मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में गतिशील लाइसोसोमल माइक्रोएन्वायरमेंट को चिह्नित करने के लिए एक न्यूरोनल लाइसोसोम प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल का वर्णन यहां किया गया है। लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और प्रोटीन जो लाइसोसोम (स्थिर या क्षणिक रूप से) के साथ बातचीत करते हैं, उन्हें जीवित मानव न्यूरॉन्स में उत्कृष्ट इंट्रासेल्युलर स्थानिक संकल्प के साथ इस विधि में सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है।
लाइसोसोम अक्सर गिरावट और अन्य विविध सेलुलर कार्यों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रकार के बायोमोलेक्यूल्स के साथ संवाद करते हैं। लाइसोसोम मानव मस्तिष्क समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि न्यूरॉन्स पोस्टमाइटोटिक हैं और सेलुलर होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए ऑटोफैगी-लाइसोसोम मार्ग पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं। विभिन्न लाइसोसोमल कार्यों की समझ में प्रगति के बावजूद, लाइसोसोम और अन्य सेलुलर घटकों के बीच अत्यधिक गतिशील संचार को कैप्चर करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर उच्च-थ्रूपुट फैशन में। यहां, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में हाल ही में प्रकाशित अंतर्जात (नॉक-इन) लाइसोसोम निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है।
10-20 एनएम त्रिज्या के भीतर लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोम के आसपास के प्रोटीन दोनों को आत्मविश्वास से पहचाना जा सकता है और जीवित मानव न्यूरॉन्स में सटीक रूप से परिमाणित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को विस्तार से वर्णित किया गया है, यानी, एचआईपीएस-न्यूरॉन संस्कृति, निकटता लेबलिंग, न्यूरॉन फसल, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, बायोटिनिलेटेड प्रोटीन संवर्धन, प्रोटीन पाचन, एलसी-एमएस विश्लेषण और डेटा विश्लेषण। सारांश में, यह अद्वितीय अंतर्जात लाइसोसोमल निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स विधि जीवित मानव न्यूरॉन्स में अत्यधिक गतिशील लाइसोसोमल गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट और मजबूत विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करती है।
लाइसोसोम कैटाबोलिक ऑर्गेनेल हैं जो लाइसोसोमल-ऑटोफैगी मार्ग1 के माध्यम से मैक्रोमोलेक्यूल्स को नीचा दिखाते हैं। गिरावट के अलावा, लाइसोसोम विभिन्न सेलुलर कार्यों जैसे सिग्नलिंग ट्रांसडक्शन, पोषक तत्व संवेदन और स्राव 2,3,4 में शामिल हैं। लाइसोसोमल फ़ंक्शन में गड़बड़ी को लाइसोसोमल स्टोरेज विकारों, कैंसर, उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन 3,5,6,7 में फंसाया गया है। पोस्टमाइटोटिक और अत्यधिक ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स के लिए, लाइसोसोम न्यूरोनल सेलुलर होमियोस्टेसिस, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और अक्षतंतु 8,9,10,11 के साथ लंबी दूरी के परिवहन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, मानव न्यूरॉन्स में लाइसोसोम की जांच करना एक चुनौतीपूर्ण कार्य रहा है। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न न्यूरॉन प्रौद्योगिकियों में हालिया प्रगति ने जीवित मानव न्यूरॉन्स की संस्कृति को सक्षम किया है जो पहले दुर्गम थे, मानव मस्तिष्क12,13 का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल और मानव रोगियों के बीच की खाई को पाटते हैं। विशेष रूप से, उन्नत आई3न्यूरॉन तकनीक एक डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसेबल प्रमोटर के तहत आईपीएससी जीनोम में न्यूरोजेनिन -2 प्रतिलेखन कारक को एकीकृत करती है, जिससे आईपीएससी को 2 सप्ताह14,15 में शुद्ध कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है।
अत्यधिक गतिशील लाइसोसोमल गतिविधि के कारण, अन्य सेलुलर घटकों के साथ लाइसोसोमल इंटरैक्शन को कैप्चर करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर उच्च-थ्रूपुट फैशन में। प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग तकनीक इन गतिशील इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि इसकी क्षमता असाधारण स्थानिक विशिष्टता16,17 के साथ स्थिर और क्षणिक / कमजोर प्रोटीन इंटरैक्शन दोनों को पकड़ने की क्षमता है। इंजीनियर पेरोक्सीडेज या बायोटिन लिगेज को आनुवंशिक रूप से चारा प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। सक्रियण पर, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील बायोटिन कणों को सहसंयोजक रूप से पड़ोसी प्रोटीन को लेबल करने के लिए उत्पादित किया जाता है, जिसे तब तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) प्लेटफार्मों 17,18,19,20,21 के माध्यम से डाउनस्ट्रीम बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों द्वारा समृद्ध किया जा सकता है।
एक अंतर्जात लाइसोसोमल प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग प्रोटिओमिक्स विधि हाल ही में आई 3 न्यूरॉन्स22 में गतिशील लाइसोसोमल माइक्रोएन्वायरमेंट को पकड़नेकेलिए विकसित की गई थी। इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (एपेक्स 2) को आईपीएससी में लाइसोसोमल संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी 1) के सी-टर्मिनस पर दस्तक दी गई थी, जिसे बाद में कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है। एलएएमपी 1 एक प्रचुर मात्रा में लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और एक शास्त्रीय लाइसोसोमल मार्कर23 है। एलएएमपी 1 को देर से एंडोसोम में भी व्यक्त किया जाता है, जो लाइसोसोम में परिपक्व होते हैं; इन देर से एंडोसोम-लाइसोसोम और नॉनडिग्रेडेटिव लाइसोसोम को इस प्रोटोकॉल में लाइसोसोम के रूप में संदर्भित किया जाता है। यह अंतर्जात एलएएमपी 1-एपेक्स जांच, शारीरिक स्तर पर व्यक्त की जाती है, एलएएमपी 1 गलत स्थानीयकरण और ओवरएक्प्रेशन कलाकृतियों को कम कर सकती है। सैकड़ों लाइसोसोमल झिल्ली प्रोटीन और लाइसोसोमल इंटरएक्टर्स को जीवित मानव न्यूरॉन्स में उत्कृष्ट स्थानिक संकल्प के साथ पहचाना और परिमाणित किया जा सकता है।
यहां, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में लाइसोसोम निकटता लेबलिंग प्रोटिओमिक्स के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित विधि22 से और सुधार के साथ वर्णित है। समग्र वर्कफ़्लो चित्र 1 में चित्रित किया गया है। प्रोटोकॉल में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन संस्कृति, न्यूरॉन्स में निकटता लेबलिंग सक्रियण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एपेक्स गतिविधि का सत्यापन, एक इष्टतम स्ट्रेप्टाविडिन बीड्स-टू-इनपुट प्रोटीन अनुपात का निर्धारण, बायोटिनिलेटेड प्रोटीन का संवर्धन, ऑन-बीड्स प्रोटीन पाचन, पेप्टाइड डीसाल्टिंग और परिमाणीकरण, एलसी-एमएस विश्लेषण और प्रोटिओमिक्स डेटा विश्लेषण शामिल हैं। प्रॉक्सिमिटी लेबलिंग गुणवत्ता नियंत्रण और प्रदर्शन में सुधार के लिए समस्या निवारण दिशानिर्देशों और प्रयोगात्मक अनुकूलन पर भी चर्चा की जाती है।
इस एलएएमपी 1-एपेक्स जांच का उपयोग करके, लाइसोसोमल झिल्ली पर और उसके पास प्रोटीन बायोटिनाइलेटेड और समृद्ध होते हैं। 100-1,200 एनएम के विशिष्ट लाइसोसोम व्यास को देखते हुए, यह विधि 10-20 एनएम लेबलिंग त्रिज्या के स?…
The authors have nothing to disclose.
यह अध्ययन एनआईएच अनुदान (R01NS121608) द्वारा समर्थित है। एएमएफ एआरसीएस-मेट्रो वाशिंगटन चैप्टर स्कॉलरशिप और बोरबॉन एफ स्क्रिबनर एंडोमेंट फैलोशिप को स्वीकार करता है। हम आणविक जीव विज्ञान समर्थन और आई3न्यूरॉन प्रौद्योगिकी विकास के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस) में माइकल वार्ड लैब को धन्यवाद देते हैं।
10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |