Summary
Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.
Abstract
Lysosomen communiceren vaak met een verscheidenheid aan biomoleculen om de afbraak en andere diverse cellulaire functies te bereiken. Lysosomen zijn van cruciaal belang voor de menselijke hersenfunctie, omdat neuronen postmitotisch zijn en sterk afhankelijk zijn van de autofagie-lysosoomroute om cellulaire homeostase te behouden. Ondanks de vooruitgang in het begrip van verschillende lysosomale functies, is het vastleggen van de zeer dynamische communicatie tussen lysosomen en andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met een hoge doorvoer. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de onlangs gepubliceerde endogene (knock-in) lysosoom proximity labeling proteomische methode in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide neuronen.
Zowel lysosomale membraaneiwitten als eiwitten rond lysosomen binnen een straal van 10-20 nm kunnen met vertrouwen worden geïdentificeerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd in levende menselijke neuronen. Elke stap van het protocol wordt in detail beschreven, d.w.z. hiPSC-neuroncultuur, nabijheidsetikettering, neuronoogst, fluorescentiemicroscopie, biotinylated eiwitverrijking, eiwitvertering, LC-MS-analyse en gegevensanalyse. Samenvattend biedt deze unieke endogene lysosomale proximity labeling proteomics-methode een high-throughput en robuust analytisch hulpmiddel om de zeer dynamische lysosomale activiteiten in levende menselijke neuronen te bestuderen.
Introduction
Lysosomen zijn katabole organellen die macromoleculen afbreken via de lysosomale-autofagieroute1. Naast afbraak zijn lysosomen betrokken bij diverse cellulaire functies zoals signaaltransductie, nutriëntdetectie en secretie 2,3,4. Verstoringen in de lysosomale functie zijn betrokken bij lysosomale stapelingsstoornissen, kanker, veroudering en neurodegeneratie 3,5,6,7. Voor postmitotische en sterk gepolariseerde neuronen spelen lysosomen een cruciale rol bij neuronale cellulaire homeostase, afgifte van neurotransmitters en transport over lange afstand langs de axonen 8,9,10,11. Het onderzoeken van lysosomen in menselijke neuronen is echter een uitdagende taak geweest. Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -afgeleide neurontechnologieën hebben de cultuur van levende menselijke neuronen mogelijk gemaakt die voorheen ontoegankelijk waren, waardoor de kloof tussen diermodellen en menselijke patiënten werd overbrugd om het menselijk brein te bestuderen12,13. Met name de geavanceerde i3Neuron-technologie integreert stabiel de neurogenine-2 transcriptiefactor in het iPSC-genoom onder een doxycycline-induceerbare promotor, waardoor iPSC's in 2 weken differentiëren in pure corticale neuronen14,15.
Vanwege de zeer dynamische lysosomale activiteit is het vastleggen van lysosomale interacties met andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met hoge doorvoer. Proximity labeling technologie is zeer geschikt om deze dynamische interacties te bestuderen vanwege het vermogen om zowel stabiele als transiënte / zwakke eiwitinteracties vast te leggen met uitzonderlijke ruimtelijke specificiteit16,17. Gemanipuleerde peroxidase of biotineligase kan genetisch worden gefuseerd met het aaseiwit. Na activering worden zeer reactieve biotineradicalen geproduceerd om naburige eiwitten covalent te labelen, die vervolgens kunnen worden verrijkt met streptavidin-gecoate kralen voor downstream bottom-up proteomics via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms 17,18,19,20,21.
Een endogene lysosomale proximity labeling proteomics methode werd onlangs ontwikkeld om de dynamische lysosomale micro-omgeving vast te leggen in i3Neuronen22. Engineered ascorbate peroxidase (APEX2) werd ingeslagen op de C-terminus van het lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1) in iPSC's, dat vervolgens kan worden gedifferentieerd in corticale neuronen. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke lysosomale marker23. LAMP1 komt ook tot expressie in late endosomen, die uitgroeien tot lysosomen; deze late endosoom-lysosomen en niet-afbrekende lysosomen worden in dit protocol allemaal lysosomen genoemd. Deze endogene LAMP1-APEX-sonde, uitgedrukt op fysiologisch niveau, kan LAMP1-mislokalisatie en overexpressieartefacten verminderen. Honderden lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interactoren kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met een uitstekende ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor lysosoomtoetredingsetikettering van proteomics in menselijke iPSC-afgeleide neuronen met verdere verbeteringen ten opzichte van de onlangs gepubliceerde methode22. De algemene workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. Het protocol omvat hiPSC-afgeleide neuroncultuur, nabijheidsetiketteringsactivering in neuronen, validatie van APEX-activiteit door fluorescentiemicroscopie, bepaling van een optimale streptavidin-kralen-tot-input-eiwitverhouding, verrijking van gebiotinyleerde eiwitten, eiwitvertering op kralen, peptide-ontzilting en kwantificering, LC-MS-analyse en proteomics-gegevensanalyse. Richtlijnen voor probleemoplossing en experimentele optimalisaties worden ook besproken om de kwaliteitscontrole en prestaties van proximity labeling te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de bioveiligheids- en ethische commissie van de George Washington University. De samenstellingen van media en buffers die in dit protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in tabel 1. De commerciële productinformatie die hier wordt gebruikt, wordt vermeld in de tabel met materialen.
1. Menselijke iPSC-afgeleide neuroncultuur
- Menselijke iPSC-cultuur en LAMP1-APEX probe integratie (7 dagen)
- Ontdooi matrigel stockoplossing in een ijsemmer bij 4 °C 's nachts, aliquot 500 μL van de oplossing in koude steriele buizen en bewaar de aliquots bij −80 °C. Bereid 50 ml coatingoplossing door 500 μL van de Matrigel-bouillon toe te voegen aan 49,5 ml koud DMEM/F12-medium.
OPMERKING: Houd de Matrigel koud en gebruik voorgechilleerde conische buizen en pipetpunten om polymerisatie te voorkomen. Coatingoplossing kan gedurende 2 weken bij 4 °C worden bewaard. - Bekleed een celkweekschaal van 10 cm met 4 ml coatingoplossing gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Vitronectin kan een alternatieve coatingoplossing zijn bij een concentratie van 5 μg/ml en een coating van 2 uur voor iPSC-kweek. Vitronectine (enkele eiwitcomponent) is duurder dan Matrigel, maar heeft minder batchvariaties en schonere achtergrondsignalen dan Matrigel, dat wordt geëxtraheerd uit muizentumoren met tal van extracellulaire matrixeiwitten. Niet-behandelde weefselkweekplaat is nodig voor vitronectine coating. Matrigel coating werkt voor zowel behandelde als niet-behandelde weefselkweekplaten. - Ontdooi en plaat 1-3 miljoen hiPSC's op elke gecoate schotel van 10 cm vooraf geladen met 8 ml Essential E8 compleet medium aangevuld met ROCK-remmer (eindconcentratie 10 μM Y-27632 of 50 nM Chroman1).
OPMERKING: Het toevoegen van ROCK-remmer (Y-27632 of Chroman1) aan het stamcelkweekmedium minimaliseert dissociatie-geïnduceerde apoptose na splitsing en cryogene conservering. Chroman1 is onlangs krachtiger gebleken dan Y-27632 bij het remmen van zowel ROCK1 als ROCK224. - Verander naar 10 ml E8 compleet medium zonder ROCK-remmer nadat de iPSC's kolonies hebben gevormd, meestal na 1-2 dagen. Behoud de iPSC-cultuur in E8 compleet medium en vervang het supernatant om de dag door vers medium.
- Integreer het proximity labeling enzyme, engineered ascorbate peroxidase (APEX2), in de C-terminus van het endogene LAMP1 gen door CRISPR genome engineering. Voor gedetailleerde stappen om een gemanipuleerde stabiele cellijn te genereren, raadpleegt u de eerder gepubliceerde methode (Frankenfield et al). 22.
- Ontdooi matrigel stockoplossing in een ijsemmer bij 4 °C 's nachts, aliquot 500 μL van de oplossing in koude steriele buizen en bewaar de aliquots bij −80 °C. Bereid 50 ml coatingoplossing door 500 μL van de Matrigel-bouillon toe te voegen aan 49,5 ml koud DMEM/F12-medium.
- Humane iPSC-neuron differentiatie (3 dagen)
- Bekleed een celkweekschaal van 10 cm 's nachts met 4 ml Matrigel-coatingoplossing in een incubator van 37 °C voordat u gaat differentiëren.
- Handhaaf hiPSC's tot ~70% samenvloeiing. Was de hiPSC's voorzichtig met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) 2x om dode cellen te verwijderen. Aspirateer de PBS en voeg 3 ml Accutase toe aan de schaal van 10 cm cellen. Schud de plaat voor een gelijkmatige verdeling en incubeer gedurende 8 minuten in een incubator van 37 °C.
- Voeg 2 ml PBS toe om de cellen van de plaat te wassen en op te tillen en verzamel alle celoplossing in een conische buis van 15 ml. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten. Plaat 2-4 × 106 hiPSC's op een matrigel-gecoate plaat vooraf geladen met 8 ml warm neuron inductiemedium (tabel 1). Verdeel de cellen gelijkmatig en plaats ze in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Neurondifferentiatie wordt aangedreven door een doxycycline-induceerbare transcriptiefactor, neurogenine-2 (NGN2), die overexpressie vertoonde in deze stabiele hiPSC-cellijn15. - Was hiPSC's voorzichtig met PBS op dag 1 van de differentiatie om dode celresten te verwijderen. Vervang door 10 ml warm inductiemedium zonder ROCK-remmer.
- Verander elke dag met warm inductiemedium zonder ROCK-remmer tot dag 3 van differentiatie.
OPMERKING: Neuronen zijn klaar om opnieuw te worden geplateerd in neuronaal medium.
- Plating neuronen en behoud van neuroncultuur (10 dagen)
- Bereid 0,1 mg/ml poly-l-ornithine(PLO)-coatingoplossing in boraatbuffer (tabel 1).
- Bekleed een celkweekschaal met de PLO-coatingoplossing in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht voorafgaand aan de beplating van dag 3 neuronen. Was de schaal drie keer met 4 ml steriel water en laat deze volledig aan de lucht drogen in de bioveiligheidskast.
- Dissociëer dag 3 neuronen van elke schaal van 10 cm met 3 ml Accutase en leg 8-10 miljoen cellen op elke 10 cm PLO-gecoate schotel vooraf geladen met warm corticale neuronmedium (tabel 1).
- Voer elke 2-3 dagen een halve medium verandering uit met warm neuron medium totdat de i3Neuronen rijping bereiken in 2 weken na differentiatie.
2. In situ proximity labeling en neuronlysis (2 h)
- Bereid 500 mM biotine-fenol (BP) stamoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar bij −20 °C. Verdun op de dag van de nabijheidsetikettering de BP-stamoplossing met een warm neuronmedium en behandel de neuronen in een eindconcentratie van 500 μM gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.
OPMERKING: Doxycycline wordt toegevoegd in het neuronmedium, dat de APEX-enzymexpressie activeert. Doxcycline moet ten minste 24 uur vóór het nabijheidsetiketteringsexperiment worden toegevoegd. - Start de etiketteringsreactie door H2O2 in een eindconcentratie van 1 mM toe te voegen aan de neuroncultuur en incubeer gedurende precies 1 min. Zuig het medium onmiddellijk aan en spoel 3 keer met blusbuffer (tabel 1).
OPMERKING: H2O2-oplossing moet vers worden gemaakt vóór de etiketteringsreactie. De H2O2-activering moet precies 1 minuut duren om experimentele variatie te verminderen en oxidatieve stress veroorzaakt door langdurige H2 O 2-behandelingte minimaliseren. - Kantel de plaat om alle resterende buffer aan te zuigen. Voeg ijskoude cellysebuffer (tabel 1) rechtstreeks toe aan de neuronplaat. Gebruik 100 μL cellysebuffer per 1 miljoen neuronen. Draai de plaat rond voor voldoende cellyse en plaats op ijs.
- Schraap de cellysaten in koude buisjes van 1,5 ml. Soniceer in een ijskoud waterbad met behulp van een badsononicator (>100 W) gedurende 15 minuten met afwisselend 40 s aan, 20 s uit cycli.
OPMERKING: Voldoende gelyseerde eiwitoplossing moet helder zijn zonder pellets of overmatige bubbels. Voldoende ultrasoonapparaat van cellysaat is cruciaal om nucleïnezuren af te schuiven en de kleverigheid van het cellysaat te verminderen om niet-specifieke binding in stroomafwaartse procedures te verminderen. Een sonde sonicator kan ook worden gebruikt om sterkere en snellere cellyse te bieden, maar het wassen van de sonde tussen monsters is vereist om kruisbesmetting en monsterverlies te minimaliseren. - Voeg koud aceton (−20 °C) toe aan het monster met een 4-voudig volume lysisbuffer. Vortex kort en incubeer bij −20 °C gedurende 3 uur.
- Centrifugeer bij 16.500 × g gedurende 10 minuten bij 2 °C. Verwijder het supernatant zonder de eiwitkorrel te verstoren. Was de pellet met 1 ml -20 °C aceton 2x en verwijder het supernatant na centrifugatie.
- Droog de eiwitkorrel met een vacuümconcentrator gedurende 1 min. Voeg cellysisbuffer toe om de pellet volledig op te lossen. Soniceer kort indien nodig. Bewaar de monsters bij −80 °C.
OPMERKING: Acetonprecipitatie kan residubiotine-fenol in het monster verwijderen, wat kan interfereren met downstream verrijking van gebiotinyleerde eiwitten.
3. Fluorescentiemicroscopie om APEX-lokalisatie en -activiteit te valideren (1,5 dag)
- Incubeer de i3neuronen die endogene LAMP1-APEX tot expressie brengen met 500 μM BP gedurende 30 minuten bij 37 °C. Activeer de etikettering met 1 mM H2O2 behandeling voor slechts 1 s om de diffusie van biotinewolk te beperken.
- Bevestig de cellen onmiddellijk met 4% paraformaldehyde in de blusbuffer en was 3x voorzichtig met PBS.
OPMERKING: Voor een schaal van 10 cm is 4-6 ml nodig voor een voldoende wasbeurt. - Blok en permeabiliseer de cellen met behulp van 3% ezelserum en 0,1% saponine in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Incubeer de cellen met primair anti-LAMP1-antilichaam (muis monoklonaal H3A4, 1:1.000) 's nachts bij 4 °C.
- Was de neuronen 3 x voorzichtig met PBS. Incubeer de neuronen met anti-muis AF561 secundair antilichaam (1:1.000) en Streptavidin-680 (1:1.000) gedurende 1 uur bij RT.
- Was 2x met PBS en incubeer met Hoechst of 4',4-diamidino-2-fenylindole (DAPI) nucleaire marker gedurende 10 min bij RT. Spoel de cellen 2x af met PBS.
- Visualiseer de vaste neuronen onder een fluorescentiemicroscoop. Observeer gebiotinyleerde eiwitten gekleurd met streptavidin en gecolokaliseerd met LAMP1-kleuring buiten de kern om de juiste locatie van APEX-activiteit te valideren.
4. Bepalen van de streptavidin kralen-tot-input eiwitverhouding (1,5 dag)
- Voer detergent-compatible protein assay (DCA) uit om de totale eiwitconcentraties in cellysaten te bepalen
- Los runderserumalbumine (BSA) eiwitstandaard op in de cellysebuffer in een concentratie van 4 mg/ml. Bereid een reeks standaardoplossingen voor BSA-eiwitten (0,2-2 mg/ml, 5 verdunningen) met behulp van de cellysebuffer.
- Breng 5 μL van elk eiwitmonster, BSA-eiwitstandaardoplossing en blanco cellysebuffer in drievoud over in elke put in een 96-wellsplaat.
- Voeg 2 μL reagens S per 1 ml reagens A toe om reagens A te krijgen'. Voeg 25 μL reagens A' toe aan elk putje. Voeg 200 μL reagens B toe aan elk putje. Mix en pop bubbels indien aanwezig.
- Incubeer die 96-well plaat op RT gedurende 15 minuten, lees de absorptie bij 750 nm in een microplaatlezer en kwantificeer de concentraties van eiwitmonsters op basis van de BSA-standaardcurve.
- Beads titratie dot blot assay (1,5 dag)
- Breng een reeks streptavidin magnetische kralen slurry (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) over naar PCR-stripbuizen. Zet de PCR stripbuizen op een magnetisch rek, was de kralen 3x met 100 μL 2% SDS buffer en verwijder de wasbuffer volledig terwijl je op het magnetische rek zit.
- Voeg 50 μg eiwitmonster toe aan elke buis. Voeg meer lysisbuffer toe tot een totaal volume van 80 μL. Sluit elke buis goed en draai een nacht op 4 °C.
- Centrifugeer de PCR-stripbuizen kort op een benchtop microcentrifuge. Plaats de PCR-stripbuizen gedurende 1 min op een magnetisch rek. Spot 2 μL supernatant uit elke buis op een droog nitrocellulosemembraan en laat het membraan volledig drogen.
OPMERKING: Als de signaalintensiteit laag is, kan meer dan 2 μL op het membraan worden waargenomen. Het volume kan worden verhoogd door meerdere keren op dezelfde plek te spotten nadat het membraan tussen elke keer aan de lucht is gedroogd. Een Bio-Dot Apparaat kan ook worden gebruikt. - Incubeer het membraan in blokkerende buffer (TBS) gedurende 1 uur. Incubeer het membraan in Streptavidin Alexa Fluor 680-geconjugeerd (1:1.000 in blokkerende buffer) gedurende 1 uur. Was vervolgens het membraan met TBS-T (tabel 1) 5x.
