Summary
Influenza A-virus (IAV) -infectie activeert de caspasen die gastheer en virale eiwitten splitsen, die op hun beurt pro- en antivirale functies hebben. Door gebruik te maken van remmers, RNA-interferentie, site-gerichte mutagenese en western blotting en RT-qPCR-technieken, werden caspasen geïdentificeerd in geïnfecteerde zoogdiercellen die gastheercorticonctine en histondeacetylasen splitsen.
Abstract
Caspases, een familie van cysteïneproteasen, orkestreert geprogrammeerde celdood als reactie op verschillende stimuli, waaronder microbiële infecties. Aanvankelijk beschreven als optredend door apoptose, is nu bekend dat geprogrammeerde celdood drie onderling verbonden paden omvat: pyroptose, apoptose en necroptose, samen bedacht als één proces, PANoptosis. Invloed Een virusinfectie (IAV) induceert PANoptosis in zoogdiercellen door de activering van verschillende caspasen te induceren, die op hun beurt verschillende gastheer- en virale eiwitten splitsen, wat leidt tot processen zoals de activering van de aangeboren antivirale respons van de gastheer of de afbraak van antagonistische gastheereiwitten. In dit verband is caspase 3-gemedieerde splitsing van gastheercorticactine, histondeacetylase 4 (HDAC4) en histondeacetylase 6 (HDAC6) ontdekt in zowel dierlijke als menselijke epitheelcellen als reactie op de IAV-infectie. Om dit aan te tonen, werden remmers, RNA-interferentie en plaatsgerichte mutagenese gebruikt, en vervolgens werden de splitsing of resistentie tegen splitsing en het herstel van cortactine, HDAC4 en HDAC6 polypeptiden gemeten door western blotting. Deze methoden, in combinatie met RT-qPCR, vormen een eenvoudige maar effectieve strategie om de gastheer te identificeren, evenals virale eiwitten die caspase-gemedieerde splitsing ondergaan tijdens een infectie van IAV of andere menselijke en dierlijke virussen. Het huidige protocol werkt de representatieve resultaten van deze strategie uit en de manieren om deze effectiever te maken worden ook besproken.
Introduction
Influenza A-virus (IAV) is het prototypische lid van de Orthomyxoviridae-familie en staat erom bekend wereldwijde epidemieën en onvoorspelbare pandemieën te veroorzaken. IAV veroorzaakt menselijke ademhalingsziekte, influenza, algemeen bekend als "griep". De griep is een acute ziekte die resulteert in de inductie van gastheer pro- en anti-inflammatoire aangeboren immuunresponsen en de dood van epitheelcellen in de menselijke luchtwegen. Beide processen worden beheerst door een fenomeen dat geprogrammeerde celdood1 wordt genoemd. De signalering voor geprogrammeerde celdood wordt geïnduceerd zodra verschillende pathogeenherkenningsreceptoren de binnenkomende virusdeeltjes in gastheercellen detecteren. Dit leidt tot de programmering van de dood van geïnfecteerde cellen en signalering aan de naburige gezonde cellen door drie onderling verbonden paden genaamd pyroptose, apoptose en necroptose - onlangs bedacht als één proces, PANoptosis1.
