Summary
本协议描述了未转化的乳腺上皮细胞系MCF10A的3D “顶部”培养物的建立，该培养物已被修改以研究血小板活化因子（PAF）诱导的转化。免疫荧光已被用于评估转化，并详细讨论。
Abstract
已经开发了几种模型来研究癌症，例如啮齿动物模型和已建立的细胞系。使用这些模型的研究提供了对致癌作用的宝贵见解。细胞系提供了与乳腺肿瘤发生相关的分子信号传导失调的理解，而啮齿动物模型广泛用于研究体内乳腺癌的细胞和分子特征。 乳腺上皮细胞和癌细胞的3D培养物的建立有助于通过模拟体内体外条件来弥合体内和体外模型之间的差距。该模型可用于了解复杂分子信号传导事件的失调和乳腺癌变过程中的细胞特征。在这里，修改了3D培养系统以研究磷脂介质诱导的（血小板活化因子，PAF）转化。免疫调节剂和其他分泌分子在乳房肿瘤的发生和进展中起主要作用。在本研究中，暴露于乳腺上皮细胞的3D腺泡培养物暴露于PAF表现出转化特征，例如极性丧失和细胞特征改变。该3D培养系统将有助于揭示由肿瘤微环境中各种小分子实体诱导的遗传和/或表观遗传扰动。此外，该系统还将为鉴定可能参与转化过程的新型和已知基因提供一个平台。
Introduction
有无数的模型可用于研究癌症的进展，每个模型都是独一无二的，代表了这种复杂疾病的一种亚型。每个模型都为癌症生物学提供了独特而有价值的见解，并改进了模拟实际疾病状况的方法。作为单层生长的已建立细胞系为体外重要过程提供了宝贵的见解，例如增殖，侵袭性，迁移和凋亡1。尽管二维（2D）细胞培养一直是研究哺乳动物细胞对几种环境扰动的反应的传统工具，但推断这些发现以预测组织水平的反应似乎不够令人信服。2D培养的主要局限性在于产生的微环境与乳腺组织本身的微环境有很大不同2。2D培养缺乏细胞与细胞外基质的相互作用，这对于任何组织的生长都至关重要。此外，细胞在单层培养物中经历的拉力会阻碍这些细胞的极性，从而改变细胞信号传导和行为3，4，5。三维（3D）培养系统具有模拟体外体内条件的能力，为癌症研究领域开辟了一条新途径。 在2D细胞培养中丢失的许多关键微环境线索可以使用富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）的3D培养物重新建立6。
各种研究已经确定了肿瘤微环境在致癌中的重要性7，8。炎症相关因素是微环境的主要部分。血小板活化因子（PAF）是由各种免疫细胞分泌的磷脂介质，介导多种免疫反应9，10。高水平的PAF由不同的乳腺癌细胞系分泌，并与增殖增强有关11。我们实验室的研究表明，腺泡培养物中PAF的长期存在导致乳腺上皮细胞的转化12。PAF激活PAF受体（PAFR），激活PI3K/Akt信号轴13。据报道，PAFR 也与 EMT、侵袭和转移有关14。
本协议展示了一个模型系统来研究PAF诱导的转化，使用乳腺上皮细胞的3D培养物，如Chakravarty等人之前所描述的那样12。在细胞外基质（3D培养物）上生长的乳腺上皮细胞倾向于形成极化生长停滞球状体。这些被称为腺泡，与乳腺组织的腺泡非常相似，乳腺是乳腺最小的功能单位，在 体内15。 这些球体（图1A，B）由单层紧密堆积的极化上皮细胞组成，围绕空心腔并附着在基底膜上（图1C）。这种形态发生过程已在文献16中得到了很好的描述。当接种在lrECM上时，细胞经历分裂和分化以形成细胞簇，然后从第4天开始极化。到第8天，腺泡由一组与细胞外基质直接接触的极化细胞和封闭在外极化细胞内的一簇非极化细胞组成，与基质没有接触。已知这些未极化的细胞在培养的第12天发生凋亡，形成空心腔。到第16天，形成生长停滞的结构16。
图1：用核染色的腺泡中的细胞核 。 （A）腺泡的3D构造。（B）在基质胶上生长20天的MCF10A腺泡的相衬图像。（C）最中间的部分显示了空心腔的存在。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
与2D培养不同，腺泡培养有助于通过明显的形态变化区分正常细胞和转化细胞。未转化的乳腺上皮细胞形成具有空腔的腺泡，模仿正常人乳腺腺泡。这些球体在转化时显示出破坏的形态，其特征是极性严重丧失（癌症的标志之一），没有管腔或空腔的破坏（由于细胞凋亡的逃避），这可能是由于各种基因的失调引起的17，18，19，20.这些转化可以使用常用的技术（如免疫荧光）进行研究。因此，3D细胞培养模型可以作为研究乳腺腺泡形态发生和乳腺癌发生的过程的简单方法。建立3D培养系统以了解磷脂介质PAF的作用将有助于高通量临床前药物筛选。
这项工作采用了3D“顶部”培养协议16，21，以研究PAF22诱导的转化。使用免疫荧光研究了腺泡暴露于磷脂介质引起的表型变化。研究中使用了各种极性和上皮到间充质转化（EMT）标记12，16。表1提到了它们的正常定位和转化时的预期表型。
| 抗体 | 标志着 | 正常本地化 | 转化表型 |
| α6-整合素 | 基底外侧 | 基底侧染色较弱 | 强烈的横向/顶端染色 |
| β-连环蛋白 | 细胞-细胞连接 | 基底外侧 | 异常/核或细胞质定位 |
| 维门汀 | EMT | 不存在/弱存在 | 上调 |
表1：研究中使用的标记物。 在存在和不存在PAF治疗的情况下，使用不同的标记物进行定位。
该方法可以最好地用于研究/筛选各种乳腺癌亚型的合理药物和靶基因。这可以提供更接近 体内 情景的药物反应数据，有助于更快、更可靠的药物开发。此外，该系统可用于研究与药物反应和耐药性相关的分子信号传导。
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Protocol
1. 在 lrECM 中接种 MCF10A 细胞
- 将MCF10A细胞（贴壁性乳腺上皮细胞）维持在生长培养基中。每4天传代一次细胞。
注意：生长培养基的组成：不含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM含马血清（5%），胰岛素（10μg/ mL），氢化可的松（0.5μg/ mL），表皮生长因子EGF（20ng / mL），霍乱毒素（100ng / mL）和青霉素 - 链霉素（100单位/ mL）（见 材料表）。 - 在实验开始前20分钟在冰上解冻lrECM（见 材料表）。接种细胞的那一天通常被认为是第0天。
- 为了胰蛋白酶消化细胞，吸出培养基，并用2mL PBS洗涤。加入 900 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育 ~15 分钟或直到细胞完全胰蛋白酶消化。
- 在腔盖玻片的八个孔中准备lrECM床（见 材料表）。
- 当细胞胰蛋白酶消化时，用60μLllrECM包被每个孔，并将其置于37°C CO2 培养箱中最多15分钟。
- 按照以下步骤准备细胞悬液。
- 细胞完全移位后，加入5mL重悬培养基以淬灭胰蛋白酶活性，并在25°C下以112× g 旋转细胞10分钟。
注意：重悬培养基的组成：不含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM，补充马血清（20%）和青霉素 - 链霉素（100单位/ mL）。 - 吸出用过的培养基并将细胞重新悬浮在 2 mL 测定培养基中。充分混合悬浮液以确保形成单细胞悬液。
注意：测定培养基的组成：不含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM，补充马血清（2%），氢化可的松（0.5μg/ mL），霍乱毒素（100ng / mL），胰岛素（10μg/ mL）和青霉素 - 链霉素（100单位/ mL）。 - 使用血细胞计数器计数细胞，并计算在每个孔中接种6 x 103 个细胞所需的细胞悬液体积。
注意：通常最好在计算中包括一个额外的孔，以解决任何移液错误。 - 根据所需的孔数，在覆盖培养基中稀释细胞悬液。
注意：单个孔的覆盖培养基组成如下：400 μL 测定培养基、8 μL lrECM（2% 最终）和 0.02 μL 100 μg/mL EGF（5 ng/mL 最终）。
- 细胞完全移位后，加入5mL重悬培养基以淬灭胰蛋白酶活性，并在25°C下以112× g 旋转细胞10分钟。
- 进行细胞接种。
- 将 400 μL 稀释的细胞悬液加入制备的 lrECM 床（步骤 1.4），小心确保不会干扰 lrECM 床。在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。
2. PAF处理
- 在细胞接种后3小时加入PAF。在PBS中制备100μM的PAF储备液，并在每个孔中加入所需的0.2μL体积（相当于200nM）。
- 在每次更换培养基期间添加相同浓度的PAF。
3. 用新鲜培养基重新喂食
- 每4天（即第4天，第8天，第12天和第16天）用新鲜培养基补充细胞。
4. 免疫荧光研究以检测长时间暴露于PAF引起的表型变化
- 培养 20 天后，小心地从每个孔中移出培养基，并用 400 μL 预热的 PBS 洗涤孔。
- 通过加入 400 μL 4% 多聚甲醛（通过在 1x PBS 中稀释 16% 多聚甲醛新鲜制备）并在室温下孵育 20 分钟来固定腺泡结构。
- 用冰冷的PBS冲洗孔一次，并在4°C下用含有0.5%Triton X-100的PBS透化10分钟。
- 10分钟后，立即但小心地移出Triton-X 100溶液，并用400μLPBS-甘氨酸冲洗（通过在1x PBS中加入一小撮甘氨酸新鲜制备）。重复三次，每次15分钟。
- 在免疫荧光（IF）缓冲液中加入400μL含有10%山羊血清（参见 材料表）的初级封闭溶液，并在室温下孵育60分钟。
注意：IF缓冲液的组成：0.05%叠氮化钠，0.1%BSA，0.2%Triton-X 100和0.05%吐温（20合1 PBS）。 - 除去一级封闭溶液，加入在一级封闭溶液中制备的200μL2%二级封闭抗体（山羊中培养的抗小鼠抗原的抗体的F（ab'）2片段，参见 材料表），并在室温下放置45-60分钟。
- 在2%二级封闭抗体溶液中以1：100稀释度制备一抗（参见 材料表）。除去二级封闭溶液后，加入新鲜制备的抗体并在4°C下孵育过夜。
- 上一步可能引起基底膜液化。在继续实验之前，请等到载玻片达到室温。小心移液一抗溶液，并用 400 μL IF 缓冲液洗涤三次。
- 在最后一次用IF缓冲液洗涤期间，在一级封闭溶液中制备1：200稀释的荧光团偶联二抗（参见 材料表）。将载玻片在二抗溶液中在室温下孵育40-60分钟。
- 用 400 μL IF 缓冲液冲洗载玻片 20 分钟，然后用 PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
- 在室温下用含有0.5ng / mL核染色剂（参见 材料表）的PBS对细胞核进行复染5-6分钟。用 400 μL PBS 清洗载玻片三次，以去除多余的污渍。
- 小心地移出整个PBS，并确保去除残留的溶液。向每个孔中加入一滴封片剂（参见 材料表），使其在室温下静置过夜。
- 将载玻片存放在室温下，并尽快对载玻片进行成像。
- 在共聚焦显微镜上以40倍或63倍放大倍率拍摄图像（参见 材料表），取0.6毫米步长（NA = 1.4）的光学Z切片。
- 使用图像处理软件打开采集的图像（参见 材料表）。使用 3D 投影展示形态差异。
注意：最中间的光学Z截面最适合用于显示极性标记定位的差异。这些可以手动量化，以表示显示特定染色模式的微球的百分比。 - 为了说明蛋白质表达的差异，请进行半定量分析，测量平均灰度值或计算校正后的总细胞荧光（CTCF）23。将数据表示为小提琴图或点图。
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Representative Results
MCF10A细胞在暴露于PAF处理后，形成具有非常明显表型的腺泡结构。发现α6-整合素定位错误，根尖染色较多。一些腺泡也显示出不连续的染色（图2A）。这两种表型都表明基底极性的丧失，如文献24，25所示。早期的报告表明α6-整合素在癌症转移中的作用存在争议。α6-整合素与β1-或β4-整合素以二聚体形式存在。已发现α6β4亚基在上皮细胞中形成半桥粒中起重要作用26。在前列腺和一些乳腺癌病例中发现了这种整合素的下调，其中在乳腺导管癌（III级）中发现了α6β4-整合素的丢失。损失表型见于转移到实质和胸膜腔的细胞27，28，29。GM130是一种顺式-高尔基体局部蛋白;高尔基体在MCF10A腺泡培养物中顶端定位16，30。PAF处理导致GM130的错误定位，表明顶端极性破坏（图2B）。Vimentin是一种参与细胞迁移的中间丝;当上皮细胞经历上皮到间充质转化（EMT）31时，它上调。MCF10A腺泡培养物的PAF处理导致染色强度观察到的vimentin水平升高（图2C），提示EMT。
图 2：PAF 破坏极性并诱导 MCF10A 乳腺腺泡的 EMT 样变化。 MCF10A细胞在lrECM中以3D“顶部”培养物的形式生长。培养物在第0、4、8、12和16天用PAF处理。将培养物维持20天，然后免疫染色α6-整合素（绿色）和核染色（蓝色）（A），（B）GM130（绿色），顶端极性标志物和（C）Vimentin（红色），EMT标志物。已经显示了各个腺泡的最中心堆栈。代表性数据是来自三个生物学独立实验的40-50个腺泡。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
已建立的基于细胞系的模型被广泛用于研究致癌过程。细胞的单层培养继续提供对介导癌细胞特征变化的各种分子信号通路的见解32。关于众所周知的癌基因（如Ras，Myc和突变p53）的作用的研究首先使用单层培养物作为模型系统33，34，35，36。然而，2D培养模型缺乏体内存在的许多重要的结构和功能参数。即使在较低浓度下，2D培养中的药物筛选研究通常也显示出显着的反应（细胞死亡或靶标抑制），而在小鼠中注射时未显示出任何显着效果37。造成这种情况的主要原因是2D单层培养物与2D单层培养物中的药物可用性和摄取率不同。3D 文化38.