OPMERKING: Een alternatief voor de dot blot assay is western blotting met behulp van een streptavidin-antilichaam. - Meet het fluorescerende signaal van elke stip op het membraan onder een golflengte van 680 nm en genereer een scatter plot met fluorescerend signaal over het volume van kralen. Selecteer het optimale volume kralen dat nodig is voor 50 μg input-eiwitmonster op basis van waar het exponentiële verval van de curve eindigt .
OPMERKING: Fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt de overvloed aan gebiotinyleerde eiwitten in het supernatant, die zou moeten afnemen met toenemende hoeveelheden kralen.
5. Verrijken van gebiotinyleerde eiwitten en on-beads spijsvertering (3 dagen)
- Breng eiwitlysaatmonsters over van −80 °C en soniceer de monsters in 1,5 ml buizen gedurende 30 s in een badsoonapparaat om de oplossingen snel te ontdooien. Vortex en plaats de monsterbuizen op ijs.
- Breng 250 μL streptavidin (SA) magnetische kralen slurry over naar elke buis van 1,5 ml. Zet de tubes op een magnetisch rek, was de kralen 3x met 1 ml Wash Buffer A (2% SDS) en verwijder de restbuffer.
- Bereken op basis van de resultaten van de dot blot assay en DC-eiwittest de hoeveelheid eiwitmonster (μg) die nodig is voor 250 μL van de streptavidin magnetische kralen slurry.
OPMERKING: In deze endogene tot expressie gebrachte LAMP1-APEX-sonde is 5 μL kralen nodig voor 50 μg inputeiwit. Daarom wordt 2,5 mg totaal eiwit toegevoegd aan 250 μL kralen. Minder dan 250 μL SA-kralen mag worden gebruikt voor beperkt monstermateriaal. - Voeg de cellysebuffer toe aan de buis die het magnetische kraal-lysaatmengsel bevat tot een totaal volume van 1 ml en draai een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: Monsters van verschillende groepen of replica's moeten worden genormaliseerd tot dezelfde eiwitconcentratie, volume en hoeveelheid kralen om experimentele variaties te verminderen. - Draai alle buizen kort af op een benchtop microcentrifuge en plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetisch rek. Verwijder het supernatant terwijl u op het magnetische rek zit.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om elke keer 1 minuut te wachten nadat u de monsterbuizen op het magnetische rek hebt geplaatst. Dit kan het verlies van kralen minimaliseren als gevolg van de onzichtbare kleine hoeveelheid kralen die nog steeds naar de magneet in de oplossing bewegen. - Was de kralen 2x met 1 ml washbuffer A op RT (telkens 5 minuten rotatie). Herhaal het proces met elke wasbuffer 2x achter elkaar bij 4 °C. (Buffer B, Buffer C en Buffer D; Tabel 1).
OPMERKING: Een hoge concentratie SDS-oplossing kan neerslaan bij koude temperaturen. De eerste wasbeurt moet bij RT worden uitgevoerd. - Plaats de buizen op het magnetische rek. Was de kralen 2x met Buffer D om resterend wasmiddel volledig te verwijderen. Resuspendeer de kralen in 100 μL van 50 mM Tris buffer en voeg 5 mM TCEP (eindconcentratie) toe om gedurende 30 minuten bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde mixer te incuberen, schuddend bij 1.200 tpm.
- Voeg 15 mM joodacetamide (IAZ, eindconcentratie) toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde mixer, schuddend bij 1.200 tpm in het donker (mixerdop aan).
OPMERKING: IAA is lichtgevoelig en moet 5 minuten voor deze stap vers worden gemaakt. - Voeg 5 mM TCEP (eindconcentratie) toe om overtollig IAZ te doven. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in een temperatuurgestuurde mixer met schudden bij 1.200 tpm (mixerdop uit).
- Centrifugeer de monsterbuizen kort en plaats het gedurende 1 minuut op een magnetisch rek om het supernatant te verwijderen. Voeg 200 μL 5 mM TCEP toe in 50 mM Tris buffer om de kralen te resuspenderen. Voeg 1 μg Trypsin/Lys-C-mengsel toe aan het monster en incubeer gedurende 14 uur bij 37 °C in een temperatuurgecontroleerde menger, schuddend bij 1.200 tpm.
- Voeg een extra 0,2 μg Trypsin/Lys-C mix toe en verteer gedurende 3 uur.
- Draai de monsterbuizen kort naar beneden en plaats de buizen gedurende 1 minuut op een magnetisch rek. Breng het peptide-supernatant over om de buizen schoon te maken terwijl u op een magnetisch rek zit. Was de kralen met 50 μL van 50 mM Tris buffer (schudden gedurende 5 min) en combineer de peptide supernatanten.
- Voeg 30 μL 10% trifluorazijnzuur (TFA) toe aan de buis die peptide-supernatant bevat om een pH <3 te krijgen.
6. Peptide ontzilting en fractionering (2 h)
- Maak de omgekeerde fase vaste fase extractieplaat (alleen de putjes voor gebruik) nat met 200 μL HPLC-methanol (MeOH) 3x op het vacuümspruitstuk. Voeg 200 μL van 1% TFA toe aan HPLC-water 3x om de plaat in evenwicht te brengen.
- Laad de peptidemonsters in de plaat en schakel het vacuüm langzaam in voor een stroomsnelheid lager dan 3 druppels / s om monsterverlies te minimaliseren.
- Was de extractieplaat 3x met 200 μL van 1% TFA. Was de extractieplaat opnieuw met 200 μL van 1% TFA met 2% MeOH (v/v). Houd de stroomsnelheid lager dan 3 druppels/s.
- Vervang de opvangplaat door een 96-wells verzamelplaat. Als er geen fractionering nodig is, elueert u de peptidemonsters 3x met 100 μL 1% TFA met 80% MeOH en combineert u in een nieuwe monsterbuis. Droog de peptidemonsters in een vacuümconcentrator zonder warmte.
OPMERKING: Als fractionering gewenst is, kunnen peptidemonsters vervolgens in 4 fracties worden geëlueerd met behulp van 200 μL van 1% TFA met respectievelijk 15%, 35%, 50% en 90% MeOH in een andere verzamelplaat.
7. Colorimetrische peptidekwantificeringstest (optioneel) (1 uur)
- Resuspend peptidemonsters in 50 μL water van LC-MS-kwaliteit en neem 20 μL aliquots om de peptide-assay uit te voeren.
OPMERKING: Deze stap verbruikt een grote hoeveelheid peptidemonster, maar kan een nauwkeurige kwantificering van de peptideconcentratie bieden vóór LC-MS-analyse. Dit wordt meestal slechts één keer per monstertype uitgevoerd om te testen voordat het op grote schaal wordt voorbereid. - Bereid seriële verdunningen van de peptidestandaardoplossingen (geleverd in de colorimetrische testkit) in het water van LC-MS-kwaliteit. Bereid het werkreagens door 50% reagens A, 48% reagens B en 2% reagens C te mengen.
- Breng 20 μL van elke peptidestandaardoplossing (drie replicaties) en het onbekende peptidemonster over in een 96-well microplaat. Voeg 180 μL van het werkreagens toe aan elk putje, meng goed en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT.
- Lees de absorptie bij 480 nm in een microplaatlezer en kwantificeer de concentraties van peptidemonsters op basis van de peptidestandaardcurve.
8. LC-MS analyse
- Resuspendeer de peptidemonsters in LC Buffer A (2% acetonitril en 0,1% mierenzuur, LC-MS-kwaliteit). Centrifugeer bij 16.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele deeltjes te verwijderen.
- Breng het supernatant over in de injectieflacons met LC-MS. Analyseer de monsters met behulp van een nanoLC-MS-instrument.
OPMERKING: Gedetailleerde LC-MS/MS-parameters zijn instrumentafhankelijk en zijn eerder beschreven 22,25,26. - Genereer een aangepaste LC-MS-uitsluitingslijst met een reeks retentietijden voor zeer overvloedige peptidepieken van verontreinigingen, zoals streptavidin en trypsine met een massanauwkeurigheid van 5 ppm22 (bijv. gemeenschappelijke streptavidinpeptidepieken zijn m / z 402.5435 [lading 3], m / z 603.3117 [lading 2], m / z 654.9733 [lading 3], m / z 678.6812 [lading 3], m / z 1017.5182 [lading 2], enz.; veel voorkomende trypsinepeptidepieken zijn m/z 421.7584 [lading 2], m/z 523.2855 [lading 2], en m/z 737.7062 [lading 3]).
9. Proteomics data-analyse
- Analyseer de ruwe LC-MS-gegevens met proteomics-gegevensanalysesoftware zoals Proteome Discoverer, MaxQuant27 of MS-Fragger28. Inclusief twee FASTA-bibliotheken voor data-analyse: 1) een Referentiedatabase van Swissprot Homo Sapiens ; 2) een nieuw gegenereerde universele verontreiniging FASTA-bibliotheek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), waarvan is bewezen dat het de identificatie van proteomics verbetert en valse ontdekkingen vermindert29.
- Stel de proteomics-gegevensanalyseparameters in met een 1% false discovery rate (FDR) cutoff voor eiwit- en peptide spectrale matching (PSM) -identificaties. Selecteer trypsinevertering met maximaal drie gemiste splitsingen, een vaste modificatie van cysteïnecarbiddomethylatie en een variabele modificatie van methionine-oxidatie en eiwit N-terminale acetylering. Gebruik peptide MS1 piekintensiteiten voor labelvrije kwantificering. Normaliseer de peptide-intensiteiten naar het endogene gebiotinyleerde carboxylase, propionyl-CoA carboxylase (PCCA), om variaties in nabijheidsetikettering te verminderen, zoals eerder beschreven22.
OPMERKING: PCCA-normalisatie kan worden geselecteerd in Proteome Discoverer-software door een FASTA-bestand met PCCA-eiwitsequentie op te nemen. Als alternatief kan PCCA-normalisatie worden uitgevoerd in de downstream data-analyse. - Exporteer resultaten op eiwitniveau van de proteomics-software. Verwijder contaminanteiwitten voorafgaand aan statistische analyse29. Verwijder eiwitten met slechts 1 PSM of geen kwantificeringsresultaat. Voer eiwitgenontologie (GO)-termanalyse uit met Enrichr30 en eiwitnetwerkanalyse met STRING31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze lysosoom proximity labeling proteomics studie werd uitgevoerd in menselijke iPSC-afgeleide neuronen om de dynamische lysosomale micro-omgeving in situ in levende neuronen vast te leggen. Celmorfologieën van hiPSC's en hiPSC-afgeleide neuronen op verschillende tijdstippen worden geïllustreerd in figuur 2A. Menselijke iPSC's groeien in kolonies in E8-medium. Differentiatie wordt geïnitieerd door iPSC's te platen in doxycycline-bevattend neuroninductiemedium. Neurietextententen worden elke dag zichtbaarder tijdens de 3-daagse differentiatie. Na het overschakelen naar PLO-gecoate platen in neuronmedium, vormen de neurieten een netwerk tussen neuronen en worden axonale extensies zichtbaarder naarmate de neuronen binnen 2 weken rijping bereiken. In i3Neuronen wordt de lokalisatie van de APEX-sonde gevalideerd door fluorescentiemicroscopie na snelle APEX-activering. Gebiotinyleerde eiwitten worden gekleurd met behulp van streptavidin (SA) antilichaam, en lysosomen worden gekleurd met behulp van anti-LAMP1 antilichaam. De samengevoegde afbeelding valideert de juiste lokalisatie van LAMP1-APEX naar het aaseiwit (figuur 2B).
De kraaltitratietest is cruciaal om de optimale verhouding tussen kralen en eiwitten te bepalen, zodat de hoeveelheid streptavidinkorrels voldoende is om alle gebiotinyleerde eiwitten te verrijken, maar niet zo buitensporig om ernstige streptavidinbesmetting bij LC-MS te veroorzaken. Het optimale volume van de kralen dat nodig is voor 50 μg input-eiwitmonster wordt geselecteerd op basis van waar het exponentiële verval van de curve eindigt (figuur 3A) Zoals weergegeven in figuur 3A, namen dot-blot-signalen van het kralen-eiwitincubatie-supernatant af naarmate meer gebiotinyleerde eiwitten werden gevangen met verhoogde hoeveelheden van de streptavidin-kralen. Voor endogene LAMP1-APEX-monsters was 5 μL streptavidin-kralen optimaal voor 50 μg input-eiwit (gemarkeerd in figuur 3A). Na verrijking is de hoeveelheid eiwit die door de streptavidin-kralen wordt gevangen onbekend. Overtollig proteolytisch enzym (trypsine) kan de enzymautodigestie verhogen, met overvloedige trypsinepeptidepieken in LC-MS. Overmatige trypsine kan ook meer streptavidinpeptiden in de monsters verteren. Daarom moet de hoeveelheid protease die nodig is voor de spijsvertering van on-beads worden geoptimaliseerd. In vergelijking met trypsine alleen, resulteerde de vertering van on-beads met Trypsin / Lys-C-mix in de identificatie van meer eiwitten en peptiden en minder gemiste splitsingen (figuur 3B). Bovendien was 1-1,5 μg protease per 250 μL streptavidin magnetische kralen optimaal om het hoogste aantal geïdentificeerde eiwitten en het laagste percentage gemiste splitsingen te verkrijgen (figuur 3C). Met een optimale verhouding tussen kralen en eiwitten moet dezelfde hoeveelheid kralen dezelfde hoeveelheid gebiotinyleerde eiwitten vastleggen. Daarom kan deze geoptimaliseerde proteasehoeveelheid worden gebruikt voor alle experimenten die gebiotinyleerde eiwitten verrijken met behulp van dezelfde streptavidin magnetische kralen.
Op peroxidase gebaseerde proximity labeling enzymen worden geactiveerd door biotine-fenol incubatie en korte H2O2 behandeling (1 min). Deze stap is een belangrijke bron van variatie in proximity-labeling proteomics. We ontdekten eerder dat normalisatie naar de meest voorkomende, endogene gebiotinyleerde carboxylase, PCCA, experimentele variaties aanzienlijk kan verminderen, waardoor de vergelijking van proximity labeling proteomics-gegevens over verschillende experimentele batches mogelijk is (figuur 4) 22. Voor endogene LAMP1-APEX neuronen werd de ouderlijke lijn zonder LAMP1-APEX probe expressie gebruikt als controlegroep. Controleneuronen werden ook behandeld met biotinefenol en H2O2. De verdeling van eiwitverhoudingen van LAMP1-APEX versus de controlegroep wordt geïllustreerd in figuur 5A. Alle endogene gebiotinyleerde carboxylasen werden verrijkt met gestreepte kralen, maar bleven ongewijzigd. Zoals aangetoond in de GO-term analyse en eiwitnetwerkanalyse (figuur 5B, C), werden zowel stabiele lysosomale membraaneiwitten als voorbijgaande lysosomale interactoren gerelateerd aan endolysosomale handel en transport verrijkt in LAMP1-APEX proteomics 32,33,34.
Figuur 1: Algemene workflow voor lysosoom nabijheid labeling proteomics in hiPSC-afgeleide neuronen. Afkortingen: hiPSC = human induced pluripotent stamcel; LAMP1 = lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1; APEX = ascorbaatperoxidase; dox = doxycycline; BP = biotine-fenol; DCA = detergent-compatibele eiwittest; SA = streptavidin; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie; PCCA = propionyl-CoA carboxylase, een endogene gebiotinyleerd eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microscopische beeldvorming van hiPSC-afgeleide neuronen en LAMP1-APEX-activiteit. (A) Brightfield-microscopiebeelden van verschillende stadia van hiPSC's en hiPSC-afgeleide neuronen. (B) Fluorescentie beeldvorming van LAMP1-APEX activiteit in het neuron. Gebiotinyleerde signalen gekleurd tegen streptavidin colocaliseren met LAMP1-kleuring buiten de kern (HOECHST). Schaalstaven = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Afkortingen: hiPSC = human induced pluripotent stamcel; LAMP1 = lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1; APEX = ascorbaatperoxidase; SA = streptavidin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Optimalisatie van de verhouding tussen kralen en inputeiwitten en enzymatische eiwitvertering kan de eiwitidentificatie verbeteren en interferentie verminderen. (A) Voorbeeld van kralentitratietestresultaten van dot-blot-assay met behulp van 50 μg inputeiwit en verschillende hoeveelheden streptavidin-kralen. (B) Trypsine/Lys-C mix resulteerde in een betere identificatie van eiwitten/peptiden en minder gemiste splitsingen dan trypsine alleen. (C) Optimalisatie van de hoeveelheid Trypsine/Lys-C voor de vertering van on-beads. Dit cijfer is aangepast van Frankenfield et al.22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Normalisatie van proximity labeling proteomics data naar een endogeen gebiotinyleerd carboxylase, PCCA, kan kwantificeringsvariaties tussen biologische replicaties verminderen. Dit cijfer is aangepast van Frankenfield et al.22. Afkorting: PCCA = propionyl-CoA carboxylase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Lysosome proximity labeling proteomics verrijkte lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interagerende eiwitten in neuronen. (A) Scatter plot van eiwit abundantieverhoudingen van LAMP1-APEX versus geen APEX-controle met verrijkte lysosomale membraaneiwitten en onveranderde endogene biotinylerende eiwitten. (B) GO-term analyse van proteomics resultaten die een verrijkte cellulaire component aan het lysosoom aantonen. (C) STRING-eiwitnetwerkanalyse waaruit blijkt dat eiwitten rechtstreeks interageren met het aaseiwit (LAMP1), lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interactoren zoals membraanhandeleiwitten. Dit cijfer is aangepast van Frankenfield et al.22. Afkortingen: LAMP1 = lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1; APEX = ascorbaatperoxidase; GO = genontologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Medium/Buffer | Bestanddeel | Protocol | ||
| Keldermembraanmatrix (Matrigel) coatingoplossing | 1% keldermembraanmatrixvoorraad, 99% DMEM/F12 medium | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronectin coating oplossing | 5 μg/ml eindconcentratie in PBS | 1.1 | ||
| E8 compleet medium met ROCK-remmer | 98% E8 medium, 2% E8 supplement, 10 μM Y-27632 of 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Neuron Inductie medium | 97% DMEM/F12 met HEPES, 1% N2 supplement, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-glutamine, 2 μg/ml doxycycline en ROCK-remmer (10 μM Y-27632 of 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO coating oplossing | 0,1 mg/ml poly-L-ornithine (PLO), 100 mM boorzuur, 25 mM natriumtetraboraat, 75 mM natriumchloride, 1 m natriumhydroxide | 1.3 | ||
| Neuron medium | 98% corticale neuron medium, 2% B27 supplement, 10 ng / ml hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF), 10 ng / ml glial-afgeleide neurotrofe factor (GDNF), 10 ng / ml NT-3, 0,2 μg / ml laminine, 2 μg / ml doxycycline | 1.3 | ||
| Blusbuffer | 10 mM natriumazide, 10 mM natriumascorbaat, 5 mM TROLOX in PBS | 2.2 | ||
| Cellysebuffer | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride (TCEP), 10 mM natriumazide, 10 mM natriumascorbaat, 5 mM TROLOX, proteaseremmer cocktail | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Buffer A | 2% SDS-buffer | 5.2 | ||
| Buffer B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer D | 2 M Ureum, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabel 1: Samenstellingen van media en buffers die in dit protocol worden gebruikt.
| Probleem | Protocol | Oplossing/Suggestie | ||||
| iPSC-cultuur bladdert van het bord | 1.1 | Verhoog de concentratie of tijd van de vitronectinecoating. | ||||
| Sommige iPSC's maakten geen onderscheid in neuronen | 1.2 | Verhoog de behandelingstijd van de cellosieoplossing om iPSC's volledig te dissociëren tijdens d0 differentiatie. | ||||
| Neuroncultuur bladdert van het bord | 1.3 | Het wassen en verwisselen van het medium moet zacht zijn en vanaf de zijwand van de plaat. | ||||
| Eiwitten lossen niet volledig op na acetonprecipitatie | 2.7 | Verminder de droogtijd van de eiwitpellet. Verhoog het volume van de lysisbuffer en soniceer kort om te helpen oplossen. | ||||
| Zwakke streptavidin kleuringssignalen | 3 | Verhoogdebehandelingstijd van H2 O 2 tot 2-3 s en draai de plaat voor een gelijkmatige verdeling. | ||||
| Laag signaal van kralentitratietest | 4.2 | Wacht tot het membraan volledig is gedroogd en voeg meer supernatant toe aan dezelfde plek (kan tot 3x worden herhaald) om de signaalintensiteit te verbeteren. | ||||
| Magnetische kralen die niet naar magnetisch rek worden gepellet | 5 | De beweeglijkheid van magnetische kralen neemt af in niet-detergent bevattende buffer. Hogere ureumconcentraties tot 4 M of LC-MS-compatibel reinigingsmiddel kunnen worden gebruikt in wasbuffer D. | ||||
| Magnetische kralen verliezen tijdens kralen wassen | 5 | Verhoog de wachttijd wanneer monsterbuizen op de magnetische kralen worden geplaatst (1 min of langer) voordat u supernatant uit de buizen neemt. | ||||
| Afzonderlijk geladen besmettingspieken in LC-MS | 6 | Peptide opschonen niet voldoende. Verhoog de wasvolumes en -tijden tijdens het ontzouten van peptiden. | ||||
| Peptide assay laag signaal | 7 | Resuspend peptide monsters in lager volume om de peptide concentratie te verhogen. | ||||
| Overweldigende streptavidin-signalen in LC-MS | 8 | Verminder de hoeveelheid streptavidin kralen. Als trypsine piek is ook overvloedig, verminder trypsine hoeveelheid. | ||||
| Te veel niet-specifieke etiketteringsachtergrond | 9 | Streptavidin kralen wassen was niet voldoende. Verwijder alle resterende vloeistof tijdens elke wasstap. Verhoog de tijd en het volume voor het wassen van kralen. | ||||
Tabel 2: Problemen en oplossingen oplossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van deze LAMP1-APEX-sonde worden eiwitten op en nabij het lysosomale membraan gebiotinyleerd en verrijkt. Gezien de typische lysosoomdiameter van 100-1.200 nm, biedt deze methode een uitstekende intracellulaire resolutie met een labelstraal van 10-20 nm. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke marker voor lysosomen, die dient als een uitstekend aaseiwit voor lysosomale APEX-etikettering op het endogene expressieniveau. Er zijn echter ook beperkingen bij het gebruik van LAMP1 om lysosomen te targeten, aangezien LAMP1 ook aanwezig is in late endosomen en niet-afbrekende lysosomen35. De meeste lysosomale markers komen ook tot expressie in late endosomen, die uiteindelijk rijpen tot lysosomen. Alternatieve aaseiwitten om lysosomen aan te vallen zijn LAMPTOR, LAMP2 en TMEM192 35,36,37. Het is belangrijk op te merken dat reactieve biotineradicalen het membraan niet binnendringen. Daarom worden de meeste lysosomale lumen-only eiwitten niet gevangen in deze LAMP1-APEX proteomics methode. Lysosomale lumeneiwitten kunnen worden verkregen door lysosomale isolatie via de traditionele gradiëntcentrifugatiemethode of lysosomale immunozuivering 4,38. Eiwitten op het lysosomale membraan kunnen echter worden verstoord tijdens lysosomale isolatie en verliezen de informatie voor voorbijgaande en dynamische lysosomale interacties. Daarom kunnen lysosomale nabijheidsetikettering en lysosomale isolatie worden gecombineerd om een volledige momentopname van lysosomale activiteiten zowel buiten als binnen lysosomen te verkrijgen.