PANoptosis omvat de proteolytische verwerking van veel gastheer- en virale eiwitten van inductie tot uitvoering. Een dergelijke verwerking van eiwitten wordt voornamelijk geleid door een familie van cysteïneproteasen genaamd caspases 1,2. Er zijn maximaal 18 caspasen (van caspase 1 tot caspase 18) bekend3. De meeste caspasen worden uitgedrukt als pro-caspasen en geactiveerd door hun eigen proteolytische verwerking te ondergaan, hetzij door autokatalyse of andere caspasen4 als reactie op een stimulus zoals een virusinfectie. De PANoptosis van IAV-geïnfecteerde cellen werd beschouwd als een gastheerverdedigingsmechanisme, maar IAV heeft manieren ontwikkeld om het te ontwijken en te exploiteren om de replicatie ervan te vergemakkelijken 1,2,5,6. Een daarvan is om de gastheerfactoren te antagoniseren via caspase-gemedieerde splitsing of afbraak die inherent antiviraal zijn of interfereren met een van de stappen van de IAV-levenscyclus. Hiertoe zijn gastheerfactoren, cortactine, HDAC4 en HDAC6 ontdekt om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak te ondergaan in IAV-geïnfecteerde epitheelcellen 7,8,9. De HDAC4 en HDAC6 zijn anti-IAV-factoren 8,10 en cortactine interfereert met IAV-replicatie in een later stadium van infectie, mogelijk tijdens virale assemblage en ontluikende11.
Daarnaast worden ook verschillende caspasen geactiveerd, die op hun beurt meerdere eiwitten splitsen om de ontstekingsreactie van de gastheer tijdens IAV-infectie te activeren 1,2. Bovendien ondergaan nucleoproteïne (NP), ionkanaal M2-eiwit van IAV 12,13,14 en verschillende eiwitten van andere virussen 3,15,16 ook caspase-gemedieerde splitsing tijdens infectie, wat de virale pathogenese beïnvloedt. Daarom is er een voortdurende behoefte om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak van gastheer- en virale eiwitten tijdens IAV en andere virusinfecties te bestuderen om de moleculaire basis van virale pathogenese te begrijpen. Hierin worden de methoden gepresenteerd om (1) de splitsing of afbraak van dergelijke eiwitten door caspasen te beoordelen, (2) die caspasen te identificeren en (3) de splitsingsplaatsen te lokaliseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wettelijke goedkeuringen werden verkregen van de University of Otago Institutional Biological Safety Committee om te werken met de IAV en zoogdiercellen. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) of menselijke longalveolaire epitheliale A549-cellen en IAV H1N1-subtypen werden gebruikt voor deze studie. IAV werd gekweekt in kippeneieren, zoals elders beschreven17. Steriele en aseptische omstandigheden werden gebruikt om met zoogdiercellen te werken, en een bioveiligheidsniveau 2 (of fysieke insluiting 2) faciliteit en klasse II bioveiligheidskast werden gebruikt om met IAV-subtypen te werken.
1. Beoordeling van de splitsing of afbraak van eiwitten in met IAV geïnfecteerde cellen door caspasen
- Zaad 3 x 105 MDCK- of A549-cellen per put in een 12-well celkweekplaat.
OPMERKING: Als u MDCK-cellen gebruikt, zorg er dan voor dat het antilichaam tegen het eiwit van belang zijn hondensoorten herkent. - Zaai de putten in paren, d.w.z. een controlepaar - een put voor het niet-geïnfecteerde- mock-monster en een voor het geïnfecteerde-mock-monster - en een testpaar- een put voor niet-geïnfecteerde-remmer A-monster en een voor de geïnfecteerde-remmer A-monster. Verhoog het aantal paren met elke extra remmer (zie referenties 7,8).
- Incubeer de cellen bij 37 °C onder een CO2-atmosfeer van 5% 's nachts.
- Infecteer de cellen de volgende dag met IAV (een H1N1-subtype of een ander subtype).
- Bereid hiervoor het virusoculum voor door de virusvoorraad te verdunnen in 400 μL serumvrij minimaal essentieel medium (MEM) (zie Materiaaltafel) bij een veelvoud van infectie (MOI) van 0,5-3,0 plaquevormende eenheden (pfu)/cel 7,11 (een factor van de verdubbeling van het celgetal bij het berekenen van de MOI).
OPMERKING: Voor het infecteren van MDCK-cellen, vul het virusoculum aan met tosylfenylalanylchloorhyoketon (TPCK)-trypsine in een eindconcentratie van 1 μg / ml.
- Bereid hiervoor het virusoculum voor door de virusvoorraad te verdunnen in 400 μL serumvrij minimaal essentieel medium (MEM) (zie Materiaaltafel) bij een veelvoud van infectie (MOI) van 0,5-3,0 plaquevormende eenheden (pfu)/cel 7,11 (een factor van de verdubbeling van het celgetal bij het berekenen van de MOI).
- Verwijder het oude kweekmedium uit de cellen (stap 1.3) en was de cellen met 1 ml/putje serumvrij MEM 2x.
- Voeg 400 μL virusoculum (stap 1.4.1) toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 1 uur bij 35 °C onder een CO2-atmosfeer van 5%.
- Verdun in de tussentijd een caspaseremmer (bijv. Z-DEVD-FMK), een lysosoomremmer (bijv. NH4Cl) of een proteasoomremmer (bijv. MG132) (zie materiaaltabel) met een eindconcentratie van respectievelijk 40 μM, 20 mM of 10 μM in serumvrij MEM7 (zie Materiaaltabel). De laatste twee remmers dienen als controle. Verdun een gelijk volume van het oplosmiddel (indien anders dan water) dat wordt gebruikt om een van de remmers als een mock in serumvrij medium te reconstitueren.
- Verwijder het virus entmateriaal en was de cellen zoals in stap 1.5 (1x).
- Voeg de serumvrije MEM, 1 ml/put, mock of aangevuld met een remmer, toe aan de cellen en incubeer de cellen zoals in stap 1.6. Dit tijdstip wordt beschouwd als 0 h infectie.
- Oogst na 24 uur de cellen door ze te schrapen met een 1 ml spuitzuiger (rubberen kant) en breng ze over in een polypropyleenbuis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het supernatant met een pipet.
OPMERKING: Dit supernatant kan worden weggegooid of worden gebruikt voor een plaquetest8 om de titer van het vrijgegeven virus nageslacht te meten. - Was de celpellet met 250 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door hercentrifugering zoals in stap 1.11.
- Verwijder het supernatant en lyseer de cellen door 80-100 μL cellysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% Triton X-100 en 1x proteaseremmercocktail toe te voegen, zie Materiaaltabel) en vortexing.
- Verwarm de buis gedurende 10 minuten op 98 °C om volledig te lyseren en bereid het totale cellysaat voor. Bewaar de lysaten bij 4 °C voor het uitvoeren van stappen 1.15-1.17 de volgende dag, maar voor het beste resultaat, voltooi deze stappen op dezelfde dag.
- Schat de eiwithoeveelheid in elk monster met behulp van een BCA-testkit (zie Materiaaltabel).
- Los gelijke hoeveelheden eiwit uit niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde monsters op door standaard SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE)11 samen met moleculaire gewichtsmarkers11.
- Breng het eiwit over naar een nitrocellulose- of polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan (zie Materiaal tabel).
OPMERKING: PVDF-membraan kan een hoge achtergrond geven in sommige western blot-imagers; controleer op compatibiliteit. - Voer western blotting uit om het eiwit van belang te detecteren met behulp van de elders beschreven methode11.
- Vergelijk de eiwitniveaus in de met mock behandelde en met remmers behandelde geïnfecteerde monsterstroken.
OPMERKING: Als het eiwitgehalte is hersteld in de met caspaseremmers behandelde geïnfecteerde monsterstrook, wordt het eiwit gesplitst of afgebroken door caspasen. Anders wordt het afgebroken door lysosoom of proteasoom. - Kwantificeer het eiwitherstel door de bandintensiteit in elke baan te meten van ten minste drie replicaties van hetzelfde experiment en deze te normaliseren met de overeenkomstige belastingscontroleband.
- Gebruik een hedendaagse imager en bijbehorende software (zie Tabel van materialen) om de western blots in beeld te brengen en het eiwitherstel te kwantificeren.
2. Bevestiging van caspase-gemedieerde splitsing of afbraak van eiwitten in IAV-geïnfecteerde cellen door RNA-interferentie
- Ontwerp of verkrijg een pre-design klein-interfererend RNA (siRNA) gericht op honden of menselijke caspase 3, caspase 6 en caspase 7 (beul caspases1) en een niet-gerichte controle siRNA (zie Materiaaltabel).
- Lever elk siRNA aan MDCK- of A549-cellen door omgekeerde transfectie 8,11.
- Verdun hiervoor in afzonderlijke buizen 100 nM controlesiRNA of caspase siRNA of een aanbevolen volume transfectiereagens (zie Materiaaltabel) in 100 μL geschikt medium (zoals OptiMEM, zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Bereid elke verdunning in tweevoud voor.
OPMERKING: Dit duplicaat bevat een replicaat voor het analyseren van de knockdown van caspase-expressie door RT-qPCR of western blotting (als antilichamen tegen caspasen beschikbaar zijn) en een andere voor het beoordelen van het herstel van het eiwit van belang door western blotting. - Meng 100 μL van elke siRNA-oplossing met 100 μL transfectiereagensoplossing (stap 2.3) en incubeer gedurende 20-45 minuten bij kamertemperatuur om het siRNA-transfectiereagenscomplex te vormen.
- Splits en voeg ondertussen 1 x 105 MDCK- of A549-cellen toe in 800 μL van het volledige groeimedium, meng met 200 μL siRNA-transfectiereagenscomplex (stap 2.5) en voeg 1 ml van de suspensie toe aan een put van een 12-wells kweekplaat. Deze verdunning brengt de uiteindelijke concentratie van controle siRNA of caspase siRNA op 10 nM.
- Incubeer de cellen bij 37 °C onder een 5% CO2 atmosfeer gedurende 72 uur.
- Oogst de cellen van één replicaat zoals in stap 1.10 en verwerk ze om de knockdown van de expressie van caspase 3, caspase 6 en caspase 7 te valideren of te bevestigen, respectievelijk door RT-qPCR of western blotting, met behulp van standaardmethoden en protocollen 8,11.
- Infecteer de cellen in de andere replicaat met IAV zoals beschreven in stap 1.4-1.9 (zonder remmers).
- Na 24 uur, oogst, verwerk en analyseer de cellen door western blotting en meet en kwantificeer het eiwitherstel zoals beschreven in stappen 1.10-1.20.
3. Plaatsgerichte mutagenese voor het lokaliseren van de caspase-splitsingsplaats(en) in het polypeptide
- Kloon het gencoderende eiwit dat van belang is voor een zoogdierexpressieplasmide11 of verkrijg het uit een onderzoekslaboratorium of commerciële bron (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Het heeft de voorkeur als het gen wordt gekloond met een epitooptag of als GFP-fusie om het ectopisch tot expressie gebrachte polypeptide te onderscheiden van het endogene tot expressie gebrachte polypeptide tijdens western blotting. - Met behulp van caspase-substraatdatabases4 of eiwituitlijningstools, lokaliseer je de consensus caspase-splitsingsmotieven, XXXD en DXXD, op het polypeptide. Bijna alle caspase cleavage motieven bezitten het asparaginezuur op de splitsingsplaats (P1)3,4.
- Muteer het vermeende P1-asparaginezuur tot glutaminezuur of een niet-polair aminozuur (alanine, valine) door plaatsgerichte mutagenese gevolgd door DNA-sequencing11 met behulp van standaardmethoden en protocollen.
- Lever het wild-type (WT) en mutant plasmide-DNA aan MDCK- of A549-cellen door omgekeerde transfectie11.
- Verdun hiervoor 2 μg plasmide-DNA of een aanbevolen volume van het transfectiereagens in 100 μL van een geschikt medium (zie stap 2.3 en Materiaaltabel) in afzonderlijke buizen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Meng 100 μL van elke plasmide-DNA-oplossing met 100 μL van de transfectiereagentia-oplossing en incubeer gedurende 20-45 minuten bij kamertemperatuur om het DNA-transfectiereagenscomplex te vormen.
