton dik konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Minnesota Üniversitesi Üniversite Görüntüleme Merkezi'ndeki destek personelinin, özellikle Guillermo Marques'in rehberliğini ve yardımını kabul ediyoruz. Bu çalışma NIH Grant HL51177 tarafından desteklenmiştir. SI, Ruth L. Kirschstein NRSA Kurumsal Araştırma Eğitim Hibe F32 HL151128 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

Tags

Mühendislik Sayı 187 kılcal basınç mikrotensiyometresi ara fasiyal reoloji akciğer yüzey aktif maddesi konfokal mikroskopi yüzey morfolojisi mikroakışkanlar
Dinamik Arayüzlerin Konfokal Mikroskopi Görselleştirmesi için Mikrotensiyometre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter