Summary
El presente protocolo describe la técnica de miógrafo de alambre para medir la reactividad vascular de la arteria coronaria de la rata.
Abstract
Como un evento clave de las enfermedades del sistema cardiovascular, la enfermedad de las arterias coronarias (EAC) ha sido ampliamente considerada como el principal culpable de la aterosclerosis, el infarto de miocardio y la angina de pecho, que amenazan seriamente la vida y la salud de las personas en todo el mundo. Sin embargo, cómo registrar las características biomecánicas dinámicas de los vasos sanguíneos aislados ha desconcertado a las personas durante mucho tiempo. Mientras tanto, el posicionamiento preciso y el aislamiento de las arterias coronarias para medir los cambios de tensión vascular dinámica in vitro se han convertido en una tendencia en el desarrollo de fármacos CAD. El presente protocolo describe la identificación macroscópica y la separación microscópica de las arterias coronarias de ratas. La función de contracción y dilatación del anillo de la arteria coronaria a lo largo del diámetro del vaso se monitoreó utilizando el sistema de miógrafo múltiple establecido. Los protocolos estandarizados y programados de medición de la tensión del anillo coronario, desde el muestreo hasta la adquisición de datos, mejoran enormemente la repetibilidad de los datos experimentales, lo que garantiza la autenticidad de los registros de tensión vascular después de la intervención fisiológica, patológica y farmacológica.
Introduction
La enfermedad arterial coronaria (EAC) ha sido ampliamente reconocida y preocupada como una enfermedad cardiovascular típica y representativa, siendo la principal causa de muerte tanto en los países desarrollados como en los países en desarrollo 1,2. Como vía de suministro de sangre y oxígeno para la función fisiológica cardíaca normal, la sangre circulante entra y nutre el corazón a través de dos arterias coronarias principales y una red vascular sanguínea en la superficie del miocardio 3,4. Los depósitos de colesterol y grasa en las arterias coronarias cortan el suministro de sangre del corazón y la respuesta inflamatoria violenta del sistema vascular, causando aterosclerosis, angina estable, angina inestable, infarto de miocardio o muerte súbita cardíaca 5,6. En respuesta a la estenosis patológica de las arterias coronarias, los latidos cardíacos fisiológicos acelerados compensatorios satisfacen el suministro de sangre del corazón mismo o de los órganos vitales del cuerpo al aumentar la producción del ventrículo izquierdo7. Si la estenosis coronaria prolongada no se alivia a tiempo, se pueden desarrollar nuevos vasos sanguíneos extensos en ciertas áreas del corazón8. En la actualidad, el tratamiento clínico de la EAC suele adoptar la trombólisis farmacológica o la trombólisis mecánica quirúrgica y un bypass vascular biónico exógeno con medicación frecuente y gran discapacidad quirúrgica9. Por lo tanto, la investigación funcional de la actividad fisiológica de la arteria coronaria sigue siendo un avance urgente para las enfermedades cardiovasculares10.
No hay medios técnicos disponibles para detectar la actividad fisiológica coronaria, a excepción de los sistemas de telemetría inalámbricos, que pueden registrar dinámicamente la presión coronaria in vivo , la tensión vascular, la saturación de oxígeno en sangre y los valores de pH11. Por lo tanto, teniendo en cuenta el secreto textural y la complejidad de las arterias coronarias, la identificación precisa y el aislamiento de las arterias coronarias son, sin duda, las mejores opciones para explorar múltiples mecanismos de CAD in vitro4.
Un sistema de miógrafo múltiple en serie, en particular un detector de tensión microvascular micrográfico de alambre (ver Tabla de Materiales), es un dispositivo comercializable muy maduro para registrar cambios de tensión tisular in vitro de pequeños tubos vasculares, linfáticos y bronquiales con las características de alta precisión y registro dinámico continuo12. Dicho sistema se ha empleado ampliamente para registrar las características de tensión tisular in vitro de las estructuras de cavidad con diámetros de 60 μm a 10 mm. Las características de calentamiento continuo de la plataforma de la micrografía de alambre compensan en gran medida la estimulación del entorno externo adverso. Mientras tanto, las entradas constantes de la mezcla de gases y los valores de pH nos permiten obtener datos de tensión vascular más precisos en un estado fisiológico similar13. Sin embargo, teniendo en cuenta la complejidad de la localización anatómica de las arterias coronarias de ratas (Figura 1), su aislamiento ha sido desconcertante y limita la exploración del mecanismo de la enfermedad cardiovascular diversificada y el desarrollo de fármacos. Por lo tanto, el presente protocolo introduce en detalle la ubicación anatómica y el proceso de separación de la arteria coronaria de la rata, seguido de la medición de la tensión en la plataforma de la micrografía de alambre14.
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Protocol
El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité de Gestión de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Registro No. 2021-11). Se utilizaron ratas macho Sprague Dawley (SD) (260-300 g, 8-10 semanas de edad) para el presente estudio. Las ratas se mantuvieron en una cámara de animales y fueron libres de beber y comer durante el experimento.
1. Preparación de la solución
- Preparar solución salina fisiológica (PSS) disolviendo 118 mM de NaCl, 4,7 mM de K+, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgCl2∙6H2O, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES (ver Tabla de Materiales).
- Preparar solución salina con alto contenido de K+ disolviendo 58 mM de NaCl, 60 mM de K+, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, 1,2 mM de MgCl2∙6H2O, 25 mM de NaHCO3, 11 mM de D-glucosa y 5 mM de HEPES.
- Saturar las dos soluciones anteriores y burbujear con un gas mixto de 95% O2 y 5% CO2. Mientras tanto, mantenga los valores de pH de la solución entre 7.38 y 7.42 con 2 mM NaOH.
NOTA: Para obtener información detallada sobre la preparación de la solución, consulte la referencia15.
2. Disección de la arteria coronaria de la rata
- Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano al 2%. Confirme la anestesia profunda mediante pellizco en el dedo del pie y, si es necesario, administre anestésicos adicionales. Luego abra inmediatamente la cavidad torácica para exponer el corazón en la mesa de operaciones portátil siguiendo un informe publicado previamente12.
- Después de disociar y extraer el corazón, drene la sangre residual de todas las cámaras del corazón apretando ligeramente con fórceps de plástico médico. Coloque rápidamente el corazón preprocesado en una placa de Petri que contenga 95% de O2 + 5% de CO2 Saturado PSS a 4 °C, con un valor de pH de 7.40.
- Para identificar con precisión la posición anatómica de las arterias coronarias, ajuste la postura del corazón aislado bajo el microscopio de luz de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 2A).
NOTA: En la vista frontal, la aurícula derecha y la arteria pulmonar estaban en la parte superior izquierda y la parte superior derecha, respectivamente.- Cortar las cavidades ventriculares izquierda y derecha a lo largo del tabique interventricular desde la raíz de la arteria pulmonar con tijeras quirúrgicas y pinzas (Figura 2B).
- Para disociar las arterias coronarias izquierda y derecha del tejido miocárdico, diseccione el ventrículo derecho bajo un microscopio anatómico óptico para exponer completamente la rama de la arteria coronaria derecha. Luego identifique la posición de la arteria coronaria izquierda girando el tejido cardíaco 45 ° en el sentido de las agujas del reloj (Figura 2D).
- Después de extraer el tejido miocárdico pegajoso circundante, discierna explícitamente las arterias coronarias pulsantes izquierda (aproximadamente 5 mm) y derecha (aproximadamente 5 mm). Separe las arterias coronarias en el medio inmediatamente y sumérjase completamente en PSS a 4 ° C. Adquirir un anillo arterial de unos 2 mm cortando verticalmente la arteria desprendida con tijeras anatómicas para registrar la tensión vascular bajo diferentes estímulos (Figura 2E).
3. Suspensión y fijación del anillo arterial
NOTA: Para obtener detalles sobre este paso, consulte la referencia14.
- Preparar dos alambres de acero inoxidable de 2 cm (ver Tabla de Materiales) y remojar previamente en solución PSS de 4 °C saturada con 95% O2 + 5% CO2. Pase ambos cables paralelamente a través del anillo arterial junto con la dirección del vaso bajo un microscopio anatómico óptico y con cables de igual longitud expuestos en ambos extremos de la cavidad vascular.
- Fije el anillo arterial con el alambre de acero por delante y por detrás en el baño de la micrografía de alambre llena de PSS burbujeante con 95% O2 + 5% CO2. Gire la perilla del tornillo horizontal para un espaciado delantero y trasero adecuado de modo que los dos cables estén horizontales y el anillo arterial esté en un estado natural de relajación.