- Splits in de tussentijd 3 x 105 MDCK- of A549-cellen aan 800 μL van het volledige groeimedium, meng met 200 μL DNA-transfectiereagenscomplex en voeg de 1 ml suspensie toe aan een put van een 12-well kweekplaat.
- Incubeer de cellen bij 37 °C onder een 5% CO2 atmosfeer.
- Infecteer na 48 uur de cellen met IAV zoals beschreven in stap 1.4-1.9 (zonder de remmers toe te voegen).
- Na 24 uur, oogst, verwerk en analyseer de cellen door western blotting (indien van toepassing, met behulp van het antilichaam tegen een epitoop tag of GFP). Meet en kwantificeer vervolgens het eiwitherstel zoals beschreven in stap 1.10-1.20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandeling met caspase 3-remmer
Er is ontdekt dat gastheer cortactine, HDAC4 en HDAC6 polypeptiden degradatie ondergaan als reactie op IAV-infectie in zowel honden (MDCK) als menselijke (A549, NHBE) cellen 7,8,9. Door de bovenstaande benaderingen te gebruiken, werd ontdekt dat IAV-geïnduceerde gastheer caspasen, met name caspase 3, hun afbraak 7,8,9 veroorzaken. Het cortactine werd afgebroken op een infectiedosis- en tijdsafhankelijke manier en een gastheercel- en IAV-stamonafhankelijke manier7. Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor HDAC48 en HDAC69. Interessant is dat de afbraak van alle drie de gastheereiwitten samenviel met de splitsing van virale NP 7,8,9, waarvan bekend is dat het caspase-gemedieerde splitsingondergaat 14. Er werd dus verondersteld dat cortactine, HDAC4 en HDAC6 ook caspase-gemedieerde splitsing en daaropvolgende afbraak ondergaan. Om dit te testen, werden eerst de IAV-geïnfecteerde cellen behandeld met een caspase 3-remmer en werd de redding van cortactine, HDAC4 en HDAC6-polypeptiden geanalyseerd door western blotting. Alle drie de polypeptiden (evenals virale NP) herstelden van de door de IAV-infectie geïnduceerde afbraak na behandeling met caspase 3-remmer 7,8,9. De representatieve gegevens7 voor cortactine zijn weergegeven in figuur 1A. Dit herstel werd gekwantificeerd door de intensiteit van eiwitbanden te meten en de waarde van de cortactineband te normaliseren met de waarde van de overeenkomstige actineband (belastingscontrole). Vervolgens werd de genormaliseerde waarde van cortactine in de overeenkomstige niet-geïnfecteerde monsters als 100% beschouwd om de waarde ervan in de geïnfecteerde monsters te bepalen. Deze kwantificeringsmethode was verantwoordelijk voor het herstel van cortactinepolypeptide in met caspase 3-remmers behandelde geïnfecteerde cellen als 78,8% van 20,7% in onbehandelde geïnfecteerde cellen7 (figuur 1B).
RNA-interferentie-gemedieerde knockdown van caspase 3-expressie
Vervolgens werd een genetisch hulpmiddel, RNA-interferentie (RNAi), gebruikt, gevolgd door western blotting om de rol van caspasen in door IAV-infectie geïnduceerde afbraak van cortactine11 en HDAC48 te bevestigen. In caspase 3-uitgeputte cellen (figuur 2C)11 herstelden zowel cortactine (figuur 2A)11 als HDAC48 polypeptiden van de door de IAV-infectie geïnduceerde afbraak. In caspase 6- of caspase 7-uitgeputte cellen (figuur 2C)11 werd echter geen significant herstel in cortiactinepolypeptideniveaus waargenomen (figuur 2A)11. In het bijzonder, wanneer gekwantificeerd en vergeleken met hun niveaus in overeenkomstige niet-geïnfecteerde cellen zoals hierboven vermeld, herstelde het cortiactinepolypeptideniveau in geïnfecteerde cellen met uitgeputte caspase 3-expressie tot 83% van 28,6% in geïnfecteerde cellen met normale caspase 3-expressie (figuur 2B) 11.
Caspase splitsingsmotieven in cortactine en HDAC6 polypeptiden
Ten slotte werd de aminozuursequentie in cortactine en HDAC6-polypeptiden gescreend en in vermeende caspase-splitsingsmotieven werd het asparaginezuur op de P1-positie gemuteerd tot glutaminezuur 9,11. Deze benadering identificeerde het asparaginezuur 116 in cortactine polypeptide11 en het asparaginezuur 1088 in HDAC6 polypeptide9 als een caspase splitsingsplaats. De mutatie van zowel asparaginezuurresiduen in glutaminezuur maakte de cortactine (figuur 3A)11 en HDAC69 polypeptiden resistent tegen door IAV-infectie geïnduceerde afbraak. Specifiek, wanneer gekwantificeerd en vergeleken met hun niveaus in overeenkomstige niet-geïnfecteerde cellen zoals hierboven vermeld, was het niveau van plasmide-tot expressie gebracht mutant cortactine polypeptide in geïnfecteerde cellen 77,9%, terwijl het niveau van plasmide-uitgedrukt wild-type cortactine polypeptide in geïnfecteerde cellen 23,6% was (figuur 3B) 11.
Figuur 1: Cortactine polypeptide ondergaat caspase 3-gemedieerde afbraak in IAV-geïnfecteerde cellen. (A) MDCK-cellen werden geïnfecteerd met influenzavirus A/ Nieuw-Caledonië / 20/1999 / H1N1 stam bij een MOI van 0,5 en vervolgens behandeld als mock of met caspase 3-remmer (Cas3-I, 40 μM). Na 24 uur werden de cortactine,virale NP en actine polypeptiden gedetecteerd in totale cellysaten door western blotting. UNI, niet geïnfecteerd; INF, besmet. Pijlen wijzen naar het np over de volledige lengte en de gesplitste np. (B) De intensiteit van cortactine- en actinebanden werd gekwantificeerd. Vervolgens werd de waarde van cortactine genormaliseerd met de waarde van actine. De genormaliseerde hoeveelheid cortactine in UNI-monsters werd als 100% beschouwd om de hoeveelheid ervan in de overeenkomstige INF-monsters te bepalen. De gepresenteerde gegevens zijn middelen ± ZO van drie biologische replicaties. P = 0,0006, berekend met behulp van tweeweg ANOVA. ns, niet significant. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Knockdown van caspase 3-expressie gered cortactine polypeptide afbraak in IAV-geïnfecteerde cellen. (A) A549 cellen werden getransfecteerd in duplicaten met 10 nM controle (Ctrl), caspase 3 (Cas3), caspase 6 (Cas6), of caspase 7 (Cas7) siRNA. Na 72 uur werden de cellen in één replicaat geoogst en verwerkt om totaal RNA te extraheren. De cellen in de andere replicaat waren geïnfecteerd met influenzavirus A/WSN/1933/H1N1 subtype bij een MOI van 3,0. Na 24 uur werden de cortactine, virale NP en actine polypeptiden gedetecteerd door western blotting. UNI, niet geïnfecteerd; INF, besmet. (B) De intensiteit van cortactine- en actinebanden werd gekwantificeerd en de waarde van cortactine werd genormaliseerd met de waarde van actine. Vervolgens werd de genormaliseerde hoeveelheid cortactine in de UNI-monsters als 100% beschouwd om de hoeveelheid in de overeenkomstige INF-monsters te bepalen. De gepresenteerde gegevens zijn middelen ± ZO van drie biologische replicaties. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, berekend met behulp van tweerichtings-ANOVA. ns, niet significant. (C) Totaal RNA dat hierboven werd geëxtraheerd, werd omgezet in cDNA, dat vervolgens werd gebruikt als een sjabloon om caspase 3, caspase 6, caspase 7 en actine mRNA-niveaus te detecteren door RT-qPCR. Het actine mRNA-niveau werd als referentie gebruikt en het mRNA-niveau van elke caspase in control siRNA (Ctrl) en respectievelijke caspase siRNA (Cas) getransfecteerde cellen werd berekend met behulp van de standaard 2−ΔΔCT-methode . P < 0,0001, berekend met behulp van tweeweg ANOVA. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Mutatie van asparaginezuur 116 in glutaminezuur maakte het cortactinepolypeptide resistent tegen door IAV-infectie geïnduceerde afbraak. (A) MDCK-cellen werden getransfecteerd met een plasmide dat de wild-type (WT) of gemuteerde (D116E) GFP-cortactinefusie tot expressie bracht. Na 48 uur werden cellen geïnfecteerd met influenzavirus A/WSN/1933/H1N1 subtype bij een MOI van 3,0. Na 24 uur werden de GFP-cortactine, virale NP en actine polypeptiden gedetecteerd door western blotting. UNI, niet geïnfecteerd; INF, besmet. (B) De intensiteit van cortactine- en actinebanden werd gekwantificeerd en de waarde van cortactine werd genormaliseerd met de waarde van actine. Vervolgens werd de genormaliseerde hoeveelheid cortactine in UNI-monsters als 100% beschouwd om de hoeveelheid in de overeenkomstige INF-monsters te bepalen. De gepresenteerde gegevens zijn middelen ± ZO van drie biologische replicaties. **P = 0,001, berekend met behulp van tweeweg ANOVA. ns, niet significant. Dit cijfer is aangepast van Chen et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is vastgesteld dat virussen de gastheerfactoren en -paden in hun voordeel afstemmen. Op hun beurt weerstaan de gastheercellen dat door verschillende strategieën toe te passen. Een van die strategieën is PANoptosis, die gastheercellen gebruiken als een antivirale strategie tegen virusinfecties. Virussen zoals IAV hebben echter hun eigen strategieën ontwikkeld om PANoptosis tegen te gaan en in hun voordeel te exploiteren 1,3,6. Dit samenspel omvat de splitsing van verschillende gastheer- en virale eiwitten door caspasen. Het identificeren van die caspasen en hun splitsingsplaatsen in substraateiwitten is belangrijk om de mechanismen en betekenis van een dergelijk samenspel op te helderen.
Hiertoe werden standaard biochemische en moleculaire methoden gebruikt om de caspasen en hun splitsingsplaatsen in gastheer cortactine, HDAC4 en HDAC6 7,8,9,11 te identificeren. De hierboven beschreven protocollen kunnen worden gebruikt voor dergelijke studies met influenzavirussen, andere zoogdiervirussen, andere microben en externe stimuli zoals toxines en chemicaliën. Bovendien kunnen deze methoden worden gerepliceerd in een standaard laboratorium voor moleculaire biologie met relevante vaardigheden en vereisen ze geen gespecialiseerde apparatuur en softwaretraining. Het 12-well celkweekplaatformaat werd met succes aangepast voor deze en soortgelijke studies om voldoende monsterhoeveelheden te genereren voor downstream-analyses door western blotting en RT-qPCR. Niettemin kan dit formaat, indien nodig, dienovereenkomstig worden verkleind of opgeschaald. Bij het voor het eerst uitvoeren van een experiment met een caspaseremmer, wordt voorgesteld om een pan-caspaseremmer (Z-VAD-FMK) naast een lysosoom- en proteasoomremmer te gebruiken om te beoordelen of het eiwit van belang caspase-gemedieerde afbraak ondergaat. Verder kunnen naast NH4Cl en MG132 andere lysosoom- en proteasoomremmers zoals respectievelijk Bafilomycine A en Epoxomicine worden gebruikt. Na positieve resultaten met een pan-caspaseremmer kunnen ofwel specifieke remmers van individuele caspasen worden gebruikt, ofwel RNA-interferentie worden gebruikt. Voor de eerste is het belangrijk om de effectieve remmende concentraties te optimaliseren om toxiciteit voor het doelceltype en niet-specifieke resultaten te voorkomen.
Een genetisch hulpmiddel zoals RNA-interferentie of CRISPR moet worden gebruikt om de betrokkenheid van caspasen te bevestigen, omdat remmers kruisreageren. Als alternatief kan een RNA-interferentie of CRISPR-scherm worden uitgevoerd dat individueel gericht is op alle bekende caspasen. De siRNA-, gRNA- en RT-qPCR-primerparen voor alle bekende caspasen kunnen worden aangeschaft als vooraf ontworpen of ontworpen met behulp van online tools. Bovendien kunnen twee of meer caspasen tegelijkertijd worden uitgeput om de sequentiële of coöperatieve splitsing van polypeptiden te beoordelen (deze strategie werd onlangs gebruikt in een nog te publiceren studie). RNA-interferentie wordt beschouwd als een ideaal hulpmiddel voor onderzoek naar virus-gastheercelinteractie. Dit laatste vereist een gecontroleerde manipulatie van gastheergenexpressie, zodat de gastheercellen relatief levensvatbaar blijven voor virusinfectie en voltooiing van de levenscyclus om het fenotype van die manipulatie weer te geven. Het optimaliseren van een effectieve siRNA-concentratie en siRNA-transfectiereagenscombinatie is echter nodig voor elk celtype voor een optimale knockdown- en levensvatbaarheidsverhouding voor daaropvolgende infectie.
Om de vermeende caspase-splitsingsmotieven te lokaliseren, zijn veel databases zoals CASBAH18, CaspDB19, CutDB20, DegraBase21, MEROPS22 en TopFIND23,24 ontwikkeld. Een visuele screening werd uitgevoerd om deze motieven op HDAC6 polypetide9 te lokaliseren, maar voor cortactine11 werd de CaspDB gebruikt (hoewel de CaspDB-website de laatste tijd ontoegankelijk is). Deze motieven werden met succes bevestigd als caspase-splitsingsplaatsen door het P1-asparaginezuur te muteren in glutaminezuur. Het muteren van het asparaginezuur naar een niet-polair aminozuurachtige alanine of valine wordt echter eerst voorgesteld omdat sommige caspasen kunnen splijten na P1 glutaminezuur4. Deze oefening kan onmiddellijk resulteren in de identificatie van caspase-splitsingsplaats (en), maar kan het genereren van tientallen mutanten vereisen als het doelpolypeptide rijk is aan asparaginezuren en de vermeende doelmotieven niet-canoniek zijn. Voor de levering van plasmiden (en siRNA) aan cellen kan voorwaartse in plaats van omgekeerde transfectie worden uitgevoerd. Verder moeten de infectiedosis en tijdkinetiek worden uitgevoerd met behulp van een 4% -20% gradiënt SDS-PAGE voor western blotting om de afbraakkinetiek van de polypeptiden te beoordelen en eventuele kleinere splitsingsproducten te identificeren. Ten slotte, om het eiwit van belang als een direct caspase-substraat te bevestigen, kunnen in vitro biochemische assays met gezuiverde caspasen en doeleiwitten (WT of mutant) en eventuele cofactoren worden ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteur erkent Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, de BEI Resources (NIAID), de Health Research Council van Nieuw-Zeeland, de Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nieuw-Zeeland), de H.S. en J.C. Anderson Trust (Dunedin), en de Afdeling Microbiologie en Immunologie en School of Biomedical Sciences (Universiteit van Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D.
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A.
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J.
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).