Om de variabiliteit van iPSC-neuroncultuur te minimaliseren, moet de neuronplatingdichtheid consistent zijn in alle biologische replicaties en vergelijkingsgroepen. Dezelfde niveaus van neuronale rijping en gezondheid zijn om deze reden ook van cruciaal belang. Tijdens APEX-activering moet de toevoeging van biotinefenol en H2O2 aan de cellen worden uitgevoerd door vooraf te mengen met een warm kweekmedium en vervolgens het mengsel aan de cellen toe te voegen, gevolgd door onmiddellijk, zacht schudden om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Het gebruik van H2O2 roept ook zorgen op over oxidatieve stress en verstoringen in de dynamische micro-omgeving van de cel. Hoewel er geen significante veranderingen werden gevonden op het eiwitrijkdomsniveau, werden meer peptiden gemodificeerd met methionine-oxidatie in de H2O2-behandelde versus controleneuronen22. Daarom is strikte controle van de H2O 2-activeringstijd (1 min) van cruciaal belang om oxidatieve stress te minimaliseren en de diffusie van biotinewolk te verminderen om een specifieke labelstraal rond het aaseiwit te garanderen.
Voor niet-gepolariseerde cellijnen zoals HEK en U2OS kunnen cellen worden geoogst door pelleting na nabijheidsetikettering om het supernatant met vrij biotine te verwijderen. Neuronen moeten echter worden geoogst door direct cellysisbuffer aan de plaat toe te voegen en in buizen te schrapen om neurietschade en monsterverlies tijdens pelleting te voorkomen. De aanwezigheid van vrije biotine kan de streptavidin-kralen verzadigen. De volledige verwijdering van vrij biotine kan worden bereikt door meerdere wasbeurten en incubatie met quenchbuffer in neuronen en / of eiwitprecipitatie na cellyse. Omdat verschillende aaseiwitten verschillende expressieniveaus hebben, moet voor elke nieuwe APEX-sonde een dot blot-test worden uitgevoerd. Zodra de optimale verhouding tussen kralen en eiwitten is bepaald, moet de hoeveelheid uitgangseiwit en het volume van de kralen consistent zijn voor alle replicaties voor dezelfde APEX-sonde. Bij het vergelijken van verschillende sondes, zoals LAMP1-APEX versus cytosolzuur-APEX, wordt aanbevolen om hetzelfde volume kralen te gebruiken, maar de hoeveelheid starteiwit te variëren om de optimale kralen / eiwitverhoudingen voor verschillende APEX-sondes weer te geven. Om experimentele variaties verder te verminderen en de doorvoer te verhogen, kan stabiele isotoopetikettering door aminozuren in celkweek (SILAC) worden uitgevoerd39. Multiplexed isoobaric labeling kan ook worden gebruikt om peptiden na eiwitvertering chemisch te labelen via TMT / iTRAQ / DiLeu-tags 20,40,41,42.
Proximity labeling is op grote schaal toegepast om de cellulaire en moleculaire micro-omgeving in verschillende organismen vast te leggen43. Nabijheidsetikettering wordt echter nog steeds geconfronteerd met veel technische uitdagingen, zoals verontreiniging door streptavidin-signalen, het gebruik van waterstofperoxide voor enzymactivering en de aanwezigheid van endogene gebiotinyleerde mitochondriale carboxylasen. Daarom vereisen proteomische experimenten met nabijheidsetikettering een zorgvuldige planning en kwaliteitscontrole. Om onderzoekers te helpen bij het oplossen van problemen met hun nabijheidsetiketteringsexperiment, bieden we een korte handleiding voor veelvoorkomende problemen en oplossingen in tabel 2. Onlangs werd een cleavable proximity labeling methode ontwikkeld met behulp van thiol-cleavable biotine25. Biotinylhoudende eiwitten kunnen daarom worden afgesplitst van kralen met behulp van een reducerend reagens zoals TCEP zonder de noodzaak van on-beads spijsvertering. Deze splijtbare biotinemethode kan interferentiesignalen van streptavidin, endogene gebiotinyleerde carboxylasen en niet-specifieke binding drastisch verminderen. Voortdurende inspanningen zullen deze splijtbare biotinemethode toepassen op LAMP1-APEX proteomics om de specificiteit en nauwkeurigheid van de etikettering te verbeteren. Proximity labeling probes kunnen ook worden ontworpen om andere subcellulaire compartimenten te richten44. De hoeveelheid en het type geïdentificeerde eiwitten zijn afhankelijk van de aard van het aaseiwit, de intracellulaire omgeving en het expressieniveau van de proximity labeling-sonde. Deze endogene LAMP1-APEX proteomics methode biedt een waardevol hulpmiddel om de dynamische lysosomale activiteit in menselijke neuronen te bestuderen. Het gedetailleerde protocol en de methodologie-optimalisatie zijn ook van toepassing op andere nabijheidsetiketteringsondes en chemische biotinylering, die dienen als een nuttige bron voor de proteomics-gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie wordt ondersteund door de NIH-subsidie (R01NS121608). A.M.F. erkent de ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship en de Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. We bedanken het Michael Ward-lab van het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) voor de ondersteuning van moleculaire biologie en de ontwikkeling van de i3Neuron-technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R.
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P.
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M.
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