- Después de instalar el baño DMT en el aparato termostático, abra el software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) para asegurarse de que se registró la señal de ruta correspondiente. Establezca los siguientes parámetros: calibración del ocular (mm/div): 0.36; presión objetivo (kPa): 13,3; IC1/IC100: 0,9; tiempo promedio en línea: 2 s; tiempo de retardo: 60 s. Los pasos de la fijación del anillo arterial se muestran en la Figura 3.
4. Estandarización de la tensión vascular en anillo arterial de rata
NOTA: Para diferentes muestras de cavidades, fue necesaria una tensión inicial óptima para que los vasos mantuvieran una actividad excepcional in vitro. Para más detalles, véase la referencia15.
- Lograr la tensión inicial óptima del anillo arterial aplicando una tensión razonable a lo largo del diámetro del vaso.
NOTA: Sobre la base del estudio anterior16, la tensión máxima inducida por agonistas se logró en el valor del factor k de 0,90 con la tensión de estiramiento inicial de 1,16 ± 0,04 mN/mm (valores de referencia para diferentes muestras de vasos: valor k, 0,90-0,95; tensión inicial, 1,16-1,52 mN/mm). - En este punto, establezca el valor de tensión vascular mostrado en cero. Después, aplique un estímulo de tracción de 3 mN al anillo arterial girando el eje espiral del baño.
- Después de la incubación durante 1 h en tampón PSS saturado de oxígeno a 37 °C, pH 7.40, ajuste el valor de tensión a 0 mN nuevamente en el panel de control de tensión de la micrografía de alambre. El proceso de fraguado de la tensión inicial del anillo arterial se muestra en la Figura 4.
5. Detección de reactividad del anillo de la arteria coronaria
- Realizar la actividad contráctil del anillo de la arteria coronaria con la técnica de miógrafo de alambre14, y validar en tres operaciones separadas estimulando con 60 mM de solución K+ durante 10 min cada una.
- Después de cada estimulación, enjuague el baño con PSS saturado de oxígeno hasta que el tono vascular vuelva a su estado inicial.
NOTA: Solo cuando la fluctuación de tensión de las tres mediciones paralelas fue inferior al 10%, y la amplitud de cada contracción fue mayor de 1 mN / mm, se pudieron utilizar anillos arteriales calificados y altamente activos para experimentos adicionales. La verificación de la actividad del anillo coronario de la rata se muestra en la Figura 5.
6. Tratamiento postquirúrgico
- Después de la cirugía, sacrificar a los animales siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
NOTA: Para el presente estudio, los animales fueron sacrificados mediante la inhalación de exceso de isoflurano.
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Representative Results
Las arterias coronarias de ratas distribuidas y ocultas anatómicamente en el tejido miocárdico no se reconocían fácilmente. Al comparar las arterias coronarias de humanos (Figura 1A) y ratas (Figura 1B), se realizó una separación rápida y precisa de las arterias coronarias de ratas de acuerdo con el proceso de muestreo en la Figura 2. Después de localizar con precisión la aurícula derecha, la arteria pulmonar y el ápice desde el frente bajo un microscopio óptico, el miocardio se diseccionó a lo largo de la línea negra sólida que se muestra en la Figura 2A. Alrededor de 5 mm de la rama interventricular de la arteria coronaria estaba claramente expuesta a nuestra vista. Después de una separación fina del miocardio pegajoso que rodea la arteria septal ventricular, se utilizó un alambre de 2 cm para atravesar un asa de 2 mm de la arteria coronaria en la dirección de la alineación vascular. Al instante, el anillo coronario desprendido de 2 mm se fijó sólidamente en el baño dmT, como se muestra en la Figura 3. Después de aplicar una tensión inicial de 3 mN al anillo arterial (Figura 4), su tensión superó más de 2 mN aplicando 60 mM K+ en paralelo tres veces (Figura 5). Por lo tanto, los procedimientos anteriores habían dado como resultado un anillo coronario aislado con una excelente actividad fisiológica.
Se agregaron K+ acumulativos (20, 28, 39, 55, 77 y 108 mM) o U46619 (0.01, 0.03, 0.1, 0.3 y 1 μM) al baño de DMT 620M, lo que resultó en un aumento dependiente de la concentración en el tono vascular in vitro. La siguiente concentración de K+ o U46619 (un agonista del receptor de tromboxano A2 (TP)15 se añadió cuando el efecto vasoconstrictor alcanzó una meseta. Los resultados experimentales se muestran en la Figura 6A,B. Para anillos coronarios aislados constreñidos por K+ (60 mM) y U46619 (0,3 μM), el fármaco de prueba apigenina (1, 3, 10, 30 y 100 μM) causó vasodilatación de una manera sorprendentemente dependiente de la concentración (Figura 6C).
Figura 1: Dibujos a mano alzada de arterias coronarias humanas y de ratas. (A) presenta las características de la distribución superficial de las arterias coronarias izquierda y derecha desde la vista frontal del corazón humano y se reconoce fácilmente a simple vista. (B) muestra las arterias coronarias izquierda y derecha de la rata en lo profundo del miocardio y su tabique interventricular ramificado. Abreviaturas: RCA = arteria coronaria derecha; ACV = arteria coronaria izquierda; ISB = rama del tabique interventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de separación de arterias coronarias en ratas. (A) La aurícula derecha, la arteria pulmonar, el ápice y la línea anatómica del corazón de rata se observaron desde la vista frontal bajo un microscopio de luz. (B) Los lúmenes ventriculares izquierdo y derecho fueron incisos a lo largo del tabique desde la raíz de la arteria pulmonar. (C) Localización anatómica de las arterias coronarias izquierda y derecha y su rama septal interventricular. (D) Un anillo de 2 mm de la arteria. (E) El anillo arterial se fija por alambre a lo largo de la dirección del vaso. Abreviaturas: RA = aurícula derecha; PA = arteria pulmonar; RCA = arteria coronaria derecha; ISB = rama del tabique interventricular; ACV = arteria coronaria izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un esquema del procedimiento de montaje arterial. El anillo arterial con alambre se transfirió a (A) y se sujetó al baño DMT (B).. El alambre de acero se fijó y se atornilló en el sentido de las agujas del reloj en la parte superior izquierda (C) y la parte inferior izquierda (D). (E) Las mandíbulas separadas se atornillaron para hacer espacio para permitir que el segundo cable pase a través del anillo arterial. (F) El segundo cable era paralelo a través del anillo arterial. El alambre de acero se fijó y se atornilló en el sentido de las agujas del reloj en la parte superior derecha (G) y en la parte inferior derecha (H). (I) Las mandíbulas separadas se atornillaron libremente para dejar el anillo arterial en su estado natural. Las líneas verdes representan los cables, y los cilindros naranjas representan el anillo arterial aislado de 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Procedimiento de normalización del anillo arterial. Después de que la tensión del anillo arterial aislado fijo volvió a 0 mN, se aplicó una fuerza de tracción de 3 mN al anillo arterial a la vez. Después de 5 min, la tensión vascular disminuyó a 2,5 mN. Al aumentar la tensión a 3 mN y mantenerla estable durante 5 min, la tensión del anillo de la arteria coronaria se inicializó a 0 mN y se descansó durante 1 h para estudios posteriores sobre tensión vascular de diferentes estímulos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La prueba de la reactividad vascular. Tres aplicaciones de 60 mM K+ estimularon la tensión del anillo arterial coronario aislado a más de 2 mN y las tres mediciones fueron inferiores al 10%, lo que sugiere una actividad vascular superior. Después de cada estimulación, el baño se enjuagó suavemente con una solución de PSS saturada de oxígeno a 37 °C hasta que la tensión fue de 0 mN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Trazador representativo de la contracción de la dosis acumulada de la arteria coronaria de la rata a través de K+ o U46619. A medida que la dosis de K + (A) y U46619 (B) aumentó, la fuerza aumentó dependiendo de la dosis. (C) se refirió al efecto relajante de la apigenina sobre el anillo arterial contraído a 60 mM K+- y 0,3 μM U46619 de manera dependiente de la concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La alteración de la microcirculación coronaria, que involucra a una amplia gama de pacientes con EAC, se ha reconocido gradualmente y se ha preocupado por la base para una adecuada perfusión de miocardio. Teniendo en cuenta las complicaciones graves de la enfermedad coronaria repentina y la enfermedad cardiovascular, la prevención y el tratamiento oportunos de los medicamentos son extremadamente importantes para un individuo clínico con CAD17. Inevitablemente, el secreto de la anatomía de la arteria coronaria y la complejidad de su estructura fisiológica han restringido severamente la evaluación racional y científica de la eficacia de los fármacos y tratamientos para la EAC 18,19,20,21,22,23,24,25 . Sin lugar a dudas, la localización precisa y el aislamiento de las arterias coronarias activas es un requisito previo para promover la exploración de los mecanismos patológicos y la evaluación de las medidas de prevención y tratamiento de las enfermedades relacionadas con la EAC. La plataforma de la micrografía de alambre es adecuada para registrar incesantemente la tensión tisular in vitro con estructuras anulares y de cavidad, que varían en diámetro de 60 μm a 10 mm. El anillo de la arteria coronaria se puede unir a la cámara mediante dos cables con una temperatura constante y control de oxígeno. Los datos de vasoconstricción y relajación después de agregar diferentes fármacos se ingresan en la computadora a través del sensor de tensión, con datos adquiridos y documentados continuamente14.
Este artículo describe principalmente la posición concreta de la arteria coronaria de la rata y el proceso de separación. Y el proceso dinámico de los cambios en la tensión de la arteria coronaria en ratas se midió mediante el sistema de micrografía de alambre. Dada la heterogeneidad de las especies humanas y de ratas, debemos ser conscientes de estas diferencias a la hora de buscar y aislar las arterias coronarias de las ratas. Las arterias coronarias de la rata se dividen en arterias izquierda y derecha con una rama septal interventricular independiente. Las arterias coronarias humanas están en la superficie del corazón, mientras que las arterias coronarias de la rata son ligeramente más profundas. Al medir la tensión del anillo arterial, toda la solución tamponada estaba saturada y burbujeada con 95% O2 + 5% CO2 a 37 °C, pH = 7.40. El proceso fijo del anillo arterial por dos cables se introdujo en detalle. La arteria en el cuerpo está en un estado de micro constricción en lugar de un estado de relajación completa. Y la función contráctil de la arteria está estrechamente relacionada con la fuerza de tracción aplicada a ellos hasta cierto punto. Por lo tanto, es necesario estandarizar el anillo arterial para que esté en un estado óptimo de precarga para mantener una actividad fisiológica vascular superior en el experimento posterior. Dado que la condición de K + alto (60 mM) puede despolarizar la membrana celular y activar los canales de Ca2 + dependientes de voltaje, esto causa la afluencia de Ca2 + extracelular y la contracción arterial26.
En la prueba de vasoconstricción y dilatación, se investigó el efecto contráctil de K+ o U46619 en las arterias coronarias de rata. En los resultados, K + o U46619 pueden constreñir constantemente las arterias coronarias de las ratas de una manera dependiente de la concentración al actuar sobre canales iónicos o receptores específicos. K+ contrae los vasos principalmente despolarizando las membranas celulares y abriendo canales ca2+ de tipo L27. Mientras tanto, U46619, un análogo de TXA2, contrae los vasos principalmente mediante la activación de canales circulares dependientes de nucleótidos y receptores TXA2. La apigenina, un tipo de flavonoide, existe ampliamente en frutas, verduras y medicinas tradicionales chinas (Semen plantaginis y starjasmine china)28. Los resultados declararon que la apigenina podría dilatar la contracción de las arterias coronarias para estímulos de 60 mM K+ y 0,3 μM U46619. Al final del experimento, el anillo coronario con actividad favorable se validó nuevamente agregando 60 mM K +, causando vasoconstricción similar a la de la estimulación original. Aunque el estudio se centró principalmente en las arterias coronarias, el sistema de micrografía de alambre también fue aplicable a otros vasos tisulares extremadamente pequeños, linfáticos y bronquios. En conclusión, este artículo describió principalmente la ubicación y el aislamiento de las arterias coronarias de ratas. Mientras tanto, sus cambios de tensión se midieron utilizando la plataforma del sistema de micrografía de alambre, proporcionando una metodología precisa y reproducible para la exploración CAD.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el proyecto clave de I + D del Plan Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022YFS0438), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104533), la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (2020M683273) y el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apigenin | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | 150731 | |
| CaCl2 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A501330 | |
| D-glucose | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A610219 | |
| HEPES | Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China | S3872 | |
| KCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100395 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100781 | |
| LabChart Professional version 8.3 | ADInstruments, Australia | — | |
| MgCl2·6H2O | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100288 | |
| Multi myograph system | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 620M | |
| NaCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100241 | |
| NaHCO3 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100865 | |
| Steel wires | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 400447 | |
| U46619 | Sigma, USA | D8174 |
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