Summary
这里描述了神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学协议，以表征人类诱导的多能干细胞衍生神经元中的动态溶酶体微环境。溶酶体膜蛋白和与溶酶体相互作用（稳定或瞬时）的蛋白质可以在该方法中准确定量，在活体人类神经元中具有出色的细胞内空间分辨率。
Abstract
溶酶体经常与各种生物分子交流，以实现降解和其他不同的细胞功能。溶酶体对人类大脑功能至关重要，因为神经元是有丝分裂后，严重依赖自噬-溶酶体途径来维持细胞稳态。尽管在理解各种溶酶体功能方面取得了进展，但捕获溶酶体和其他细胞成分之间的高度动态通讯在技术上具有挑战性，特别是在高通量方式中。在这里，为最近发表的人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经元中的内源性（敲入）溶酶体邻近标记蛋白质组学方法提供了详细的协议。
溶酶体膜蛋白和10-20nm半径内溶酶体周围的蛋白质都可以在活的人类神经元中可靠地鉴定和准确定量。详细描述了协议的每个步骤，即hiPSC神经元培养，邻近标记，神经元收获，荧光显微镜，生物素化蛋白质富集，蛋白质消化，LC-MS分析和数据分析。总之，这种独特的内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法为研究活体神经元中的高动态溶酶体活性提供了一种高通量和强大的分析工具。
Introduction
溶酶体是分解代谢细胞器，通过溶酶体自噬途径1降解大分子。除了降解，溶酶体还参与多种细胞功能，如信号转导、营养传感和分泌2，3，4。溶酶体功能的扰动与溶酶体贮积症、癌症、衰老和神经变性有关3，5，6，7。对于有丝分裂后和高度极化的神经元，溶酶体在神经元细胞稳态、神经递质释放和沿轴突的长距离运输中起着关键作用8，9，10，11。然而，研究人类神经元中的溶酶体一直是一项具有挑战性的任务。诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经元技术的最新进展使得能够培养以前无法获得的活体人类神经元，弥合了动物模型和人类患者研究人脑之间的差距12，13。特别是先进的i3神经元技术在多西环素诱导的启动子作用下，将神经原蛋白-2转录因子稳定地整合到iPSC基因组中，驱动iPSC在2周内分化为纯皮质神经元14，15。
由于高动态溶酶体活性，捕获溶酶体与其他细胞成分的相互作用在技术上具有挑战性，特别是以高通量方式。邻近标记技术非常适合研究这些动态相互作用，因为它能够以出色的空间特异性捕获稳定和瞬时/弱蛋白质相互作用16，17。工程化过氧化物酶或生物素连接酶可以在遗传上融合到诱饵蛋白上。激活后，产生高反应性生物素自由基以共价标记相邻蛋白质，然后可以通过液相色谱-质谱（LC-MS）平台富集链霉亲和素包被的珠子进行下游自下而上的蛋白质组学17，18，19，20，21。
最近开发了一种内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法，以捕获i3神经元22中的动态溶酶体微环境。工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）在iPSCs溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的C末端被敲入，然后可以分化为皮质神经元。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白和经典溶酶体标志物23。LAMP1也在晚期内体中表达，内体成熟为溶酶体;这些晚期内体溶酶体和非降解溶酶体在本方案中都被称为溶酶体。这种内源性LAMP1-APEX探针在生理水平上表达，可以减少LAMP1错误定位和过表达伪影。可以在活的人类神经元中以出色的空间分辨率鉴定和定量数百种溶酶体膜蛋白和溶酶体相互作用体。
在这里，描述了人类iPSC衍生神经元中溶酶体邻近标记蛋白质组学的详细方案，并进一步改进了最近发表的方法22。整个工作流程如图 1 所示。该方案包括hiPSC衍生的神经元培养、神经元中的邻近标记激活、通过荧光显微镜验证APEX活性、确定最佳链霉亲和素珠与输入蛋白的比例、生物素化蛋白的富集、磁珠蛋白消化、肽脱盐和定量、LC-MS分析和蛋白质组学数据分析。还讨论了故障排除指南和实验优化，以改进邻近标记质量控制和性能。
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Protocol
所有程序均由乔治华盛顿大学生物安全和伦理委员会批准。 表1提供了该方案中使用的培养基和缓冲液的组成。此处使用的商业产品信息在 材料表中提供。
1. 人iPSC衍生神经元培养
- 人 iPSC 培养和 LAMP1-APEX 探针整合（7 天）
- 将基质胶储备溶液在4°C的冰桶中解冻过夜，将500μL溶液等分到冷无菌管中，并将等分试样储存在-80°C。 将 500 μL 基质胶原液加入 49.5 mL 冷 DMEM/F12 培养基中，制备 50 mL 包衣溶液。
注意：保持基质胶冷却，并使用预冷的锥形管和移液器吸头以防止聚合。涂层溶液可在4°C下储存2周。 - 在37°C培养箱中用4mL包衣溶液涂覆10cm细胞培养皿1小时。
注意：玻连蛋白可以作为 5 μg/mL 浓度和 2 小时包衣的替代包衣溶液，用于 iPSC 培养。玻连蛋白（单一蛋白质成分）比基质胶更昂贵，但比基质胶具有更少的批次变化和更清晰的背景信号，基质胶是从具有许多细胞外基质蛋白的小鼠肿瘤中提取的。玻连蛋白包被需要未经处理的组织培养板。基质胶包衣适用于处理和未处理的组织培养板。 - 在每个包被的 10 cm 培养皿上解冻并接种 1-300 万个 hiPSC，该培养皿预装了 8 mL 补充有 ROCK 抑制剂的必需 E8 完全培养基（终浓度为 10 μM Y-27632 或 50 nM Chroman1）。
注意：将ROCK抑制剂（Y-27632或Chroman1）添加到干细胞培养基中可最大限度地减少分裂和低温保存后解离诱导的细胞凋亡。Chroman1最近被证明在抑制ROCK1和ROCK224方面比Y-27632更有效。 - iPSC 形成菌落后，通常在 1-2 天后，换用 10 mL 不含 ROCK 抑制剂的 E8 完全培养基。将iPSC培养物保持在E8完全培养基中，并每隔一天用新鲜培养基替换上清液。
- 通过 CRISPR 基因组工程将邻近标记酶工程抗坏血酸过氧化物酶 （APEX2） 整合到内源性 LAMP1 基因的 C 末端。有关生成工程稳定细胞系的详细步骤，请参阅先前发表的方法（Frankenfield等人）。22.
- 将基质胶储备溶液在4°C的冰桶中解冻过夜，将500μL溶液等分到冷无菌管中，并将等分试样储存在-80°C。 将 500 μL 基质胶原液加入 49.5 mL 冷 DMEM/F12 培养基中，制备 50 mL 包衣溶液。
- 人 iPSC 神经元分化（3 天）
- 在分化前，在37°C培养箱中用4mL基质胶包被溶液涂覆10cm细胞培养皿过夜。
- 维持 hiPSC 直至 ~70% 汇合。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）2x轻轻洗涤hiPSC以去除死细胞。吸出PBS并将3mL的Accutase添加到10cm细胞培养皿中。摇动板均匀分布，并在37°C培养箱中孵育8分钟。
- 加入 2 mL PBS 以洗涤并从平板中取出细胞，并将所有细胞溶液收集在 15 mL 锥形管中。通过以300× g 离心5分钟来沉淀细胞。将板 2-4 × 106 hiPSC 放在预装有 8 mL 温神经元诱导培养基的基质胶包被板上（表 1）。均匀分布细胞并置于37°C培养箱中。
注意：神经元分化由多西环素诱导的转录因子神经生殖素-2（NGN2）驱动，该转录因子在该稳定的hiPSC细胞系15中过表达。 - 在分化的第1天用PBS轻轻洗涤hiPSC，以去除死细胞碎片。用不含 ROCK 抑制剂的 10 mL 温诱导培养基替换。
- 每天用不含 ROCK 抑制剂的温诱导培养基更换，直到分化的第 3 天。
注意：神经元已准备好重新铺入神经元培养基中。
- 电镀神经元和维持神经元培养（10天）
- 在硼酸盐缓冲液中制备0.1 mg/mL聚-L-鸟氨酸（PLO）涂层溶液（表1）。
- 在接种第3天神经元之前，在37°C培养箱中用PLO涂层溶液涂覆细胞培养皿至少1小时或过夜。用 4 mL 无菌水清洗培养皿 3 次，让它在生物安全柜内完全风干。
- 用 3 mL Accutase 从每个 10 cm 培养皿中解离第 3 天神经元，并将 8-1000 万个细胞接种到每个预装有温暖皮质神经元培养基的 10 cm PLO 包被培养皿上（表 1）。
- 每2-3天用温暖的神经元培养基进行半培养基更换，直到i3神经元在分化后2周内成熟。
2. 原位 邻近标记和神经元裂解（2小时）
- 在二甲基亚砜（DMSO）中制备500mM生物素 - 苯酚（BP）储备溶液并储存在-20°C。 在邻近标记的当天，用温热的神经元培养基稀释BP储备溶液，并在37°C培养箱中以500μM的终浓度处理神经元30分钟。
注意：在神经元培养基中添加多西环素，这将激活APEX酶表达。在邻近标记实验前至少24小时需要加入多环素。 - 通过将终浓度为1mM的H2O2 添加到神经元培养物中来启动标记反应，并孵育1分钟。立即吸出培养基并用淬灭缓冲液冲洗3次（表1）。
注意：H2O2溶液应在标记反应之前新鲜制成。H2O 2活化需要精确1分钟，以减少实验变化并最大限度地减少由长时间H 2 O 2处理引起的氧化应激。 - 倾斜板以吸出所有残留缓冲液。将冰冷的细胞裂解缓冲液（表1）直接添加到神经元板上。每 100 万个神经元使用 100 μL 细胞裂解缓冲液。旋转平板以获得足够的细胞裂解并放在冰上。
- 将细胞裂解物刮入冷的 1.5 mL 管中。使用浴超声仪（>100 W）在冰冷的水浴中超声处理15分钟，交替40秒开启，20秒关闭循环。
注意：充分裂解的蛋白质溶液应该是透明的，没有颗粒或过多的气泡。细胞裂解物的充分超声处理对于剪切核酸和降低细胞裂解物的粘性以减少下游程序中的非特异性结合至关重要。探针超声仪也可用于提供更强、更快的细胞裂解，但需要在样品之间清洗探针以最大限度地减少交叉污染和样品损失。 - 在4倍体积的裂解缓冲液中向样品中加入冷丙酮（-20°C）。短暂涡旋并在-20°C下孵育3小时。
- 在2°C下以16，500× g 离心10分钟。 在不干扰蛋白质沉淀的情况下除去上清液。用1mL的-20°C丙酮洗涤沉淀2x，离心后除去上清液。
- 用真空浓缩器干燥蛋白质沉淀1分钟。加入细胞裂解缓冲液以完全溶解沉淀。如果需要，请短暂地超声处理。将样品储存在-80°C。
注意：丙酮沉淀可以去除样品中残留的生物素苯酚，这会干扰生物素化蛋白质的下游富集。
3. 荧光显微镜验证APEX定位和活性（1.5天）
- 将表达内源性LAMP1-APEX的i3神经元与500μM BP在37°C孵育30分钟。 用 1 mMH2 O2 处理激活标记仅 1 秒，以限制生物素云的扩散。
- 立即在淬灭缓冲液中用4%多聚甲醛固定细胞，并用PBS轻轻洗涤3次。
注意：对于 10 厘米的培养皿，需要 4-6 mL 才能充分清洗。 - 在室温（RT）下，使用PBS中的3%驴血清和0.1%皂苷阻断和透化细胞30分钟。
- 将细胞与一抗LAMP1抗体（小鼠单克隆H3A4，1：1，000）在4°C孵育过夜。
- 用PBS轻轻洗涤神经元3次。用抗小鼠AF561二抗（1：1，000）和链霉亲和素-680（1：1，000）在室温下孵育神经元1小时。
- 用PBS洗涤2x，并在室温下与Hoechst或4'，4-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核标记物孵育10分钟。
- 在荧光显微镜下观察固定的神经元。观察用链霉亲和素染色并与细胞核外的 LAMP1 染色共定位的生物素化蛋白，以验证 APEX 活性的正确位置。
4.测定链霉亲和素珠与输入蛋白的比例（1.5天）
- 执行去垢剂相容蛋白测定（DCA）以确定细胞裂解物中的总蛋白浓度
- 将牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准品溶解在细胞裂解缓冲液中，浓度为4mg / mL。使用细胞裂解缓冲液制备一系列BSA蛋白标准溶液（0.2-2 mg / mL，5种稀释液）。
- 将每个蛋白质样品、BSA 蛋白质标准溶液和空白细胞裂解缓冲液中的 5 μL 一式三份转移到 96 孔板中的每个孔中。
- 每 1 mL 试剂 A 加入 2 μL 试剂 S 以获得试剂 A'。向每个孔中加入 25 μL 试剂 A'。向每个孔中加入 200 μL 试剂 B。混合并弹出气泡（如果有）。
- 将该96孔板在室温下孵育15分钟，在酶标仪中读取750nm处的吸光度，并根据BSA标准曲线定量蛋白质样品的浓度。
- 磁珠滴定点印迹测定（1.5天）
- 将一系列链霉亲和素磁珠浆液（20 μL、15 μL、12 μL、10 μL、8 μL、4 μL、1 μL、0 μL）转移到 PCR 试管中。将PCR试管放在磁性架上，用100 μL 2%SDS缓冲液洗涤磁珠3次，并在磁性架上完全除去洗涤缓冲液。
- 向每个试管中加入50μg蛋白质样品。加入更多裂解缓冲液至总体积为 80 μL。 紧紧关闭每个管并在4°C下旋转过夜。
- 在台式微量离心机上短暂离心PCR试管。将PCR试管放在磁性架上1分钟。将每个管中的 2 μL 上清液点到干燥的硝酸纤维素膜上，并使膜完全干燥。
注意：如果信号强度较低，则可以在膜上点缀超过 2 μL。每次风干膜后，可以通过在同一点上点样几次来增加体积。也可以使用生物点设备。 - 将膜在封闭缓冲液（TBS）中孵育1小时。将链霉亲和素Alexa Fluor 680偶联物（封闭缓冲液中的1：1，000）中的膜孵育1小时。然后，用TBS-T（表1）5x洗涤膜。
注意：斑点印迹测定的替代方法是使用链霉亲和素抗体进行蛋白质印迹。 - 测量680nm波长下膜上每个点的荧光信号，并在珠子体积上生成荧光信号散点图。根据曲线的指数衰减结束位置，选择 50 μg 输入蛋白质样品所需的最佳磁珠体积。
注意：荧光强度代表上清液中生物素化蛋白质的丰度，随着磁珠数量的增加，荧光强度应降低。
5. 富集生物素化蛋白质和珠子消化（3天）
- 从-80°C转移蛋白质裂解物样品，并在浴超声仪中将样品在1.5 mL管中超声处理30秒，以快速解冻溶液。涡旋并将样品管放在冰上。
- 将 250 μL 链霉亲和素 （SA） 磁珠浆液转移到每个 1.5 mL 管中。将试管放在磁性架上，用 1 mL 洗涤缓冲液 A（2% SDS）洗涤珠子 3 次，然后去除残留缓冲液。
- 根据斑点印迹测定和 DC 蛋白测定的结果，计算 250 μL 链霉亲和素磁珠浆液所需的蛋白质样品量 （μg）。
注意：在这种内源性表达的LAMP1-APEX探针中，50 μg输入蛋白需要5 μL磁珠。因此，将 2.5 mg 总蛋白质添加到 250 μL 珠子中。少于 250 μL 的 SA 微球可用于有限的进样样品材料。 - 将细胞裂解缓冲液加入含有磁珠-裂解物混合物的管中，总体积为1mL，并在4°C下旋转过夜。
注意：来自不同组或重复的样品应归一化为相同的蛋白质浓度，体积和磁珠数量，以减少实验差异。 - 在台式微量离心机上短暂旋转所有试管，并将试管放在磁性架上1分钟。在磁性架上取出上清液。
注意：每次将样品管放在磁性架上后等待 1 分钟至关重要。这可以最大限度地减少磁珠损耗，因为溶液中不可见的少量磁珠仍在向磁体移动。 - 用 1 mL 洗涤缓冲液 A 在室温下洗涤珠子 2 次（每次旋转 5 分钟）。用每个洗涤缓冲液在4°C下依次重复该过程2次。 （缓冲液 B、缓冲液 C 和缓冲液 D; 表 1）。
注意：高浓度的SDS溶液在低温下会沉淀。第一次洗涤必须在室温下进行。 - 将管子放在磁性架上。用缓冲液D清洗珠子2次，以完全去除残留的洗涤剂。将磁珠重悬于100μL的50mM Tris缓冲液中，并加入5mM TCEP（终浓度）以在温控混合器中于37°C孵育30分钟，以1，200rpm振荡。
- 向每个试管中加入15mM碘乙酰胺（IAA，终浓度），并在温控混合器中于37°C孵育30分钟，在黑暗中以1，200rpm振荡（混合器盖打开）。
注意：IAA对光敏感，应在此步骤前5分钟新鲜。 - 加入5 mM TCEP（终浓度）以淬灭过量的IAA。在温控混合器中在37°C下孵育10分钟，以1，200rpm振荡（混合器盖关闭）。
- 短暂离心样品管并置于磁性架上1分钟以除去上清液。在 50 mM Tris 缓冲液中加入 200 μL 5 mM TCEP 以重悬磁珠。向样品中加入1μg胰蛋白酶/ Lys-C混合物，并在温控混合器中于37°C孵育14小时，以1，200rpm振荡。
- 再加入0.2μg胰蛋白酶/Lys-C混合物并消化3小时。
- 短暂旋转样品管并将试管放在磁性架上1分钟。转移肽上清液以在磁性架上清洁试管。用50μL的50mM Tris缓冲液（振荡5分钟）洗涤珠子并合并肽上清液。
- 向含有肽上清液的管中加入 30 μL 10% 三氟乙酸 （TFA） 以获得 pH <3。
6.肽脱盐和分馏（2小时）
- 在真空歧管上用 200 μL HPLC 级甲醇 （MeOH） 3x 润湿反相固相萃取板（仅供使用的孔）。在 HPLC 级水中加入 200 μL 1% TFA 3 倍以平衡板。
- 将肽样品装入板中，缓慢打开真空，流速低于3 Droplet/s，以最大程度地减少样品损失。
- 用 200 μL 1% TFA 洗涤提取板 3 次。用 200 μL 含有 2% MeOH （v/v） 的 1% TFA 再次洗涤提取板。保持流速低于3液滴/秒。
- 用 96 孔收集板更换收集板。如果不需要分级分离，则用含有80%MeOH的100 μL 1% TFA洗脱肽样品3倍，并合并到新的样品管中。在不加热的真空浓缩器中干燥肽样品。
注意：如果需要分级分离，可以在不同的收集板中使用分别含有15%、35%、50%和90%MeOH的200μL1%TFA洗脱成4个级分。
7.比色肽定量测定（可选）（1小时）
- 将肽样品重悬于 50 μL LC-MS 级水中，并取 20 μL 等分试样进行肽测定。
注意：此步骤消耗大量肽样品，但可以在LC-MS分析之前提供肽浓度的准确定量。在大规模样品制备之前，每种样品类型通常只进行一次测试。 - 在LC-MS级水中制备肽标准溶液（在比色测定试剂盒中提供）的系列稀释液。通过混合50%试剂A，48%试剂B和2%试剂C来制备工作试剂。
- 将 20 μL 每种肽标准溶液（三次重复）和未知肽样品转移到 96 孔微孔板中。向每个孔中加入 180 μL 工作试剂，充分混合，并在室温下孵育板 30 分钟。
- 在酶标仪中读取480nm处的吸光度，并根据肽标准曲线定量肽样品的浓度。
8. LC-MS分析
- 将肽样品重悬于液相色谱缓冲液A（2%乙腈和0.1%甲酸，LC-MS级）中。在4°C下以16，500× g 离心10分钟以除去任何可能的颗粒。
- 将上清液转移到LC-MS小瓶中。使用nanoLC-MS仪器分析样品。
注意：详细的LC-MS/MS参数取决于仪器，前面已描述22，25，26。 - 生成具有链霉亲和素和胰蛋白酶等高丰度污染物肽峰（如链霉亲和素和胰蛋白酶）的保留时间范围的自定义LC-MS排除列表，质量精度为5 ppm 22（例如，常见的链霉亲和素肽峰为m/z 402.5435 [电荷3]、m/z 603.3117 [电荷2]、m/z 654.9733 [电荷3]、m/z 678.6812 [电荷3]、m/z 1017.5182 [电荷 2]， 等。;常见的胰蛋白酶肽峰为 m/z 421.7584 [电荷 2]、m/z 523.2855 [电荷 2] 和 m/z 737.7062 [电荷 3]）。
第9章 蛋白质组学数据分析
- 使用蛋白质组学数据分析软件（如蛋白质组发现器、MaxQuant27 或 MS-Fragger28）分析 LC-MS 原始数据。包括两个用于数据分析的FASTA库：1）一个瑞士智 人 参考数据库;2）新生成的通用污染物FASTA文库（https://github.com/HaoGroup-ProtContLib），该文库被证明可以改善蛋白质组学鉴定并减少错误发现29。
- 设置蛋白质组学数据分析参数，以 1% 的错误发现率 （FDR） 截止值进行蛋白质和肽谱匹配 （PSM） 鉴定。选择胰蛋白酶消化，最多错过三次切割，半胱氨酸氨基甲酰甲基化的固定修饰，以及蛋氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化的可变修饰。使用肽MS1峰强度进行无标记定量。将肽强度标准化为内源性生物素化羧化酶丙酰辅酶A羧化酶（PCCA），以减少邻近标记变化，如前所述22。
注意：PCCA标准化可以通过包含PCCA蛋白质序列FASTA文件在蛋白质组发现器软件中选择。或者，可以在下游数据分析中进行PCCA归一化。 - 从蛋白质组学软件导出蛋白质水平的结果。在统计分析之前去除污染物蛋白质29.去除只有 1 PSM 或没有定量结果的蛋白质。使用 Enrichr30 进行蛋白质基因本体 （GO） 项分析，使用 STRING31 进行蛋白质网络分析。
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Representative Results
这项溶酶体邻近标记蛋白质组学研究是在人iPSC衍生的神经元中进行的，以在活神经元中 原位 捕获动态溶酶体微环境。hiPSCs和hiPSC衍生神经元在不同时间点的细胞形态如图 2A所示。人 iPSC 在 E8 培养基中的菌落中生长。通过将 iPSC 接种到含多西环素的神经元诱导培养基中来启动分化。在 3 天分化期间，神经突延伸每天变得更加明显。在神经元培养基中切换到PLO涂层板后，神经突在神经元之间形成网络，并且随着神经元在2周内成熟，轴突延伸变得更加明显。在i3神经元中，在快速APEX激活后通过荧光显微镜验证APEX探针的定位。使用链霉亲和素（SA）抗体对生物素化蛋白进行染色，使用抗LAMP1抗体对溶酶体进行染色。合并的图像验证了LAMP1-APEX与诱饵蛋白的正确定位（图2B）。
磁珠滴定测定对于确定最佳磁珠与蛋白质比至关重要，因此链霉亲和素微球的量足以富集所有生物素化蛋白，但又不会过量导致LC-MS中链霉亲和素严重污染。根据曲线的指数衰减结束位置选择50μg输入蛋白质样品所需的最佳磁珠体积（图3A）如图 3A所示，随着链霉亲和素珠数量的增加捕获更多的生物素化蛋白质，来自磁珠蛋白质孵育上清液的斑点印迹信号减少。对于内源性 LAMP1-APEX 样品，5 μL 链霉亲和素微球最适合 50 μg 起始蛋白（ 图 3A 中突出显示）。富集后，链霉亲和素珠捕获的蛋白质量未知。过量的蛋白水解酶（胰蛋白酶）可增加酶的自消化，LC-MS中具有丰富的胰蛋白酶肽峰。过量的胰蛋白酶还可以消化样品中更多的链霉亲和素肽。因此，应优化珠子消化所需的蛋白酶量。与单独使用胰蛋白酶相比，使用胰蛋白酶/Lys-C 混合物进行珠子消化可鉴定出更多的蛋白质和肽，并减少漏裂（图 3B）。此外，每 250 μL 链霉亲和素磁珠含 1-1.5 μg 蛋白酶是获得最佳鉴定蛋白质数量最多和遗漏切割百分比最低的最佳选择（图 3C）。在最佳的磁珠与蛋白质比例下，相同数量的磁珠应捕获相同数量的生物素化蛋白质。因此，这种优化的蛋白酶量可用于使用相同的链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白质的所有实验。
基于过氧化物酶的接近标记酶通过生物素 - 苯酚孵育和简短的H 2 O2处理（1分钟）激活。这一步是邻近标记蛋白质组学变异的主要来源。我们之前发现，归一化为最丰富的内源性生物素化羧化酶PCCA可以显着减少实验变异，从而可以比较不同实验批次的邻近标记蛋白质组学数据（图4）22。对于内源性LAMP1-APEX神经元，以无LAMP1-APEX探针表达的亲本系作为对照组。对照神经元也用生物素-苯酚和H2O2处理。LAMP1-APEX与对照组的蛋白质比例分布如图5A所示。所有内源性生物素化羧化酶均由链霉亲和素包被的磁珠富集，但保持不变。如GO项分析和蛋白质网络分析（图5B，C）所示，与内溶酶体运输和运输相关的稳定溶酶体膜蛋白和瞬时溶酶体相互作用物均在LAMP1-APEX蛋白质组学32，33，34中富集。
图 1：hiPSC 衍生神经元中溶酶体邻近标记蛋白质组学的整体工作流程。 缩写：hiPSC = 人诱导多能干细胞;LAMP1 = 溶酶体相关膜蛋白 1;顶点=抗坏血酸过氧化物酶;DOX = 多西环素;BP = 生物素-苯酚;DCA = 洗涤剂相容的蛋白质测定;SA = 链霉亲和素;LC-MS/MS = 液相色谱-串联质谱;PCCA = 丙酰辅酶A羧化酶，一种内源性生物素化蛋白。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：hiPSC 衍生神经元和 LAMP1-APEX 活性的显微成像。 （A） hiPSC 和 hiPSC 衍生神经元不同阶段的明场显微镜图像。（B）神经元中LAMP1-APEX活性的荧光成像。对链霉亲和素染色的生物素化信号与细胞核外的LAMP1染色（HOECHST）共定位。比例尺 = （A） 50 μm， （B） 1 μm。缩写：hiPSC = 人诱导多能干细胞;LAMP1 = 溶酶体相关膜蛋白 1;顶点=抗坏血酸过氧化物酶;SA = 链霉亲和素。请点击此处查看此图的大图。
图 3：磁珠与进料蛋白比的优化和酶促蛋白消化可以改善蛋白鉴定并减少干扰 。 （A） 使用 50 μg 起始蛋白和不同量的链霉亲和素磁珠的斑点印迹测定结果的磁珠滴定测定示例。（B）与单独使用胰蛋白酶相比，胰蛋白酶/Lys-C混合物可更好地鉴定蛋白质/肽，并减少遗漏的切割。（C）优化用于珠子消化的胰蛋白酶/Lys-C的量。这个数字是从弗兰肯菲尔德等人22修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：将邻近标记蛋白质组学数据标准化为内源性生物素化羧化酶 PCCA，可以减少生物重复之间的定量差异。 这个数字是从弗兰肯菲尔德等人22修改的。缩写：PCCA = 丙酰辅酶A羧化酶。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：溶酶体邻近标记蛋白质组学富集了神经元中的溶酶体膜蛋白和溶酶体相互作用蛋白。 （A） LAMP1-APEX 与无 APEX 对照的蛋白质丰度比散点图，显示富集的溶酶体膜蛋白和不变的内源性生物素化蛋白。（B）蛋白质组学结果的GO项分析证明溶酶体中富含细胞成分。（C）STRING蛋白网络分析显示蛋白质直接与诱饵蛋白（LAMP1）、溶酶体膜蛋白和溶酶体相互作用者如膜运输蛋白。这个数字是从弗兰肯菲尔德等人22修改的。缩写：LAMP1 = 溶酶体相关膜蛋白 1;顶点=抗坏血酸过氧化物酶;GO = 基因本体。请点击此处查看此图的大图。
| 培养基/缓冲液 | 元件 | 协议 | ||
| 基底膜基质（基质胶）涂层解决方案 | 1% 基底膜基质原料，99% DMEM/F12 培养基 | 1.1, 1.2 | ||
| 玻连蛋白包衣液 | 5 μg/mL 最终浓度（以 PBS 为单位） | 1.1 | ||
| 含 ROCK 抑制剂的 E8 完全培养基 | 98% E8 培养基、2% E8 补充剂、10 μM Y-27632 或 50 nM 色度1 | 1.1 | ||
| 神经元诱导培养基 | 97% DMEM/F12 含 HEPES、1% N2 补充剂、1% 非必需氨基酸 （NEAA）、1% L-谷氨酰胺、2 μg/mL 多西环素和 ROCK 抑制剂（10 μM Y-27632 或 5 nM 色度 1） | 1.2 | ||
| 神经元PLO涂层解决方案 | 0.1 毫克/毫升聚-L-鸟氨酸 （PLO）、100 毫米硼酸、25 毫米四硼酸钠、75 毫米氯化钠、1 M 氢氧化钠 | 1.3 | ||
| 神经元培养基 | 98% 皮质神经元培养基、2% B27 补充剂、10 ng/mL 脑源性神经营养因子 （BDNF）、10 ng/mL 神经胶质来源神经营养因子 （GDNF）、10 ng/mL NT-3、0.2 μg/mL 层粘连蛋白、2 μg/mL 多西环素 | 1.3 | ||
| 淬火缓冲液 | PBS中的10 mM叠氮化钠，10 mM抗坏血酸钠，5 mM TROLOX | 2.2 | ||
| 细胞裂解缓冲液 | 50 mM 三甲基盐酸盐、500 mM 氯化钠、0.2% SDS、1% 海卫一、1 mM 三（2-羧乙基）膦盐酸盐 （TCEP）、10 mM 叠氮化钠、10 mM 抗坏血酸钠、5 mM TROLOX、蛋白酶抑制剂混合物 | 2.3 | ||
| TBS-T | 0.05% 吐温20， 20 mM Tris， 150 mM 氯化钠 （pH 7.5） | 4.2 | ||
| 缓冲液 A | 2% SDS 缓冲液 | 5.2 | ||
| 缓冲液 B | 50 mM 三盐酸， 500 mM 氯化钠， 2% Triton-X | 5.6 | ||
| 缓冲液 C | 50 mM 三盐酸， 250 mM 氯化钠， 0.5% SDS， 0.5% Triton-X | 5.6 | ||
| 缓冲液 D | 2 M 尿素，50 mM 三盐酸 | 5.6 | ||
表1：本协议中使用的培养基和缓冲液的组成。
| 问题 | 协议 | 解决方案/建议 | ||||
| iPSC 培养物从平板上剥离 | 1.1 | 增加玻连蛋白包衣浓度或时间。 | ||||
| 一些iPSCs没有分化成神经元 | 1.2 | 增加细胞分离溶液处理时间，以在d0分化过程中完全解离iPSC。 | ||||
| 神经元培养从平板上剥离 | 1.3 | 清洗和更换介质必须温和，并且从板的侧壁开始。 | ||||
| 丙酮沉淀后蛋白质不能完全溶解 | 2.7 | 减少蛋白质沉淀的干燥时间。增加裂解缓冲液的体积并短暂超声处理以帮助溶解。 | ||||
| 链霉亲和素染色信号弱 | 3 | 将H2O 2处理时间增加到2-3 秒，并旋转板以均匀分布。 | ||||
| 微球滴定测定信号低 | 4.2 | 等到膜完全干燥，向同一部位添加更多上清液（可重复多达3倍）以增强信号强度。 | ||||
| 磁珠不会向磁性架颗粒 | 5 | 在不含洗涤剂的缓冲液中，磁珠迁移率降低。尿素浓度高达 4 M 或兼容 LC-MS 的洗涤剂可用于洗涤缓冲液 D。 | ||||
| 磁珠清洗过程中的磁珠损耗 | 5 | 在从管中取出上清液之前，增加将样品管放置在磁珠上的等待时间（1分钟或更长时间）。 | ||||
| LC-MS中的单电荷污染峰 | 6 | 肽净化不足。增加肽脱盐期间的洗涤量和时间。 | ||||
| 肽测定低信号 | 7 | 以较低体积重悬肽样品以增加肽浓度。 | ||||
| LC-MS中压倒性的链霉亲和素信号 | 8 | 减少链霉亲和素珠的量。如果胰蛋白酶峰也丰富，请减少胰蛋白酶量。 | ||||
| 非特异性标记背景过多 | 9 | 链霉亲和素珠洗还不够。在每个洗涤步骤中清除所有残留液体。增加洗涤珠子的时间和体积。 | ||||
表 2：故障排除问题和解决方案。
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Discussion
使用该LAMP1-APEX探针，溶酶体膜上和附近的蛋白质被生物素化和富集。鉴于典型的溶酶体直径为100-1，200nm，该方法可提供出色的细胞内分辨率，标记半径为10-20nm。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白，也是溶酶体的经典标志物，可作为内源表达水平溶酶体APEX标记的优良诱饵蛋白。然而，当使用LAMP1靶向溶酶体时也存在局限性，因为LAMP1也存在于晚期内体和非降解溶酶体中35。大多数溶酶体标志物也在晚期内体中表达，最终成熟为溶酶体。靶向溶酶体的替代诱饵蛋白是LAMPTOR，LAMP2和TMEM19235，36，37。重要的是要注意，反应性生物素自由基不会穿透膜。因此，大多数仅溶酶体管腔蛋白在这种LAMP1-APEX蛋白质组学方法中未被捕获。溶酶体腔蛋白可以通过传统的梯度离心法或溶酶体免疫纯化4，38进行溶酶体分离而获得。然而，溶酶体膜上的蛋白质可能在溶酶体分离过程中被破坏，并丢失瞬时和动态溶酶体相互作用的信息。因此，溶酶体邻近标记和溶酶体分离可以结合起来，以获得溶酶体内外溶酶体活性的完整快照。
为了尽量减少iPSC神经元培养的变异性，神经元接种密度必须在所有生物学重复和对照组中保持一致。因此，相同水平的神经元成熟和健康也至关重要。在APEX活化过程中，必须先与温热的培养基混合，然后将混合物添加到细胞中，然后立即轻轻摇动以确保均匀分布，从而向细胞中添加生物素-苯酚和H2O2 。H2O2 的使用也引起了对细胞动态微环境中氧化应激和扰动的担忧。虽然在蛋白质丰度水平上没有发现显着变化，但在H2O2处理的神经元中，与对照神经元相比，蛋氨酸氧化修饰了更多的肽22。因此，严格控制H2O2 活化时间（1分钟）对于最小化氧化应激和减少生物素云的扩散以确保诱饵蛋白周围的特定标记半径至关重要。
对于HEK和U2OS等非极化细胞系，可以在邻近标记后通过沉淀来收获细胞，以去除含有游离生物素的上清液。然而，必须通过直接向平板上添加细胞裂解缓冲液并刮入试管中来收获神经元，以避免在沉淀过程中神经突受损和样品损失。游离生物素的存在可以使链霉亲和素珠饱和。游离生物素的完全去除可以通过多次洗涤和在神经元中的淬灭缓冲液和/或细胞裂解后的蛋白质沉淀中孵育来实现。由于不同的诱饵蛋白具有不同的表达水平，因此需要对每个新的APEX探针进行点印迹测定。确定最佳磁珠/蛋白比例后，同一APEX探针的所有重复的起始蛋白量和磁珠体积应一致。在比较不同的探针（例如 LAMP1-APEX 与胞质-APEX）时，建议使用相同体积的磁珠，但改变起始蛋白的量，以反映不同 APEX 探针的最佳磁珠/蛋白质比例。为了进一步减少实验变化并提高通量，可以通过细胞培养物（SILAC）中的氨基酸进行稳定同位素标记39。多重同量异位标记也可用于在蛋白质消化后通过TMT/iTRAQ/DiLeu标签20，40，41，42对肽进行化学标记。
接近标记已被广泛用于捕获各种生物中的细胞和分子微环境43.然而，邻近标记仍面临许多技术挑战，例如链霉亲和素信号的污染，使用过氧化氢进行酶活化以及存在内源性生物素化线粒体羧化酶。因此，邻近标记蛋白质组学实验需要仔细规划和质量控制。为了帮助研究人员对邻近标记实验进行故障排除，我们在 表 2 中提供了常见问题和解决方案的简要指南。最近，使用硫醇可切割生物素25开发了一种可切割的邻近标记方法。因此，生物素化的蛋白质可以使用还原试剂（如TCEP）从磁珠上切割出来，而无需在磁珠上消化。这种可切割的生物素方法可以显著减少链霉亲和素、内源性生物素化羧化酶和非特异性结合的干扰信号。正在进行的工作将把这种可切割的生物素方法应用于LAMP1-APEX蛋白质组学，以提高标记特异性和准确性。邻近标记探针也可以设计为靶向其他亚细胞区室44。鉴定的蛋白质的数量和类型取决于诱饵蛋白的性质、其细胞内环境以及邻近标记探针的表达水平。这种内源性LAMP1-APEX蛋白质组学方法为研究人类神经元中的动态溶酶体活性提供了有价值的工具。详细的方案和方法优化也适用于其他邻近标记探针和化学生物素化，是蛋白质组学界的有用资源。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了NIH资助（R01NS121608）的支持。A.M.F. 承认 ARCS-Metro 华盛顿分会奖学金和波旁 F. 斯克里布纳捐赠奖学金。我们感谢美国国家神经疾病和中风研究所（NINDS）的Michael Ward实验室提供的分子生物学支持和i3神经元技术开发。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
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