Ett neuronalt lysosomnärhetsmärkningsproteomikprotokoll beskrivs här för att karakterisera den dynamiska lysosomala mikromiljön i humaninducerade pluripotenta stamcellsderiverade neuroner. Lysosomala membranproteiner och proteiner som interagerar med lysosomer (stabilt eller övergående) kan kvantifieras exakt i denna metod med utmärkt intracellulär rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.
Lysosomer kommunicerar ofta med en mängd olika biomolekyler för att uppnå nedbrytningen och andra olika cellulära funktioner. Lysosomer är avgörande för människans hjärnfunktion, eftersom neuroner är postmitotiska och förlitar sig starkt på autofagi-lysosomvägen för att upprätthålla cellulär homeostas. Trots framsteg i förståelsen av olika lysosomala funktioner är det tekniskt utmanande att fånga den mycket dynamiska kommunikationen mellan lysosomer och andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för den nyligen publicerade endogena (knock-in) lysosomnärhetsmärkningsproteomiska metoden i humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda neuroner.
Både lysosomala membranproteiner och proteiner som omger lysosomer inom en radie på 10-20 nm kan med säkerhet identifieras och kvantifieras exakt i levande mänskliga neuroner. Varje steg i protokollet beskrivs i detalj, dvs hiPSC-neuronkultur, närhetsmärkning, neuronskörd, fluorescensmikroskopi, biotinylerad proteinberikning, proteinsmältning, LC-MS-analys och dataanalys. Sammanfattningsvis ger denna unika endogena lysosomala närhetsmärkningsproteomikmetod ett högt genomströmnings- och robust analytiskt verktyg för att studera de mycket dynamiska lysosomala aktiviteterna i levande mänskliga neuroner.
Lysosomer är katabola organeller som bryter ner makromolekyler via lysosomal-autofagivägen1. Förutom nedbrytning är lysosomer involverade i olika cellulära funktioner såsom signaltransduktion, näringsavkänning och utsöndring 2,3,4. Störningar i lysosomal funktion har varit inblandade i lysosomala lagringsstörningar, cancer, åldrande och neurodegeneration 3,5,6,7. För postmitotiska och mycket polariserade neuroner spelar lysosomer kritiska roller i neuronal cellulär homeostas, neurotransmittorfrisättning och långväga transporter längs axonerna 8,9,10,11. Att undersöka lysosomer i mänskliga nervceller har dock varit en utmanande uppgift. De senaste framstegen inom inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har gjort det möjligt för kulturen av levande mänskliga neuroner som tidigare var otillgängliga, vilket överbryggar klyftan mellan djurmodeller och mänskliga patienter för att studera den mänskliga hjärnan12,13. I synnerhet integrerar den avancerade i3Neuron-tekniken stabilt neurogenin-2-transkriptionsfaktorn i iPSC-genomet under en doxycyklininducerbar promotor, vilket driver iPSC att differentiera till rena kortikala neuroner på 2 veckor14,15.
På grund av den mycket dynamiska lysosomala aktiviteten är det tekniskt utmanande att fånga lysosomala interaktioner med andra cellulära komponenter, särskilt på ett sätt med hög genomströmning. Närhetsmärkningsteknik är väl lämpad för att studera dessa dynamiska interaktioner på grund av dess förmåga att fånga både stabila och övergående / svaga proteininteraktioner med exceptionell rumslig specificitet16,17. Konstruerat peroxidas eller biotinligas kan genetiskt smältas till betesproteinet. Vid aktivering produceras mycket reaktiva biotinradikaler för att kovalent märka angränsande proteiner, som sedan kan berikas av streptavidinbelagda pärlor för nedströms bottom-up-proteomik via vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) plattformar 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal närhetsmärkning proteomikmetod utvecklades nyligen för att fånga den dynamiska lysosomala mikromiljön i i3Neurons22. Konstruerat askorbatperoxidas (APEX2) slogs in på C-änden av det lysosomala associerade membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som sedan kan differentieras till kortikala neuroner. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk lysosomal markör23. LAMP1 uttrycks också i sena endosomer, som mognar till lysosomer; Dessa sena endosom-lysosomer och icke-nedbrytande lysosomer kallas alla lysosomer i detta protokoll. Denna endogena LAMP1-APEX-sond, uttryckt på fysiologisk nivå, kan minska LAMP1-fellokalisering och överuttrycksartefakter. Hundratals lysosomala membranproteiner och lysosomala interagerande kan identifieras och kvantifieras med utmärkt rumslig upplösning i levande mänskliga neuroner.
Här beskrivs ett detaljerat protokoll för lysosomnärhetsmärkning proteomik i humana iPSC-härledda neuroner med ytterligare förbättringar från den nyligen publicerade metoden22. Det övergripande arbetsflödet visas i figur 1. Protokollet inkluderar hiPSC-härledd neuronkultur, aktivering av närhetsmärkning i neuroner, validering av APEX-aktivitet genom fluorescensmikroskopi, bestämning av ett optimalt streptavidin-pärl-till-input-proteinförhållande, anrikning av biotinylerade proteiner, proteinsmältning på pärlor, peptidavsaltning och kvantifiering, LC-MS-analys och proteomikdataanalys. Felsökningsriktlinjer och experimentella optimeringar diskuteras också för att förbättra kvalitetskontroll och prestanda för närhetsmärkning.
Med hjälp av denna LAMP1-APEX-sond biotinyleras och berikas proteiner på och nära det lysosomala membranet. Med tanke på den typiska lysosomdiametern på 100-1 200 nm ger denna metod utmärkt intracellulär upplösning med en märkningsradie på 10-20 nm. LAMP1 är ett rikligt lysosomalt membranprotein och en klassisk markör för lysosomer, som fungerar som ett utmärkt beteprotein för lysosomal APEX-märkning på endogen uttrycksnivå. Det finns dock också begränsningar när man använder LAMP1 för att rikta in…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöds av NIH-anslaget (R01NS121608). A.M.F. erkänner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship och Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi tackar Michael Ward-labbet vid National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) för molekylärbiologiskt stöd och i3Neuron-teknikutvecklingen.
10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |