Summary

توصيف تفاعل الليزوزوم العصبي مع البروتينات ذات العلامات القريبة

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

يوصف هنا بروتوكول البروتينات التوأم للجسيمات العصبية الليزوزومية لتوصيف البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن قياس بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات التي تتفاعل مع الليزوزومات (بشكل ثابت أو عابر) بدقة في هذه الطريقة بدقة مكانية ممتازة داخل الخلايا في الخلايا العصبية البشرية الحية.

Abstract

تتواصل الليزوزومات في كثير من الأحيان مع مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية لتحقيق التدهور والوظائف الخلوية المتنوعة الأخرى. تعد الجسيمات الحالة ضرورية لوظيفة الدماغ البشري؛ حيث تكون الخلايا العصبية بعد الانقسام وتعتمد بشكل كبير على مسار الالتهام الذاتي والليزوزوم للحفاظ على الاتزان الخلوي. على الرغم من التقدم في فهم وظائف الليزوزومات المختلفة ، فإن التقاط الاتصالات الديناميكية للغاية بين الجسيمات الحالة والمكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لطريقة وسم القرب من الليزوزومات الداخلية (الضربة القاضية) المنشورة مؤخرا في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC).

يمكن تحديد كل من بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات المحيطة بالليزوزومات داخل دائرة نصف قطرها 10-20 نانومتر بثقة وقياسها بدقة في الخلايا العصبية البشرية الحية. يتم وصف كل خطوة من خطوات البروتوكول بالتفصيل ، أي ثقافة الخلايا العصبية hiPSC ، ووضع العلامات على القرب ، وحصاد الخلايا العصبية ، والفحص المجهري الفلوري ، وإثراء البروتين البيوتيني ، وهضم البروتين ، وتحليل LC-MS ، وتحليل البيانات. باختصار ، توفر طريقة البروتينات الفريدة لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الداخلية أداة تحليلية عالية الإنتاجية وقوية لدراسة الأنشطة الليزوزومية الديناميكية للغاية في الخلايا العصبية البشرية الحية.

Introduction

الجسيمات الحالة هي عضيات تقويضية تحلل الجزيئات الكبيرة عبر مسار الالتهام الذاتي الليزوزومي1. إلى جانب التدهور ، تشارك الليزوزومات في وظائف خلوية متنوعة مثل نقل الإشارات واستشعار المغذيات والإفراز2،3،4. تورطت الاضطرابات في وظيفة الليزوزومات في اضطرابات التخزين الليزوزومية والسرطان والشيخوخة والتنكس العصبي3،5،6،7. بالنسبة للخلايا العصبية بعد الانقسام وشديدة الاستقطاب ، تلعب الليزوزومات أدوارا مهمة في الاتزان الخلوي العصبي ، وإطلاق الناقل العصبي ، والنقل لمسافات طويلة على طول المحاور8،9،10،11. ومع ذلك ، فإن التحقيق في الجسيمات الحالة في الخلايا العصبية البشرية كان مهمة صعبة. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) من زراعة الخلايا العصبية البشرية الحية التي لم يكن من الممكن الوصول إليها في السابق ، مما أدى إلى سد الفجوة بين النماذج الحيوانية والمرضى من البشر لدراسة الدماغ البشري12,13. على وجه الخصوص ، تدمج تقنية i3Neuron المتقدمة بثبات عامل النسخ neurogenin-2 في جينوم iPSC تحت مروج محفز للدوكسيسيكلين ، مما يدفع iPSCs إلى التمايز إلى خلايا عصبية قشرية نقية في أسبوعين14,15.

نظرا للنشاط الليزوزومي الديناميكي للغاية ، فإن التقاط التفاعلات الليزوزومية مع المكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. تقنية وضع العلامات عن قرب مناسبة تماما لدراسة هذه التفاعلات الديناميكية نظرا لقدرتها على التقاط تفاعلات البروتين المستقرة والعابرة / الضعيفة مع خصوصية مكانية استثنائية16,17. يمكن دمج البيروكسيديز المهندسون أو البيوتين ليجاز وراثيا مع بروتين الطعم. عند التنشيط ، يتم إنتاج جذور البيوتين عالية التفاعل لتسمية البروتينات المجاورة تساهميا ، والتي يمكن بعد ذلك تخصيبها بالخرز المطلي بالستربتافيدين للبروتينات من أسفل إلى أعلى عبر منصات قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)17،18،19،20،21.

تم مؤخرا تطوير طريقة البروتينات لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الذاتية لالتقاط البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في i3Neurons22. تم ضرب بيروكسيديز الأسكوربات الهندسي (APEX2) على المحطة C لبروتين الغشاء المرتبط بالليزوزومات 1 (LAMP1) في iPSCs ، والتي يمكن بعد ذلك تمييزها إلى خلايا عصبية قشرية. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة ليزوزومية كلاسيكية23. يتم التعبير عن LAMP1 أيضا في الإندوسومات المتأخرة ، والتي تنضج إلى الليزوزومات. يشار إلى كل من هذه الليزوزومات اللينزوزومية المتأخرة والليزوزومات غير المتدهورة باسم الليزوزومات في هذا البروتوكول. يمكن لمسبار LAMP1-APEX الداخلي ، الذي يتم التعبير عنه على المستوى الفسيولوجي ، أن يقلل من سوء تحديد موقع LAMP1 والتحف المفرطة في التعبير. يمكن تحديد المئات من بروتينات الغشاء الليزوزومي والمتفاعلات الليزوزومية وقياسها بدقة مكانية ممتازة في الخلايا العصبية البشرية الحية.

هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لبروتينات وسم القرب من الليزوزوم في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية مع مزيد من التحسينات من الطريقة22 المنشورة مؤخرا. يوضح الشكل 1 سير العمل العام. يتضمن البروتوكول زراعة الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC ، وتنشيط وضع العلامات عن قرب في الخلايا العصبية ، والتحقق من نشاط APEX عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، وتحديد نسبة البروتين المثلى من حبات الستربتافيدين إلى المدخلات ، وإثراء البروتينات البيوتينيل ، وهضم البروتين على الخرز ، وتحلية الببتيد وتحديدها ، وتحليل LC-MS ، وتحليل بيانات البروتينات. تتم أيضا مناقشة إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسينات التجريبية لتحسين مراقبة جودة وأداء وضع العلامات القريبة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة السلامة البيولوجية والأخلاقيات بجامعة جورج واشنطن. يتم توفير تركيبات الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. يتم توفير معلومات المنتج التجاري المستخدمة هنا في جدول المواد. 1. ثقافة ?…

Representative Results

أجريت دراسة البروتينات ذات العلامات المقربة من الليزوزوم هذه في الخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC لالتقاط البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الموقع في الخلايا العصبية الحية. يوضح الشكل 2 أ مورفولوجيا الخلايا ل hiPSCs والخلايا العصبية المشتقة من hiPSC في نقاط …

Discussion

باستخدام مسبار LAMP1-APEX هذا ، يتم إثراء البروتينات الموجودة على الغشاء الليزوزومي وبالقرب منه. بالنظر إلى قطر الليزوزوم النموذجي من 100-1200 نانومتر ، توفر هذه الطريقة دقة ممتازة داخل الخلايا مع نصف قطر وضع العلامات 10-20 نانومتر. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة كلاسيكية للليزوزومات ، ويع?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة بمنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01NS121608). تعترف AMF بمنحة ARCS-Metro Washington Chapter الدراسية وزمالة Bourbon F. Scribner Endowment. نشكر مختبر مايكل وارد في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) على دعم البيولوجيا الجزيئية وتطوير تقنية i3Neuron.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Play Video

Cite This Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

View Video