تنشط عدوى فيروس الأنفلونزا A (IAV) الكاسباز الذي يشق المضيف والبروتينات الفيروسية ، والتي بدورها لها وظائف مؤيدة ومضادة للفيروسات. من خلال استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، والنشاف الغربي وتقنيات RT-qPCR ، تم تحديد الكاسباز في خلايا الثدييات المصابة التي تشق الكورتاكتين المضيف و deacetylases هيستون.
Caspases ، وهي عائلة من بروتياز السيستين ، تنظم موت الخلايا المبرمج استجابة للمحفزات المختلفة ، بما في ذلك الالتهابات الميكروبية. وصف موت الخلايا المبرمج في البداية بأنه يحدث عن طريق موت الخلايا المبرمج ، ومن المعروف الآن أنه يشمل ثلاثة مسارات مترابطة: pyroptosis ، وموت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، والتي صيغت معا كعملية واحدة ، PANoptosis. تأثير عدوى الفيروس (IAV) يحفز PANoptosis في خلايا الثدييات عن طريق تحفيز تنشيط caspases مختلفة ، والتي بدورها تشق العديد من البروتينات المضيفة وكذلك الفيروسية ، مما يؤدي إلى عمليات مثل تنشيط الاستجابة الفطرية المضادة للفيروسات المضيفة أو تدهور البروتينات المضيفة المعادية. في هذا الصدد ، تم اكتشاف انشقاق كاسباز 3 بوساطة كورتاكتين المضيف ، وهيستون ديسيتيلاز 4 (HDAC4) ، وهيستون ديسيتيلاز 6 (HDAC6) في كل من الخلايا الظهارية الحيوانية والبشرية استجابة لعدوى IAV. لإثبات ذلك ، تم استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، وبعد ذلك ، تم قياس الانقسام أو مقاومة الانقسام واستعادة الكورتاكتين ، HDAC4 ، و HDAC6 polypeptide بواسطة النشاف الغربي. تشكل هذه الطرق ، جنبا إلى جنب مع RT-qPCR ، استراتيجية بسيطة ولكنها فعالة لتحديد المضيف وكذلك البروتينات الفيروسية التي تخضع للانقسام بوساطة caspase أثناء الإصابة ب IAV أو الفيروسات البشرية والحيوانية الأخرى. ويفصل هذا البروتوكول النتائج التمثيلية لهذه الاستراتيجية، كما تناقش سبل جعلها أكثر فعالية.
فيروس الأنفلونزا A (IAV) هو العضو النموذجي في عائلة Orthomyxoviridae ومن المعروف أنه يسبب أوبئة عالمية وأوبئة لا يمكن التنبؤ بها. يسبب IAV أمراض الجهاز التنفسي البشرية ، والأنفلونزا ، والمعروفة باسم “الأنفلونزا”. الأنفلونزا مرض حاد يؤدي إلى تحريض الاستجابات المناعية الفطرية المؤيدة والمضادة للالتهابات وموت الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي البشري. تخضع كلتا العمليتين لظاهرة تسمى موت الخلايا المبرمج1. يتم تحفيز إشارات موت الخلايا المبرمج بمجرد أن تستشعر مستقبلات التعرف على مسببات الأمراض المختلفة جزيئات الفيروس الواردة في الخلايا المضيفة. هذا يؤدي إلى برمجة موت الخلايا المصابة والإشارة إلى الخلايا السليمة المجاورة من خلال ثلاثة مسارات مترابطة تسمى pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis – تمت صياغتها مؤخرا كعملية واحدة ، PANoptosis1.
يتضمن PANoptosis المعالجة المحللة للبروتين للعديد من البروتينات المضيفة والفيروسية من الحث إلى التنفيذ. هذه المعالجة للبروتينات تقودها في المقام الأول عائلة من بروتياز السيستين تسمى caspases 1,2. ما يصل إلى 18 كاسباس (من كاسباز 1 إلى كاسباز 18) معروفة3. يتم التعبير عن معظم الكاسباس على أنها مؤيدة للكاسباس ويتم تنشيطها من خلال الخضوع للمعالجة المحللة للبروتين الخاصة بها إما عن طريق التحفيز الذاتي أو الكاسباسات الأخرى4 استجابة لمحفز مثل عدوى الفيروس. كان يعتقد أن PANoptosis للخلايا المصابة ب IAV هي آلية دفاع مضيفة ، لكن IAV طورت طرقا للتهرب منها واستغلالها لتسهيل تكرارها1،2،5،6. أحدها هو استعداء العوامل المضيفة عن طريق الانقسام بوساطة caspase أو التدهور الذي يكون إما مضادا للفيروسات بطبيعته أو يتداخل مع إحدى خطوات دورة حياة IAV. تحقيقا لهذه الغاية ، تم اكتشاف عوامل المضيف ، الكورتاكتين ، HDAC4 ، و HDAC6 للخضوع للانقسام بوساطة caspase أو التدهور في الخلايا الظهارية المصابة IAV7،8،9. HDAC4 و HDAC6 هما عاملان مضادان ل IAV 8,10 ، ويتداخل الكورتاكتين مع تكرار IAV في مرحلة لاحقة من العدوى ، ربما أثناء التجميع الفيروسي والتبرعم11.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا تنشيط العديد من caspases ، والتي بدورها تشق بروتينات متعددة لتنشيط الاستجابة الالتهابية للمضيف أثناء عدوى IAV 1,2. علاوة على ذلك ، فإن البروتين النووي (NP) ، وبروتين القناة الأيونية M2 من IAV12،13،14 ، والبروتينات المختلفة للفيروسات الأخرى3،15،16 تخضع أيضا للانقسام بوساطة caspase أثناء العدوى ، مما يؤثر على التسبب في الفيروس. لذلك ، هناك حاجة مستمرة لدراسة الانقسام بوساطة caspase أو تدهور البروتينات المضيفة والفيروسية أثناء IAV والتهابات الفيروسات الأخرى لفهم الأساس الجزيئي للتسبب الفيروسي. هنا ، يتم تقديم الطرق من أجل (1) تقييم انشقاق أو تدهور هذه البروتينات بواسطة الكاسباز ، (2) تحديد تلك الكاسباس ، و (3) تحديد مواقع الانقسام.
ثبت أن الفيروسات تصمم العوامل والمسارات المضيفة لصالحها. في المقابل ، تقاوم الخلايا المضيفة ذلك من خلال استخدام استراتيجيات مختلفة. واحدة من هذه الاستراتيجيات هي PANoptosis ، والتي تستخدمها الخلايا المضيفة كاستراتيجية مضادة للفيروسات ضد عدوى الفيروسات. ومع ذلك ، طورت فيروسات مثل IAV استراتيجي…
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلف بجنيفر تيبر ، وبيلان لي ، وجيسي فان ويسترينين ، وكيفن هارود ، ودا يوان تشين ، وفرجانة أحمد ، وسونيا مروس ، وكينيث يامادا ، وريتشارد ويبي ، وموارد BEI (NIAID) ، ومجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا ، وصندوق موريس وفيليس بايكل (نيوزيلندا) ، و HS و JC Anderson Trust (دنيدن) ، وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة وكلية العلوم الطبية الحيوية (جامعة أوتاجو).
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |