Summary

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Abstract

Lysosomen communiceren vaak met een verscheidenheid aan biomoleculen om de afbraak en andere diverse cellulaire functies te bereiken. Lysosomen zijn van cruciaal belang voor de menselijke hersenfunctie, omdat neuronen postmitotisch zijn en sterk afhankelijk zijn van de autofagie-lysosoomroute om cellulaire homeostase te behouden. Ondanks de vooruitgang in het begrip van verschillende lysosomale functies, is het vastleggen van de zeer dynamische communicatie tussen lysosomen en andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met een hoge doorvoer. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de onlangs gepubliceerde endogene (knock-in) lysosoom proximity labeling proteomische methode in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide neuronen.

Zowel lysosomale membraaneiwitten als eiwitten rond lysosomen binnen een straal van 10-20 nm kunnen met vertrouwen worden geïdentificeerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd in levende menselijke neuronen. Elke stap van het protocol wordt in detail beschreven, d.w.z. hiPSC-neuroncultuur, nabijheidsetikettering, neuronoogst, fluorescentiemicroscopie, biotinylated eiwitverrijking, eiwitvertering, LC-MS-analyse en gegevensanalyse. Samenvattend biedt deze unieke endogene lysosomale proximity labeling proteomics-methode een high-throughput en robuust analytisch hulpmiddel om de zeer dynamische lysosomale activiteiten in levende menselijke neuronen te bestuderen.

Introduction

Lysosomen zijn katabole organellen die macromoleculen afbreken via de lysosomale-autofagieroute1. Naast afbraak zijn lysosomen betrokken bij diverse cellulaire functies zoals signaaltransductie, nutriëntdetectie en secretie 2,3,4. Verstoringen in de lysosomale functie zijn betrokken bij lysosomale stapelingsstoornissen, kanker, veroudering en neurodegeneratie 3,5,6,7. Voor postmitotische en sterk gepolariseerde neuronen spelen lysosomen een cruciale rol bij neuronale cellulaire homeostase, afgifte van neurotransmitters en transport over lange afstand langs de axonen 8,9,10,11. Het onderzoeken van lysosomen in menselijke neuronen is echter een uitdagende taak geweest. Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -afgeleide neurontechnologieën hebben de cultuur van levende menselijke neuronen mogelijk gemaakt die voorheen ontoegankelijk waren, waardoor de kloof tussen diermodellen en menselijke patiënten werd overbrugd om het menselijk brein te bestuderen12,13. Met name de geavanceerde i3Neuron-technologie integreert stabiel de neurogenine-2 transcriptiefactor in het iPSC-genoom onder een doxycycline-induceerbare promotor, waardoor iPSC’s in 2 weken differentiëren in pure corticale neuronen14,15.

Vanwege de zeer dynamische lysosomale activiteit is het vastleggen van lysosomale interacties met andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met hoge doorvoer. Proximity labeling technologie is zeer geschikt om deze dynamische interacties te bestuderen vanwege het vermogen om zowel stabiele als transiënte / zwakke eiwitinteracties vast te leggen met uitzonderlijke ruimtelijke specificiteit16,17. Gemanipuleerde peroxidase of biotineligase kan genetisch worden gefuseerd met het aaseiwit. Na activering worden zeer reactieve biotineradicalen geproduceerd om naburige eiwitten covalent te labelen, die vervolgens kunnen worden verrijkt met streptavidin-gecoate kralen voor downstream bottom-up proteomics via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms 17,18,19,20,21.

Een endogene lysosomale proximity labeling proteomics methode werd onlangs ontwikkeld om de dynamische lysosomale micro-omgeving vast te leggen in i3Neuronen22. Engineered ascorbate peroxidase (APEX2) werd ingeslagen op de C-terminus van het lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1) in iPSC’s, dat vervolgens kan worden gedifferentieerd in corticale neuronen. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke lysosomale marker23. LAMP1 komt ook tot expressie in late endosomen, die uitgroeien tot lysosomen; deze late endosoom-lysosomen en niet-afbrekende lysosomen worden in dit protocol allemaal lysosomen genoemd. Deze endogene LAMP1-APEX-sonde, uitgedrukt op fysiologisch niveau, kan LAMP1-mislokalisatie en overexpressieartefacten verminderen. Honderden lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interactoren kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met een uitstekende ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor lysosoomtoetredingsetikettering van proteomics in menselijke iPSC-afgeleide neuronen met verdere verbeteringen ten opzichte van de onlangs gepubliceerde methode22. De algemene workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. Het protocol omvat hiPSC-afgeleide neuroncultuur, nabijheidsetiketteringsactivering in neuronen, validatie van APEX-activiteit door fluorescentiemicroscopie, bepaling van een optimale streptavidin-kralen-tot-input-eiwitverhouding, verrijking van gebiotinyleerde eiwitten, eiwitvertering op kralen, peptide-ontzilting en kwantificering, LC-MS-analyse en proteomics-gegevensanalyse. Richtlijnen voor probleemoplossing en experimentele optimalisaties worden ook besproken om de kwaliteitscontrole en prestaties van proximity labeling te verbeteren.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de bioveiligheids- en ethische commissie van de George Washington University. De samenstellingen van media en buffers die in dit protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. De commerciële productinformatie die hier wordt gebruikt, wordt vermeld in de tabel met materialen. 1. Menselijke iPSC-afgeleide neuroncultuur Menselijke iPSC-cultuur en LAMP1-APEX probe integratie (7 dagen)<…

Representative Results

Deze lysosoom proximity labeling proteomics studie werd uitgevoerd in menselijke iPSC-afgeleide neuronen om de dynamische lysosomale micro-omgeving in situ in levende neuronen vast te leggen. Celmorfologieën van hiPSC’s en hiPSC-afgeleide neuronen op verschillende tijdstippen worden geïllustreerd in figuur 2A. Menselijke iPSC’s groeien in kolonies in E8-medium. Differentiatie wordt geïnitieerd door iPSC’s te platen in doxycycline-bevattend neuroninductiemedium. Neurietextententen…

Discussion

Met behulp van deze LAMP1-APEX-sonde worden eiwitten op en nabij het lysosomale membraan gebiotinyleerd en verrijkt. Gezien de typische lysosoomdiameter van 100-1.200 nm, biedt deze methode een uitstekende intracellulaire resolutie met een labelstraal van 10-20 nm. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke marker voor lysosomen, die dient als een uitstekend aaseiwit voor lysosomale APEX-etikettering op het endogene expressieniveau. Er zijn echter ook beperkingen bij het gebruik van LAMP1 om lysos…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie wordt ondersteund door de NIH-subsidie (R01NS121608). A.M.F. erkent de ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship en de Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. We bedanken het Michael Ward-lab van het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) voor de ondersteuning van moleculaire biologie en de ontwikkeling van de i3Neuron-technologie.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Play Video

Cite This Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

View Video