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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Caractérisation de l’interactome du lysosome neuronal avec protéomique de marquage de proximité

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64132
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, The George Washington University
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole protéomique de marquage de proximité des lysosomes neuronaux est décrit ici pour caractériser le microenvironnement lysosomal dynamique dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines qui interagissent avec les lysosomes (de manière stable ou transitoire) peuvent être quantifiées avec précision dans cette méthode avec une excellente résolution spatiale intracellulaire dans les neurones humains vivants.

Abstract

Les lysosomes communiquent fréquemment avec une variété de biomolécules pour obtenir la dégradation et d’autres fonctions cellulaires diverses. Les lysosomes sont essentiels au fonctionnement du cerveau humain, car les neurones sont postmitotiques et dépendent fortement de la voie autophagie-lysosome pour maintenir l’homéostasie cellulaire. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de diverses fonctions lysosomales, la capture des communications hautement dynamiques entre les lysosomes et d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. Ici, un protocole détaillé est fourni pour la méthode protéomique de marquage de proximité des lysosomes endogènes (knock-in) récemment publiée dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC).

Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines entourant les lysosomes dans un rayon de 10 à 20 nm peuvent être identifiées avec confiance et quantifiées avec précision dans les neurones humains vivants. Chaque étape du protocole est décrite en détail, c’est-à-dire la culture de neurones hiPSC, le marquage de proximité, la récolte de neurones, la microscopie à fluorescence, l’enrichissement en protéines biotinylées, la digestion des protéines, l’analyse LC-MS et l’analyse des données. En résumé, cette méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène unique fournit un outil analytique robuste et à haut débit pour étudier les activités lysosomales hautement dynamiques dans les neurones humains vivants.

Introduction

Les lysosomes sont des organites cataboliques qui dégradent les macromolécules par la voie lysosomale-autophagie1. Outre la dégradation, les lysosomes sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la transduction de signalisation, la détection des nutriments et la sécrétion 2,3,4. Les perturbations de la fonction lysosomale ont été impliquées dans les troubles du stockage lysosomal, le cancer, le vieillissement et la neurodégénérescence 3,5,6,7. Pour les neurones postmitotiques et hautement polarisés, les lysosomes jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie cellulaire neuronale, la libération de neurotransmetteurs et le transport à longue distance le long des axones 8,9,10,11. Cependant, l’étude des lysosomes dans les neurones humains a été une tâche difficile. Les progrès récents dans les technologies neuronales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la culture de neurones humains vivants qui étaient auparavant inaccessibles, comblant le fossé entre les modèles animaux et les patients humains pour étudier le cerveau humain12,13. En particulier, la technologie avancéei3Neuron intègre de manière stable le facteur de transcription neurogénine-2 dans le génome iPSC sous un promoteur inductible par la doxycycline, conduisant les iPSCs à se différencier en neurones corticaux purs en 2 semaines14,15.

En raison de l’activité lysosomale hautement dynamique, la capture des interactions lysosomales avec d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. La technologie de marquage de proximité est bien adaptée à l’étude de ces interactions dynamiques en raison de sa capacité à capturer à la fois les interactions protéiques stables et transitoires/faibles avec une spécificité spatiale exceptionnelle16,17. La peroxydase ou la biotine ligase modifiée peut être génétiquement fusionnée à la protéine appât. Lors de l’activation, des radicaux biotine hautement réactifs sont produits pour marquer de manière covalente les protéines voisines, qui peuvent ensuite être enrichies par des billes enrobées de streptavidine pour la protéomique ascendante en aval via des plateformes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Une méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène a récemment été développée pour capturer le microenvironnement lysosomal dynamique dans i3neurones22. L’ascorbate peroxydase modifiée (APEX2) a été frappée sur l’extrémité C de la protéine membranaire lysosomale associée 1 (LAMP1) dans les CSPi, qui peut ensuite être différenciée en neurones corticaux. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur lysosomalclassique 23. LAMP1 est également exprimé dans les endosomes tardifs, qui mûrissent en lysosomes; Ces endosomes-lysosomes tardifs et lysosomes non dégradants sont tous appelés lysosomes dans le présent protocole. Cette sonde endogène LAMP1-APEX, exprimée au niveau physiologique, peut réduire la mauvaise localisation et les artefacts de surexpression de LAMP1. Des centaines de protéines membranaires lysosomales et d’interacteurs lysosomaux peuvent être identifiés et quantifiés avec une excellente résolution spatiale dans des neurones humains vivants.

Ici, un protocole détaillé pour la protéomique de marquage de proximité des lysosomes dans les neurones humains dérivés de l’iPSC est décrit avec d’autres améliorations par rapport à la méthode22 récemment publiée. Le flux de travail global est illustré à la figure 1. Le protocole comprend la culture de neurones dérivée de hiPSC, l’activation du marquage de proximité dans les neurones, la validation de l’activité APEX par microscopie à fluorescence, la détermination d’un rapport optimal entre les billes de streptavidine et les protéines d’entrée, l’enrichissement des protéines biotinylées, la digestion des protéines sur les billes, le dessalage et la quantification des peptides, l’analyse LC-MS et l’analyse des données protéomiques. Les directives de dépannage et les optimisations expérimentales sont également abordées pour améliorer le contrôle qualité et les performances de l’étiquetage de proximité.

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Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de biosécurité et d’éthique de l’Université George Washington. Les compositions des milieux et des tampons utilisés dans ce protocole sont fournies dans le tableau 1. Les informations sur les produits commerciaux utilisées ici sont fournies dans le tableau des matériaux.

1. Culture de neurones humains dérivés de l’iPSC

  1. Culture iPSC humaine et intégration de la sonde LAMP1-APEX (7 jours)
    1. Décongeler la solution mère de Matrigel dans un seau à glace à 4 °C pendant une nuit, aliquoter 500 μL de la solution dans des tubes stériles froids et stocker les aliquotes à −80 °C. Préparer 50 mL de solution de revêtement en ajoutant 500 μL du stock Matrigel dans 49,5 mL de milieu DMEM/F12 froid.
      REMARQUE: Gardez le Matrigel froid et utilisez des tubes coniques prérefroidis et des embouts de pipette pour empêcher la polymérisation. La solution de revêtement peut être conservée à 4 °C pendant 2 semaines.
    2. Enduire une capsule de culture cellulaire de 10 cm de 4 mL de solution d’enrobage pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE : La vitronectine peut être une solution de revêtement alternative à une concentration de 5 μg/mL et un revêtement de 2 h pour la culture de CSPi. La vitronectine (composant protéique unique) est plus chère que Matrigel, mais a moins de variations de lots et de signaux de fond plus propres que Matrigel, qui est extrait de la tumeur de souris avec de nombreuses protéines de matrice extracellulaire. Une plaque de culture tissulaire non traitée est nécessaire pour l’enrobage de vitronectine. Le revêtement matriciel fonctionne pour les plaques de culture tissulaire traitées et non traitées.
    3. Décongeler et plaquer 1 à 3 millions de CSPhi sur chaque plat enrobé de 10 cm préchargé de 8 mL de milieu complet Essential E8 complété par un inhibiteur de ROCK (concentration finale 10 μM Y-27632 ou 50 nM Chroman1).
      REMARQUE: L’ajout d’un inhibiteur de ROCK (Y-27632 ou Chroman1) au milieu de culture de cellules souches minimise l’apoptose induite par la dissociation après la division et la conservation cryogénique. Chroman1 s’est récemment avéré plus puissant que Y-27632 pour inhiber à la fois ROCK1 et ROCK224.
    4. Passer à 10 mL de milieu complet E8 sans inhibiteur de ROCK après que les CSPi ont formé des colonies, généralement après 1-2 jours. Maintenir la culture iPSC dans un milieu complet E8 et remplacer le surnageant par un milieu frais tous les deux jours.
    5. Intégrer l’enzyme de marquage de proximité, l’ascorbate peroxydase (APEX2), dans l’extrémité C du gène endogène LAMP1 par ingénierie du génome CRISPR. Pour les étapes détaillées pour générer une lignée cellulaire stable modifiée, reportez-vous à la méthode précédemment publiée (Frankenfield et al). 22.
  2. Différenciation iPSC-neurones humains (3 jours)
    1. Enduire une capsule de culture cellulaire de 10 cm pendant une nuit de 4 mL de solution d’enrobage Matrigel dans un incubateur à 37 °C avant la différenciation.
    2. Maintenir les CSPh jusqu’à ~70% de confluence. Lavez doucement les CSPh avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 2x pour éliminer les cellules mortes. Aspirer le PBS et ajouter 3 ml d’Accutase à la boîte de cellules de 10 cm. Agiter l’assiette pour une répartition uniforme et incuber pendant 8 min dans un incubateur à 37 °C.
    3. Ajouter 2 mL de PBS pour laver et soulever les cellules de la plaque et recueillir toute la solution cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Enduire les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Plaquette 2-4 × 106 hiPSCs sur une plaque recouverte de matrigel préchargée de 8 mL de milieu d’induction neuronale chaud (tableau 1). Répartir uniformément les cellules et les placer dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE: La différenciation des neurones est entraînée par un facteur de transcription inductible par la doxycycline, la neurogénine-2 (NGN2), qui a été surexprimé dans cette lignée cellulaire stablehiPSC 15.
    4. Lavez doucement les CSPh avec du PBS le jour 1 de la différenciation pour éliminer les débris de cellules mortes. Remplacer par 10 ml de milieu d’induction chaud sans inhibiteur de ROCK.
    5. Changez avec un milieu d’induction chaud sans inhibiteur de ROCK tous les jours jusqu’au jour 3 de la différenciation.
      REMARQUE: Les neurones sont prêts à être replaqués dans le milieu neuronal.
  3. Placage des neurones et maintien de la culture des neurones (10 jours)
    1. Préparer 0,1 mg/mL de solution d’enrobage de poly-L-Ornithine (PLO) dans un tampon de borate (tableau 1).
    2. Enduire une boîte de culture cellulaire de la solution d’enrobage PLO dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant le placage des neurones du jour 3. Lavez le plat avec 4 ml d’eau stérile trois fois et laissez-le sécher complètement à l’air libre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
    3. Dissocier les neurones du jour 3 de chaque boîte de 10 cm avec 3 ml d’Accutase et plaquer 8 à 10 millions de cellules sur chaque boîte de 10 cm recouverte d’OLP préchargée de milieu neuronal cortical chaud (tableau 1).
    4. Effectuer un changement demi-moyen tous les 2-3 jours avec un milieu neuronal chaud jusqu’à ce que les3neurones i atteignent leur maturation dans les 2 semaines suivant la différenciation.

2. Marquage de proximité in situ et lyse neuronale (2 h)

  1. Préparer 500 mM de solution mère de biotine-phénol (BP) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et conserver à −20 °C. Le jour du marquage de proximité, diluer la solution mère de BP avec un milieu neuronal chaud et traiter les neurones à une concentration finale de 500 μM pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
    REMARQUE: La doxycycline est ajoutée dans le milieu neuronal, ce qui activera l’expression enzymatique APEX. La doxcycline doit être ajoutée au moins 24 heures avant l’expérience de marquage de proximité.
  2. Initier la réaction de marquage en ajoutantH2O2à une concentration finale de 1 mM dans la culture de neurones et incuber pendant exactement 1 min. Aspirer immédiatement le milieu et rincer 3 fois avec un tampon de trempe (tableau 1).
    NOTE: Lasolution H 2 O2 doit être fraîche avant la réaction d’étiquetage. L’activation de H 2 O 2 doit être exactement 1 min pour réduire la variation expérimentale et minimiser le stress oxydatif causé par un traitement prolongéH2O2.
  3. Inclinez la plaque pour aspirer tout le tampon résiduel. Ajoutez un tampon de lyse cellulaire glacé (Tableau 1) directement sur la plaque neuronale. Utilisez 100 μL de tampon de lyse cellulaire pour 1 million de neurones. Remuez la plaque pour une lyse cellulaire suffisante et placez-la sur de la glace.
  4. Grattez les lysats cellulaires dans des tubes froids de 1,5 mL. Sonicer dans un bain-marie glacé à l’aide d’un sonicateur de bain (>100 W) pendant 15 min en alternant 40 s et 20 s hors cycles.
    REMARQUE: Une solution protéique suffisamment lysée doit être limpide sans granulés ni bulles excessives. Une sonication suffisante du lysat cellulaire est cruciale pour cisailler les acides nucléiques et réduire la viscosité du lysat cellulaire afin de réduire la liaison non spécifique dans les procédures en aval. Un sonicateur de sonde peut également être utilisé pour fournir une lyse cellulaire plus forte et plus rapide, mais le lavage de la sonde entre les échantillons est nécessaire pour minimiser la contamination croisée et la perte d’échantillons.
  5. Ajouter de l’acétone froide (−20 °C) à l’échantillon à un volume de tampon de lyse multiplié par 4. Vortex brièvement et incuber à −20 °C pendant 3 h.
  6. Centrifuger à 16 500 × g pendant 10 min à 2 °C. Retirer le surnageant sans déranger la pastille de protéine. Laver la pastille avec 1 mL d’acétone −20 °C 2x et retirer le surnageant après centrifugation.
  7. Sécher la pastille de protéine avec un concentrateur sous vide pendant 1 min. Ajouter un tampon de lyse cellulaire pour dissoudre complètement la pastille. Soniquer brièvement si nécessaire. Conserver les échantillons à −80 °C.
    REMARQUE : La précipitation de l’acétone peut éliminer les résidus de biotine-phénol dans l’échantillon, ce qui peut interférer avec l’enrichissement en aval des protéines biotinylées.

3. Microscopie à fluorescence pour valider la localisation et l’activité de l’APEX (1,5 jour)

  1. Incuber lesi3neurones exprimant LAMP1-APEX endogène avec 500 μM BP pendant 30 min à 37 °C. Activer le marquage avec un traitement 1 mMH2O22pendant seulement 1 s pour limiter la diffusion du nuage de biotine.
  2. Fixez immédiatement les cellules avec 4% de paraformaldéhyde dans le tampon de trempe et lavez doucement 3x avec du PBS.
    NOTE: Pour un plat de 10 cm, 4-6 mL est nécessaire pour un lavage suffisant.
  3. Bloquer et perméabiliser les cellules en utilisant 3% de sérum d’ânesse et 0,1% de saponine dans du PBS pendant 30 min à température ambiante (RT).
  4. Incuber les cellules avec l’anticorps anti-LAMP1 primaire (souris monoclonale H3A4, 1:1 000) pendant une nuit à 4 °C.
  5. Lavez les neurones 3 x doucement avec PBS. Incuber les neurones avec l’anticorps secondaire anti-souris AF561 (1:1 000) et la streptavidine-680 (1:1 000) pendant 1 h à TA.
  6. Laver 2x avec PBS et incuber avec Hoechst ou le marqueur nucléaire 4',4-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à TA. Rincer les cellules 2x avec du PBS.
  7. Visualisez les neurones fixes sous un microscope à fluorescence. Observer les protéines biotinylées colorées à la streptavidine et colocalisées avec la coloration LAMP1 à l’extérieur du noyau pour valider l’emplacement correct de l’activité APEX.

4. Détermination du rapport perles/protéines d’entrée des billes de streptavidine (1,5 jour)

  1. Effectuer un dosage des protéines compatibles avec les détergents (DCA) pour déterminer les concentrations totales de protéines dans les lysats cellulaires
    1. Dissoudre l’étalon protéique de l’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon de lyse cellulaire à une concentration de 4 mg/mL. Préparer une série de solutions étalons de protéines BSA (0,2-2 mg/mL, 5 dilutions) en utilisant le tampon de lyse cellulaire.
    2. Transférer 5 μL de chaque échantillon de protéines, solution étalon de protéine BSA et tampon de lyse à cellules blanches en triple dans chaque puits dans une plaque de 96 puits.
    3. Ajouter 2 μL de réactif S par 1 mL de réactif A pour obtenir le réactif A'. Ajouter 25 μL de réactif A' à chaque puits. Ajouter 200 μL de réactif B à chaque puits. Mélangez et faites éclater les bulles si présentes.
    4. Incuber cette plaque de 96 puits à TA pendant 15 min, lire l’absorbance à 750 nm dans un lecteur de microplaques et quantifier les concentrations d’échantillons de protéines en fonction de la courbe standard BSA.
  2. Titrage des billes test de transfert de points (1,5 jours)
    1. Transférer une série de boues magnétiques de billes de streptavidine (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) dans des tubes en bandelettes PCR. Placez les tubes de bande PCR sur une grille magnétique, lavez les billes 3x avec 100 μL de tampon SDS à 2% et retirez complètement le tampon de lavage sur le rack magnétique.
    2. Ajouter 50 μg d’échantillon de protéines dans chaque tube. Ajouter plus de tampon de lyse pour un volume total de 80 μL. Fermer fermement chaque tube et tourner à 4 °C pendant la nuit.
    3. Centrifuger brièvement les tubes de bandelettes PCR sur une microcentrifugeuse de paillasse. Placez les tubes de bande PCR sur un rack magnétique pendant 1 min. Repérez 2 μL de surnageant de chaque tube sur une membrane sèche de nitrocellulose et laissez la membrane sécher complètement.
      REMARQUE: Si l’intensité du signal est faible, plus de 2 μL peuvent être repérés sur la membrane. Le volume peut être augmenté en repérant plusieurs fois au même endroit après que la membrane a été séchée à l’air entre chaque fois. Un appareil Bio-Dot peut également être utilisé.
    4. Incuber la membrane dans un tampon de blocage (TBS) pendant 1 h. Incuber la membrane dans le conjugué Streptavidin Alexa Fluor 680 (1:1 000 dans le tampon de blocage) pendant 1 h. Ensuite, lavez la membrane avec TBS-T (tableau 1) 5x.
      REMARQUE : Une solution de rechange au test par transfert à points est le transfert Western à l’aide d’un anticorps anti-streptavidine.
    5. Mesurez le signal fluorescent de chaque point de la membrane sous la longueur d’onde de 680 nm et générez un nuage de points avec un signal fluorescent sur le volume des billes. Sélectionnez le volume optimal de billes nécessaire pour 50 μg d’échantillon de protéines d’entrée en fonction de l’endroit où la décroissance exponentielle de la courbe se termine.
      NOTE: L’intensité de fluorescence représente l’abondance de protéines biotinylées dans le surnageant, qui devrait diminuer avec l’augmentation des quantités de billes.

5. Enrichissement des protéines biotinylées et digestion sur billes (3 jours)

  1. Transférer les échantillons de lysat de protéines à −80 °C et sonifier les échantillons dans des tubes de 1,5 mL pendant 30 s dans un sonicateur de bain pour décongeler rapidement les solutions. Vortex et placer les tubes d’échantillon sur de la glace.
  2. Transfèrent 250 μL de boue magnétique de billes de streptavidine (SA) dans chaque tube de 1,5 mL. Placez les tubes sur une grille magnétique, lavez les billes 3x avec 1 ml de tampon de lavage A (SDS à 2 %) et retirez le tampon résiduel.
  3. Sur la base des résultats du test par transfert de points et du test de protéine DC, calculer la quantité d’échantillon de protéines (μg) nécessaire pour 250 μL de suspension de billes magnétiques de streptavidine.
    REMARQUE : Dans cette sonde LAMP1-APEX exprimée de manière endogène, 5 μL de billes sont nécessaires pour 50 μg de protéines d’entrée. Par conséquent, 2,5 mg de protéines totales sont ajoutés à 250 μL de billes. Moins de 250 μL de billes d’AS peuvent être utilisées pour un échantillon d’entrée limité.
  4. Ajouter un tampon de lyse cellulaire au tube contenant le mélange perle-lysat magnétique jusqu’à un volume total de 1 mL et faire tourner à 4 °C pendant une nuit.
    REMARQUE : Les échantillons provenant de différents groupes ou répétitions doivent être normalisés à la même concentration de protéines, au même volume et à la même quantité de billes afin de réduire les variations expérimentales.
  5. Faites tourner brièvement tous les tubes sur une microcentrifugeuse de paillasse et placez les tubes sur un support magnétique pendant 1 min. Retirez le surnageant lorsque vous êtes sur le rack magnétique.
    REMARQUE: Il est essentiel d’attendre 1 minute après avoir placé les tubes d’échantillon sur le rack magnétique à chaque fois. Cela peut minimiser la perte de billes due à la petite quantité invisible de billes qui se déplace toujours vers l’aimant dans la solution.
  6. Lavez les billes 2x avec 1 mL de tampon de lavage A à TA (rotation de 5 min à chaque fois). Répétez le processus avec chaque tampon de lavage 2x séquentiellement à 4 °C. (Tampon B, Tampon C et Tampon D ; Tableau 1).
    NOTE: Une concentration élevée de solution SDS peut précipiter à des températures froides. Le premier lavage doit être effectué à RT.
  7. Placez les tubes sur le rack magnétique. Lavez les perles 2x avec le tampon D pour éliminer complètement les résidus de détergent. Resuspendre les billes dans 100 μL de tampon Tris 50 mM et ajouter 5 mM de TCEP (concentration finale) pour incuber pendant 30 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min.
  8. Ajouter 15 mM d’iodoacétamide (AIA, concentration finale) dans chaque tube et incuber pendant 30 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min dans l’obscurité (bouchon du mélangeur activé).
    REMARQUE: L’IAA est sensible à la lumière et doit être renouvelé 5 minutes avant cette étape.
  9. Ajouter 5 mM de PTCE (concentration finale) pour éteindre l’excès d’AIA. Incuber pendant 10 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée en agitant à 1 200 tr/min (bouchon du mélangeur désactivé).
  10. Centrifuger brièvement les tubes d’échantillon et placer sur une grille magnétique pendant 1 min pour retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de PTCE 5 mM dans un tampon Tris 50 mM pour remettre les billes en suspension. Ajouter 1 μg de mélange trypsine/Lys-C à l’échantillon et incuber pendant 14 h à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min.
  11. Ajouter 0,2 μg supplémentaire de mélange trypsine/Lys-C et digérer pendant 3 h.
  12. Faites tourner brièvement les tubes d’échantillon et placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min. Transférez le surnageant peptidique pour nettoyer les tubes sur un support magnétique. Laver les billes avec 50 μL de tampon Tris 50 mM (en agitant pendant 5 min) et combiner les surnageants peptidiques.
  13. Ajouter 30 μL d’acide trifluoroacétique (TFA) à 10% dans le tube contenant le surnageant peptidique pour obtenir un pH <3.

6. Dessalage et fractionnement des peptides (2 h)

  1. Mouiller la plaque d’extraction en phase solide en phase inverse (uniquement les puits à utiliser) avec 200 μL de méthanol de qualité CLHP (MeOH) 3x sur le collecteur à vide. Ajouter 200 μL de TFA à 1% dans de l’eau de qualité CLHP 3x pour équilibrer la plaque.
  2. Chargez les échantillons de peptides dans la plaque, en tournant lentement le vide pour une vitesse d’écoulement inférieure à 3 gouttelettes / s afin de minimiser la perte d’échantillon.
  3. Laver la plaque d’extraction 3x avec 200 μL de TFA à 1%. Laver à nouveau la plaque d’extraction avec 200 μL de TFA à 1% contenant 2% de MeOH (v/v). Maintenez la vitesse d’écoulement inférieure à 3 gouttelettes/s.
  4. Remplacez la plaque de collecte par une plaque de collecte de 96 puits. Si aucun fractionnement n’est nécessaire, éluer les échantillons de peptides 3x avec 100 μL de TFA à 1% contenant 80% de MeOH et combiner dans un nouveau tube à échantillon. Sécher les échantillons de peptides dans un concentrateur sous vide sans chaleur.
    REMARQUE: Si le fractionnement est souhaité, les échantillons de peptides peuvent être élués en 4 fractions en utilisant ensuite 200 μL de TFA à 1% contenant 15%, 35%, 50% et 90% de MeOH, respectivement, dans une plaque de collecte différente.

7. Dosage de quantification colorimétrique des peptides (facultatif) (1 h)

  1. Resuspendre les échantillons de peptides dans 50 μL d’eau de qualité LC-MS et prendre 20 μL aliquotes pour effectuer le dosage peptidique.
    REMARQUE: Cette étape consomme une grande quantité d’échantillon de peptide, mais peut fournir une quantification précise de la concentration peptidique avant l’analyse LC-MS. Cette opération n’est généralement effectuée qu’une seule fois par type d’échantillon pour les analyser avant la préparation de l’échantillon à grande échelle.
  2. Préparer les dilutions en série des solutions étalons peptidiques (fournies dans le kit de dosage colorimétrique) dans l’eau de qualité LC-MS. Préparez le réactif de travail en mélangeant 50% du réactif A, 48% du réactif B et 2% du réactif C.
  3. Transférer 20 μL de chaque solution étalon peptidique (trois réplications) et l’échantillon de peptide inconnu dans une microplaque de 96 puits. Ajouter 180 μL du réactif de travail à chaque puits, bien mélanger et incuber la plaque pendant 30 minutes à TA.
  4. Lire l’absorbance à 480 nm dans un lecteur de microplaques et quantifier les concentrations d’échantillons peptidiques en fonction de la courbe standard peptidique.

8. Analyse LC-MS

  1. Resuspendre les échantillons peptidiques dans le tampon A LC (2 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide formique, grade LC-MS). Centrifuger à 16 500 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les particules éventuelles.
  2. Transférer le surnageant dans des flacons de LC-MS. Analysez les échantillons à l’aide d’un instrument nanoLC-MS.
    NOTE: Les paramètres LC-MS/MS détaillés dépendent de l’instrument et ont été décrits précédemment22,25,26.
  3. Générer une liste d’exclusion LC-MS personnalisée avec une plage de temps de rétention pour les pics de peptides contaminants très abondants tels que la streptavidine et la trypsine avec une précision massique de 5 ppm 22 (par exemple, les pics courants de peptides de streptavidine sont m/z 402,5435 [charge 3], m/z 603,3117 [charge 2], m/z 654,9733 [charge 3], m/z 678,6812 [charge 3], m/z 1017,5182 [charge 2], etc.; Les pics de peptide de trypsine courants sont M/Z 421.7584 [charge 2], m/z 523.2855 [charge 2] et m/z 737.7062 [charge 3]).

9. Analyse des données protéomiques

  1. Analysez les données brutes LC-MS avec un logiciel d’analyse de données protéomique tel que Proteome Discoverer, MaxQuant27 ou MS-Fragger28. Inclure deux bibliothèques FASTA pour l’analyse des données: 1) une base de données de référence Swissprot Homo Sapiens ; 2) une bibliothèque universelle de contaminants FASTA (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) nouvellement générée, dont il a été prouvé qu’elle améliorait l’identification protéomique et réduisait les fausses découvertes29.
  2. Configurez les paramètres d’analyse des données protéomiques avec un seuil de 1 % du taux de fausses découvertes (FDR) pour les identifications de correspondance spectrale des protéines et des peptides (PSM). Sélectionnez la digestion de la trypsine avec un maximum de trois clivages manqués, une modification fixe de la carbamidométhylation de la cystéine et une modification variable de l’oxydation de la méthionine et de l’acétylation N-terminale des protéines. Utilisez les intensités maximales du peptide MS1 pour une quantification sans marquage. Normaliser les intensités peptidiques à la carboxylase biotinylée endogène, la propionyl-CoA carboxylase (PCCA), afin de réduire les variations de marquage de proximité, comme décrit précédemment22.
    REMARQUE: La normalisation PCCA peut être sélectionnée dans le logiciel Proteome Discoverer en incluant un fichier FASTA de séquence de protéines PCCA. Alternativement, la normalisation PCCA peut être effectuée dans l’analyse des données en aval.
  3. Exportez les résultats au niveau des protéines à partir du logiciel de protéomique. Éliminer les protéines contaminantes avant l’analyse statistique29. Éliminer les protéines avec seulement 1 PSM ou aucun résultat de quantification. Effectuez une analyse à terme d’ontologie de gènes protéiques (GO) avec Enrichr30 et une analyse de réseau de protéines avec STRING31.

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Representative Results

Cette étude protéomique de marquage de proximité des lysosomes a été menée dans des neurones humains dérivés de l’iPSC pour capturer le microenvironnement lysosomal dynamique in situ dans les neurones vivants. Les morphologies cellulaires des neurones dérivés des CSPhi et des CSPh à différents moments sont illustrées à la figure 2A. Les CSPi humaines poussent en colonies en milieu E8. La différenciation est initiée en placant les CSPi dans un milieu d’induction neuronale contenant de la doxycycline. Les extensions de neurites deviennent plus visibles chaque jour pendant la différenciation de 3 jours. Après le passage aux plaques recouvertes de PLO dans le milieu neuronal, les neurites forment un réseau entre les neurones, et les extensions axonales deviennent plus visibles lorsque les neurones atteignent la maturation en 2 semaines. Dans i3Neurones, la localisation de la sonde APEX est validée par microscopie à fluorescence suite à une activation rapide d’APEX. Les protéines biotinylées sont colorées à l’aide d’anticorps anti-streptavidine (SA) et les lysosomes sont colorés à l’aide d’anticorps anti-LAMP1. L’image fusionnée valide la localisation correcte de LAMP1-APEX dans la protéine appât (Figure 2B).

Le test de titrage des billes est crucial pour déterminer le rapport perles/protéines optimal afin que la quantité de billes de streptavidine soit suffisante pour enrichir toutes les protéines biotinylées, mais pas trop excessive pour provoquer une contamination grave par la streptavidine dans la LC-MS. Le volume optimal de billes nécessaire pour 50 μg d’échantillon de protéines d’entrée est choisi en fonction de l’endroit où la décroissance exponentielle de la courbe se termine (Figure 3A) Comme le montre la figure 3A, les signaux de transfert de points provenant du surnageant d’incubation de protéines de billes diminuaient à mesure que davantage de protéines biotinylées étaient capturées avec des quantités accrues de billes de streptavidine. Pour les échantillons endogènes LAMP1-APEX, 5 μL de billes de streptavidine étaient optimaux pour 50 μg de protéines d’entrée (mise en évidence à la figure 3A). Après l’enrichissement, la quantité de protéines capturée par les billes de streptavidine est inconnue. L’excès d’enzyme protéolytique (trypsine) peut augmenter l’autodigestion enzymatique, avec des pics de peptide de trypsine abondants dans la LC-MS. L’excès de trypsine peut également digérer plus de peptides de streptavidine dans les échantillons. Par conséquent, la quantité de protéase nécessaire à la digestion des billes doit être optimisée. Par rapport à la trypsine seule, la digestion sur les billes avec le mélange Trypsin/Lys-C a permis d’identifier plus de protéines et de peptides et moins de clivages manqués (Figure 3B). De plus, 1 à 1,5 μg de protéase par 250 μL de billes magnétiques de streptavidine était optimal pour obtenir le plus grand nombre de protéines identifiées et le plus faible pourcentage de clivages manqués (figure 3C). Avec un rapport perles/protéines optimal, la même quantité de billes devrait capturer la même quantité de protéines biotinylées. Par conséquent, cette quantité optimisée de protéase peut être utilisée pour toutes les expériences qui enrichissent les protéines biotinylées en utilisant les mêmes billes magnétiques de streptavidine.

Les enzymes de marquage de proximité à base de peroxydase sont activées par incubation biotine-phénol et traitement bref H 2 O2(1 min). Cette étape est une source majeure de variation dans la protéomique d’étiquetage de proximité. Nous avons précédemment constaté que la normalisation de la carboxylase biotinylée endogène la plus abondante, la PCCA, peut réduire considérablement les variations expérimentales, permettant de comparer les données protéomiques de marquage de proximité entre différents lots expérimentaux (Figure 4)22. Pour les neurones endogènes LAMP1-APEX, la ligne parentale sans expression de sonde LAMP1-APEX a été utilisée comme groupe témoin. Les neurones témoins ont également été traités avec de la biotine-phénol etH2O2. La distribution des rapports protéiques de LAMP1-APEX par rapport au groupe témoin est illustrée à la figure 5A. Toutes les carboxylases biotinylées endogènes ont été enrichies par des billes enrobées de streptavidine, mais sont restées inchangées. Comme le montrent l’analyse GO-term et l’analyse du réseau protéique (Figure 5B,C), les protéines membranaires lysosomales stables et les interacteurs lysosomales transitoires liés au trafic endolysosomal et au transport ont été enrichis en protéomique LAMP1-APEX32,33,34.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail global pour la protéomique de marquage de proximité des lysosomes dans les neurones dérivés de la hiPSC. Abréviations : hiPSC = cellule souche pluripotente induite par l’homme; LAMP1 = protéine membranaire lysosomale associée 1; APEX = ascorbate peroxydase; DOX = doxycycline; BP = biotine-phénol; DCA = dosage des protéines compatibles avec les détergents; SA = streptavidine; LC-MS/MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem; PCCA = propionyl-CoA carboxylase, une protéine biotinylée endogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Imagerie microscopique des neurones dérivés de la CSPhi et de l’activité LAMP1-APEX. (A) Images de microscopie à fond clair de différents stades des CSPhi et des neurones dérivés des CSPhi. (B) Imagerie par fluorescence de l’activité de LAMP1-APEX dans le neurone. Les signaux biotinylés colorés contre la streptavidine colocalisent avec la coloration LAMP1 à l’extérieur du noyau (HOECHST). Barres d’échelle = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Abréviations : hiPSC = cellule souche pluripotente induite par l’homme; LAMP1 = protéine membranaire lysosomale associée 1; APEX = ascorbate peroxydase; SA = streptavidine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : L’optimisation du rapport perles/protéines entrantes et la digestion enzymatique des protéines peut améliorer l’identification des protéines et réduire les interférences. (A) Exemple d’essai de titrage des billes résultant d’un essai par transfert utilisant 50 μg de protéines d’entrée et différentes quantités de billes de streptavidine. (B) Le mélange trypsine/Lys-C a entraîné une meilleure identification protéine/peptide et moins de clivages manqués que la trypsine seule. (C) Optimisation de la quantité de trypsine/Lys-C pour la digestion sur billes. Cette figure a été modifiée à partir de Frankenfield et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : La normalisation des données protéomiques de marquage de proximité avec une carboxylase biotinylée endogène, PCCA, peut réduire les variations de quantification entre les réplicas biologiques. Cette figure a été modifiée à partir de Frankenfield et al.22. Abréviation : PCCA = propionyl-CoA carboxylase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Protéomique de proximité des lysosomes enrichie en protéines membranaires lysosomales et en protéines lysosomales interagissant dans les neurones. (A) Diagramme de dispersion des rapports d’abondance des protéines de LAMP1-APEX par rapport à l’absence de contrôle APEX montrant des protéines membranaires lysosomales enrichies et des protéines biotinylées endogènes inchangées. (B) Analyse GO-term des résultats protéomiques prouvant une composante cellulaire enrichie au lysosome. (C) Analyse du réseau de protéines STRING montrant que les protéines interagissent directement avec la protéine appât (LAMP1), les protéines de la membrane lysosomale et les interacteurs lysosomaux tels que les protéines de trafic membranaire. Cette figure a été modifiée à partir de Frankenfield et al.22. Abréviations : LAMP1 = protéine membranaire lysosomale associée 1; APEX = ascorbate peroxydase; GO = ontologie génétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Moyenne/Tampon Composant Protocole
Solution de revêtement à matrice membranaire basale (Matrigel) 1 % de matrice membranaire basale, 99 % de milieu DMEM/F12 1.1, 1.2
Solution de revêtement de vitronectine Concentration finale de 5 μg/mL dans le PBS 1.1
E8 milieu complet avec inhibiteur de ROCK 98 % E8 moyenne, 2 % E8 supplément, 10 μM Y-27632 ou 50 nM Chroman1 1.1
Milieu d’induction neuronale 97% DMEM/F12 avec HEPES, supplément de N2 à 1%, 1% d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1% de L-glutamine, 2 μg/mL de doxycycline et inhibiteur de ROCK (10 μM Y-27632 ou 5 nM Chroman 1) 1.2
Solution de revêtement PLO neuronal 0,1 mg/mL de poly-L-ornithine (PLO), acide borique 100 mM, tétraborate de sodium 25 mM, chlorure de sodium 75 mM, hydroxyde de sodium 1 M 1.3
Milieu neuronal milieu neuronal cortical à 98 %, supplément de B27 à 2 %, facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) à 10 ng/mL, facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF) à 10 ng/mL, NT-3 à 10 ng/mL, laminine à 0,2 μg/mL, 2 μg/mL de doxycycline 1.3
Tampon de trempe 10 mM d’azoture de sodium, 10 mM d’ascorbate de sodium, 5 mM de TROLOX dans du PBS 2.2
Tampon de lyse cellulaire 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), azoture de sodium 10 mM, 10 mM ascorbate de sodium, 5 mM TROLOX, cocktail inhibiteur de protéase 2.3
SCT-T 0,05 % Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) 4.2
Tampon A Tampon FDS de 2 % 5.2
Tampon B 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X 5.6
Tampon C 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5 % SDS, 0,5 % Triton-X 5.6
Tampon D 2 M d’urée, 50 mM de Tris-HCl 5.6

Tableau 1 : Compositions des milieux et des tampons utilisés dans ce protocole.

Problème Protocole Solution/Suggestion
La culture iPSC se décolle de l’assiette 1.1 Augmenter la concentration ou le temps d’enrobage de vitronectine.
Certaines CSPi ne se différenciaient pas en neurones 1.2 Augmenter le temps de traitement de la solution de décollement cellulaire pour dissocier complètement les CSPi lors de la différenciation d0.
Culture de neurones décollant de la plaque 1.3 Le lavage et le changement du support doivent être doux et provenant de la paroi latérale de la plaque.
Les protéines ne se dissolvent pas complètement après la précipitation de l’acétone 2.7 Réduire le temps de séchage de la pastille de protéines. Augmenter le volume du tampon de lyse et soniquer brièvement pour faciliter la dissolution.
Faibles signaux de coloration de la streptavidine 3 Augmenter le temps de traitement H 2 O 2 à2-3s et agiter la plaque pour une répartition uniforme.
Essai de titrage à faible signal des billes 4.2 Attendez que la membrane soit complètement séchée et ajoutez plus de surnageant au même endroit (peut répéter jusqu’à 3x) pour augmenter l’intensité du signal.
Les billes magnétiques ne s’enfoncent pas vers le rack magnétique 5 La mobilité des billes magnétiques diminue dans le tampon contenant des non-détergents. Une concentration d’urée plus élevée jusqu’à 4 M ou un détergent compatible LC-MS peut être utilisé dans le tampon de lavage D.
Perte de billes magnétiques pendant le lavage des perles 5 Augmenter le temps d’attente lorsque les tubes d’échantillon sont placés sur les billes magnétiques (1 min ou plus) avant de prélever du surnageant dans les tubes.
Pics de contamination chargés individuellement dans LC-MS 6 Le nettoyage des peptides n’est pas suffisant. Augmenter les volumes et les temps de lavage pendant le dessalage des peptides.
Essai peptidique à faible signal 7 Resuspendre les échantillons de peptides dans un volume inférieur pour augmenter la concentration de peptides.
Signaux de streptavidine accablants dans la LC-MS 8 Réduisez la quantité de billes de streptavidine. Si le pic de trypsine est également abondant, réduisez la quantité de trypsine.
Trop d’arrière-plans d’étiquetage non spécifiques 9 Le lavage des billes de streptavidine n’était pas suffisant. Retirez tout liquide résiduel lors de chaque étape de lavage. Augmentez le temps et le volume de lavage des perles.

Tableau 2 : Résolution des problèmes et solutions.

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Discussion

À l’aide de cette sonde LAMP1-APEX, les protéines sur et près de la membrane lysosomale sont biotinylées et enrichies. Compte tenu du diamètre typique du lysosome de 100 à 1 200 nm, cette méthode offre une excellente résolution intracellulaire avec un rayon de marquage de 10 à 20 nm. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur classique pour les lysosomes, servant d’excellente protéine appât pour le marquage APEX lysosomal au niveau de l’expression endogène. Cependant, il existe également des limites lors de l’utilisation de LAMP1 pour cibler les lysosomes, car LAMP1 est également présent dans les endosomes tardifs et les lysosomes non dégradants35. La plupart des marqueurs lysosomales sont également exprimés dans les endosomes tardifs, qui finissent par mûrir en lysosomes. Les protéines d’appât alternatives aux lysosomes ciblés sont LAMPTOR, LAMP2 et TMEM19235,36,37. Il est important de noter que les radicaux biotiniques réactifs ne pénètrent pas dans la membrane. Par conséquent, la plupart des protéines de lumière lysosomale seule ne sont pas capturées dans cette méthode protéomique LAMP1-APEX. Les protéines de la lumière lysosomale peuvent être obtenues par isolement lysosomal par la méthode traditionnelle de centrifugation par gradient ou immunopurificationlysosomale 4,38. Cependant, les protéines sur la membrane lysosomale peuvent être perturbées pendant l’isolement lysosomal et perdre l’information pour les interactions lysosomales transitoires et dynamiques. Par conséquent, le marquage de proximité lysosomale et l’isolement lysosomal peuvent être combinés pour obtenir un instantané complet des activités lysosomales à la fois à l’extérieur et à l’intérieur des lysosomes.