在过去十年中，3D培养的概念已成为研究癌症进展的有力工具。3D培养涉及在细胞外基质上生长细胞，导致形成类似于体内组织中存在的功能单位的结构16。3D培养在很大程度上模仿了体内微环境，从而克服了2D培养的局限性39.此外，由于在3D中生长的细胞是人类来源的，并且该系统更适合研究早期事件，因此它比啮齿动物模型更简单，更优雅。
使用该平台，展示了一个模型来研究暴露于磷脂介质（如PAF）后的转化过程。我们实验室的研究发现，PAF治疗可以转化非致瘤性乳腺上皮细胞系MCF10A12。该方法经过优化，可连续将细胞暴露于PAF，类似于 体内 场景，其中PAF存在于微环境中。
MCF10A细胞在2D中生长时，必须每4天传代一次。如果不按照协议维护它们，它们的行为会非常不同，这只有在 ECM16 上生长时才可见。细胞的传代数必须尽可能低。由于不同批次的lrECM中蛋白质浓度的变化，该方法也具有局限性。这可以通过简单地将细胞接种在lrECM床上并观察腺泡的大小分布来测试不同批次来克服。如果大小没有大的变异性，则可以认为lrECM批次适合实验。
转化的评估通常通过免疫荧光完成，如视频所示。在进行免疫荧光时，涉及在4°C孵育的步骤至关重要;当lrECM层处于液态时移出溶液会使该层不均匀，导致腺泡结构的损失。解决不均匀问题的方法之一是将载玻片在4°C的均匀平台上存放过夜或改变成像的放大倍率。为避免移出腺泡结构，请小心地从4°C储存中取出腔室并去除最初添加的体积的四分之三，然后在随后的洗涤中取出其余的体积。
面临的另一个主要问题是由于lrECM引起的高背景。为了克服这个问题，可以使用2%的二级封闭抗体而不是1%。然而，增加继发性阻断并不能达到对顶端标志物和E-钙粘蛋白进行染色的目的。在这种情况下，建议在第20天后将腔室盖玻片置于4°C的PBS-EDTA中15分钟，然后按照视频中显示的相同方案固定腺泡。PBS-EDTA部分溶解了lrECM，从而降低了背景。但是，如果超过孵育时间，这种处理可能会导致移出溶液时结构损失。因此，在执行此过程时必须格外小心。还观察到，长时间存放载玻片会导致背景信号增加。因此，必须尽快进行影像学检查。建议每次实验至少对 15 个腺泡进行成像，以确定表型的变化。
3D腺泡培养具有一定的局限性，例如在活细胞成像过程中难以跟踪单个细胞。某些研究，例如对细胞周期的影响，需要使用活细胞成像来保持空间和时间信息。然而，由于结构的不断变化，使用常规共聚焦显微镜很难在3D腺泡培养物中跟踪这些参数。这保证使用先进的显微技术，如超分辨率显微镜或Airyscan显微镜。它还需要移位腺泡结构以进行某些转化测定，例如伤口愈合、锚定非依赖性生长和 体内 致瘤性测定。这种移位将导致重要的空间和时间信息的丢失。由于IrECM的存在，从培养物中收集的蛋白质裂解物经常被稀释，这给上样足够量的裂解物带来了问题。然而，这可以通过在裂解前去除腺泡结构并收集它们来更大程度地克服。
在这里，已经证明了一个模型系统来研究磷脂介质/免疫相关因子诱导的转化。该模型可以阐明可能被解除管制的遗传和/或表观遗传途径，从而导致形态发生剧烈变化。这种方法也可用于筛选潜在的治疗方法。这种药物筛选研究将比在2D培养中进行的筛选提供更好的成功率38。该方法的一大亮点是根据研究要求的适应性。治疗方案和分析方法可以根据需要进行修改。此外，该方法可以提供对治疗时受影响的分子信号传导的见解40。该技术还将有助于预测耐药性的可能发生。此外，它还将有助于阐明耐药性所涉及的机制，并确定克服这种机制的合理目标。研究已经确定了在3D中共培养多种细胞类型的可能性，可以进一步修改以适应治疗方案41。这些机会将为乳腺癌发生 和发展过程中体内 发生的特征和分子变化提供更深入的见解。
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Disclosures
作者声明没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢IISER浦那显微镜设施提供设备和基础设施以及实验支持。这项研究得到了印度政府生物技术部（DBT）（BT / PR8699 / MED/30 / 1018 / 2013），印度政府科学与工程研究委员会（SERB）（EMR / 2016 / 001974）的资助，部分资金来自IISER，浦那核心资金。A.K.由CSIR-SRF奖学金资助，洛杉矶由DST-INSPIRE奖学金资助，V.C由DBT资助（BT / PR8699 / MED/30 / 1018 / 2013）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
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