Summary

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

Abstract

ליזוזומים מתקשרים לעתים קרובות עם מגוון של ביומולקולות כדי להשיג את הפירוק ותפקודים תאיים מגוונים אחרים. ליזוזומים הם קריטיים לתפקוד המוח האנושי, מכיוון שתאי עצב הם פוסט-מיטוטיים ומסתמכים במידה רבה על מסלול האוטופגיה-ליזוזום כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי. למרות ההתקדמות בהבנה של פונקציות ליזוזומליות שונות, לכידת התקשורת הדינמית ביותר בין ליזוזומים לרכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק עבור השיטה האנדוגנית (knock-in) ליזוזום קרבה תיוג פרוטאומית שפורסמה לאחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC).

הן חלבוני ממברנה ליזוזומליים והן חלבונים המקיפים ליזוזומים ברדיוס של 10-20 ננומטר ניתנים לזיהוי בטוח ולכימות מדויק בנוירונים אנושיים חיים. כל שלב בפרוטוקול מתואר בפירוט, כלומר, תרבית נוירונים hiPSC, תיוג קרבה, קציר נוירונים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, העשרת חלבונים ביוטינילציה, עיכול חלבונים, ניתוח LC-MS וניתוח נתונים. לסיכום, שיטה ייחודית זו לתיוג קרבה ליזוסומלית אנדוגנית מספקת תפוקה גבוהה וכלי אנליטי חזק לחקר הפעילויות הליזוזומיות הדינמיות ביותר בנוירונים אנושיים חיים.

Introduction

ליזוזומים הם אברונים קטבוליים המפרקים מקרומולקולות דרך המסלול הליזוזומלי-אוטופגיה1. מלבד השפלה, ליזוזומים מעורבים במגוון תפקודים תאיים כגון התמרת איתותים, חישת חומרים מזינים והפרשת 2,3,4. הפרעות בתפקוד הליזוזומלי היו מעורבות בהפרעות אחסון ליזוזומליות, סרטן, הזדקנות וניוון עצבי 3,5,6,7. עבור נוירונים פוסטמיטוטיים ומקוטבים מאוד, ליזוזומים ממלאים תפקידים קריטיים בהומאוסטזיס תאי עצבי, שחרור מוליכים עצביים והובלה למרחקים ארוכים לאורך האקסונים 8,9,10,11. עם זאת, חקירת ליזוזומים בתאי עצב אנושיים הייתה משימה מאתגרת. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה לתרבית של נוירונים אנושיים חיים שלא היו נגישים בעבר, וגישור על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מטופלים אנושיים לחקור את המוח האנושי12,13. במיוחד, טכנולוגיית i3Neuron המתקדמת משלבת ביציבות את גורם השעתוק של נוירוגנין-2 לתוך הגנום של iPSC תחת מקדם דוקסיציקלין-אינדוקלין, מה שמניע iPSCs להתמיין לנוירונים קליפתיים טהורים תוך שבועיים14,15.

בשל הפעילות הליזוזומלית הדינמית ביותר, לכידת אינטראקציות ליזוזומליות עם רכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. טכנולוגיית תיוג קרבה מתאימה היטב לחקר אינטראקציות דינמיות אלה בגלל יכולתה ללכוד אינטראקציות חלבון יציבות וחולפות/חלשות עם ספציפיות מרחבית יוצאת דופן16,17. פרוקסידאז מהונדס או ביוטין ליגאז יכולים להתמזג גנטית עם חלבון הפיתיון. לאחר ההפעלה, רדיקלים ביוטינים תגובתיים מאוד מיוצרים כדי לתייג באופן קוולנטי חלבונים שכנים, אשר לאחר מכן ניתן להעשיר אותם על ידי חרוזים מצופים סטרפטווידין עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה במורד הזרם באמצעות פלטפורמות ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) 17,18,19,20,21.

לאחרונה פותחה שיטה אנדוגנית לתיוג פרוטאומיקה של קרבה ליזוסומלית כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית ב-i3Neurons22. אסקורבט פרוקסידאז מהונדס (APEX2) הוכנס ל-C-terminus של חלבון הממברנה הליזוזומלי הקשור ל-1 (LAMP1) ב-iPSCs, אשר לאחר מכן ניתן להבדיל אותם לנוירונים בקליפת המוח. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן ליזוזומלי קלאסי23. LAMP1 מתבטא גם באנדוזומים מאוחרים, המבשילים לליזוזומים; אנדוזומים-ליזוזומים מאוחרים אלה וליזוזומים לא מתכלים מכונים כולם ליזוזומים בפרוטוקול זה. בדיקה אנדוגנית זו של LAMP1-APEX, המתבטאת ברמה הפיזיולוגית, יכולה להפחית את המיסלוקליזציה של LAMP1 ואת ממצאי ביטוי היתר. ניתן לזהות ולכמת מאות חלבוני ממברנה ליזוזומליים ואינטראקטורים ליזוזומליים ברזולוציה מרחבית מצוינת בתאי עצב אנושיים חיים.

כאן, פרוטוקול מפורט לתיוג קרבה ליזוזומית פרוטאומיקה בנוירונים שמקורם ב- iPSC אנושי מתואר עם שיפורים נוספים משיטה22 שפורסמה לאחרונה. זרימת העבודה הכוללת מתוארת באיור 1. הפרוטוקול כולל תרבית נוירונים שמקורה ב-hiPSC, הפעלת תיוג קרבה בתאי עצב, אימות פעילות APEX על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, קביעת יחס אופטימלי בין חלבון חרוזים לקלט של סטרפטאווידין, העשרה של חלבונים שעברו ביוטינילציה, עיכול חלבונים על חרוזים, התפלה וכימות פפטידים, ניתוח LC-MS וניתוח נתוני פרוטאומיקה. הנחיות לפתרון בעיות ואופטימיזציות ניסיוניות נדונות גם כדי לשפר את בקרת האיכות והביצועים של תיוג קרבה.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת הבטיחות והאתיקה של אוניברסיטת ג’ורג’ וושינגטון. הקומפוזיציות של מדיה ומאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מסופקות בטבלה 1. פרטי המוצר המסחרי המשמשים כאן מסופקים בטבלת החומרים. 1. תרבית נוירונים אנושית שמקורה ב-iPSC תרבית iPSC …

Representative Results

מחקר זה של פרוטאומיקה לתיוג קרבה ליזוזום נערך בתאי עצב שמקורם ב-iPSC אנושי כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית באתרה בתאי עצב חיים. מורפולוגיות של תאים של hiPSCs ותאי עצב שמקורם ב-hiPSC בנקודות זמן שונות מודגמות באיור 2A. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים גדלים במושבות ?…

Discussion

באמצעות בדיקה זו של LAMP1-APEX, חלבונים על הממברנה הליזוזומלית ובסמוך לה עוברים ביוטינילציה ומועשרים. בהתחשב בקוטר הליזוזום הטיפוסי של 100-1,200 ננומטר, שיטה זו מספקת רזולוציה תוך-תאית מצוינת עם רדיוס תיוג של 10-20 ננומטר. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן קלאסי לליזוזומים, המשמש כחלבון פיתיו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R01NS121608). A.M.F. מכיר במלגת פרק ARCS-Metro Washington ובמלגת קרן בורבון פ. סקריבנר. אנו מודים למעבדת מייקל וורד במכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) על התמיכה בביולוגיה מולקולרית ולפיתוח טכנולוגיית i3Neuron.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Play Video

Cite This Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).

View Video