Pour minimiser la variabilité de la culture de neurones iPSC, la densité de placage neuronal doit être cohérente dans toutes les réplications biologiques et les groupes de comparaison. Les mêmes niveaux de maturation neuronale et de santé sont également essentiels pour cette raison. Lors de l’activation de l’APEX, l’addition de biotine-phénol et deH2O2aux cellules doit être effectuée par mélange préalable avec un milieu de culture chaud, puis par ajout du mélange aux cellules, suivi d’une agitation immédiate et douce pour assurer une distribution uniforme. L’utilisation deH2O2soulève également des inquiétudes quant au stress oxydatif et aux perturbations du microenvironnement dynamique de la cellule. Bien qu’aucun changement significatif n’ait été observé au niveau de l’abondance des protéines, davantage de peptides ont été modifiés par oxydation de la méthionine dans les neurones traités H 2 O2par rapport aux neurones témoins22. Par conséquent, un contrôle strict du temps d’activation H 2 O2(1 min) est essentiel pour minimiser le stress oxydatif et réduire la diffusion du nuage de biotine afin d’assurer un rayon de marquage spécifique entourant la protéine appât.

Pour les lignées cellulaires non polarisées telles que HEK et U2OS, les cellules peuvent être récoltées par granulation après marquage de proximité pour éliminer le surnageant contenant de la biotine libre. Cependant, les neurones doivent être récoltés en ajoutant directement un tampon de lyse cellulaire à la plaque et en grattant dans des tubes pour éviter les dommages aux neurites et la perte d’échantillon pendant la granulation. La présence de biotine libre peut saturer les billes de streptavidine. L’élimination complète de la biotine libre peut être obtenue par de multiples lavages et incubations avec tampon de trempe dans les neurones et / ou précipitation des protéines après lyse cellulaire. Comme différentes protéines d’appât ont des niveaux d’expression différents, un test par transfert de points doit être effectué pour chaque nouvelle sonde APEX. Une fois que le rapport perles/protéines optimal est déterminé, la quantité de protéines de départ et le volume des billes doivent être constants pour toutes les répétitions de la même sonde APEX. Lors de la comparaison de différentes sondes, telles que LAMP1-APEX et cytosolique-APEX, il est recommandé d’utiliser le même volume de billes, mais de varier la quantité de protéines de départ pour refléter les rapports billes / protéines optimaux pour différentes sondes APEX. Pour réduire davantage les variations expérimentales et augmenter le débit, le marquage isotopique stable par les acides aminés en culture cellulaire (SILAC) peut être effectué39. Le marquage isobare multiplexé peut également être utilisé pour marquer chimiquement des peptides après digestion des protéines via les marqueurs TMT / iTRAQ / DiLeu 20,40,41,42.

Le marquage de proximité a été largement appliqué pour capturer le microenvironnement cellulaire et moléculaire dans divers organismes43. Cependant, le marquage de proximité fait encore face à de nombreux défis techniques, tels que la contamination par des signaux de streptavidine, l’utilisation de peroxyde d’hydrogène pour l’activation enzymatique et la présence de carboxylases mitochondriales biotinylées endogènes. Par conséquent, les expériences protéomiques de marquage de proximité nécessitent une planification minutieuse et un contrôle de la qualité. Pour aider les chercheurs à résoudre leurs problèmes de proximité, nous fournissons un bref guide pour les problèmes courants et les solutions dans le tableau 2. Plus récemment, une méthode d’étiquetage de proximité clivable a été développée à l’aide de biotine25 clivable au thiol. Les protéines biotinylées peuvent donc être clivées des billes à l’aide d’un réactif réducteur tel que le PTCE sans avoir besoin de digestion sur les billes. Cette méthode de biotine clivable peut réduire considérablement les signaux d’interférence de la streptavidine, des carboxylases biotinylées endogènes et de la liaison non spécifique. Des efforts continus seront déployés pour appliquer cette méthode de biotine clivable à la protéomique LAMP1-APEX afin d’améliorer la spécificité et la précision de l’étiquetage. Les sondes de marquage de proximité peuvent également être conçues pour cibler d’autres compartiments subcellulaires44. La quantité et le type de protéines identifiées dépendent de la nature de la protéine appât, de son environnement intracellulaire et du niveau d’expression de la sonde de marquage de proximité. Cette méthode protéomique endogène LAMP1-APEX fournit un outil précieux pour étudier l’activité lysosomale dynamique dans les neurones humains. Le protocole détaillé et l’optimisation de la méthodologie sont également applicables à d’autres sondes de marquage de proximité et à la biotinylation chimique, ce qui constitue une ressource utile pour la communauté protéomique.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Cette étude est soutenue par la subvention des NIH (R01NS121608). A.M.F. reconnaît la bourse ARCS-Metro Washington Chapter et la bourse de dotation Bourbon F. Scribner. Nous remercions le laboratoire Michael Ward du National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) pour son soutien en biologie moléculaire et le développement de la technologie i3Neuron.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

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Neuroscience numéro 184 Marquage de proximité lysosome protéomique neurones dérivés de l’iPSC LAMP1 APEX interaction protéique membrane lysosomale
Caractérisation de l’interactome du lysosome neuronal avec protéomique de marquage de proximité
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Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L.… More

Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

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