Summary
A infecção pelo vírus da gripe A (IAV) ativa as caspases que clivam o hospedeiro e as proteínas virais, que, por sua vez, têm funções pró e antivirais. Empregando-se inibidores, interferência de RNA, mutagênese sítio-dirigida e técnicas de western blotting e RT-qPCR, foram identificadas caspases em células de mamíferos infectadas que clivam a cortactina do hospedeiro e as histonas desacetilases.
Abstract
Caspases, uma família de proteases de cisteína, orquestram a morte celular programada em resposta a vários estímulos, incluindo infecções microbianas. Inicialmente descrita como ocorrendo por apoptose, a morte celular programada é agora conhecida por abranger três vias interconectadas: piroptose, apoptose e necroptose, cunhadas juntas como um processo, PANoptose. Influência A infecção por vírus (IAV) induz a PANoptose em células de mamíferos, induzindo a ativação de diferentes caspases, que, por sua vez, clivam várias proteínas hospedeiras e virais, levando a processos como a ativação da resposta antiviral inata do hospedeiro ou a degradação de proteínas antagônicas do hospedeiro. A este respeito, a clivagem mediada pela caspase 3 da cortactina do hospedeiro, histona desacetilase 4 (HDAC4) e histona desacetilase 6 (HDAC6) foi descoberta em células epiteliais animais e humanas em resposta à infecção por IAV. Para demonstrar isso, foram empregados inibidores, interferência de RNA e mutagênese sítio-dirigida e, posteriormente, a clivagem ou resistência à clivagem e a recuperação dos polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram medidas por western blotting. Esses métodos, em conjunto com a RT-qPCR, formam uma estratégia simples, mas eficaz, para identificar o hospedeiro, bem como as proteínas virais submetidas à clivagem mediada pela caspase durante uma infecção por IAV ou outros vírus humanos e animais. O presente protocolo elabora os resultados representativos dessa estratégia, e também são discutidas as formas de torná-la mais eficaz.
Introduction
O vírus da gripe A (IAV) é o membro prototípico da família Orthomyxoviridae e é conhecido por causar epidemias globais e pandemias imprevisíveis. IAV causa doença respiratória humana, gripe, comumente conhecida como "gripe". A gripe é uma doença aguda que resulta na indução de respostas imunes inatas pró e anti-inflamatórias do hospedeiro e na morte de células epiteliais no trato respiratório humano. Ambos os processos são regidos por um fenômeno chamado morte celular programada1. A sinalização para a morte celular programada é induzida assim que vários receptores de reconhecimento de patógenos detectam as partículas virais recebidas nas células hospedeiras. Isso leva à programação da morte de células infectadas e à sinalização para as células saudáveis vizinhas por três vias interconectadas chamadas piroptose, apoptose e necroptose - recentemente cunhadas como um processo, PANoptose1.
A PANoptose envolve o processamento proteolítico de muitas proteínas hospedeiras e virais desde a indução até a execução. Esse processamento de proteínas é liderado principalmente por uma família de cisteínas proteases chamadas caspases 1,2. Até 18 caspases (da caspase 1 à caspase 18) são conhecidas3. A maioria das caspases é expressa como pró-caspases e ativada por meio de seu próprio processamento proteolítico por autocatálise ou outras caspases4 em resposta a um estímulo como uma infecção por vírus. Acreditava-se que a PANoptose de células infectadas por IAV fosse um mecanismo de defesa do hospedeiro, mas a IAV desenvolveu maneiras de evitá-la e explorá-la para facilitar sua replicação 1,2,5,6. Uma delas é antagonizar os fatores do hospedeiro por meio de clivagem ou degradação mediada por caspase que são inerentemente antivirais ou interferem em uma das etapas do ciclo de vida da IAV. Para esse fim, fatores do hospedeiro, cortactina, HDAC4 e HDAC6 foram descobertos como submetidos a clivagem ou degradação mediada por caspase em células epiteliais infectadas por IAV 7,8,9. O HDAC4 e o HDAC6 são fatores anti-IAV 8,10, e a cortactina interfere na replicação do IAV em um estágio posterior da infecção, potencialmente durante a montagem viral e brotamento 11.
Além disso, várias caspases também são ativadas, que, por sua vez, clivam múltiplas proteínas para ativar a resposta inflamatória do hospedeiro durante a infecção por IAV 1,2. Além disso, a nucleoproteína (NP), a proteína M2 do canal iônico da IAV 12,13,14 e várias proteínas de outros vírus 3,15,16 também sofrem clivagem mediada por caspase durante a infecção, o que influencia a patogênese viral. Portanto, há uma necessidade contínua de estudar a clivagem mediada pela caspase ou a degradação das proteínas do hospedeiro e virais durante a IAV e outras infecções virais para entender a base molecular da patogênese viral. Neste documento, os métodos são apresentados para (1) avaliar a clivagem ou degradação de tais proteínas por caspases, (2) identificar essas caspases e (3) localizar os locais de clivagem.
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Protocol
As aprovações regulatórias foram obtidas do Comitê de Segurança Biológica Institucional da Universidade de Otago para trabalhar com o IAV e as células de mamíferos. Rim Canino de Madin-Darby (MDCK) ou células A549 epiteliais alveolares pulmonares humanas e subtipos IAV H1N1 foram utilizados para o presente estudo. A VAI foi cultivada em ovos de galinha, conforme descrito em outroslugares 17. Condições estéreis e assépticas foram usadas para trabalhar com células de mamíferos, e uma instalação de Nível de Biossegurança 2 (ou Contenção Física 2) e um gabinete de biossegurança de Classe II foram usados para trabalhar com subtipos de IAV.
1. Avaliação da clivagem ou degradação de proteínas em células infectadas por IAV por caspases
- Sementes 3 x 105 células MDCK ou A549 por poço em uma placa de cultura celular de 12 poços.
NOTA: Se estiver usando células MDCK, certifique-se de que o anticorpo contra a proteína de interesse reconheça sua espécie canina. - Semeia os poços em pares, ou seja, um par de controle - um poço para a amostra simulada não infectada e um para a amostra simulada infectada - e um par de teste - um poço para a amostra A de inibidor não infectado e um para a amostra A do inibidor infectado. Aumentar o número de pares com cada inibidor adicional (ver referências 7,8).
- Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, infecte as células com IAV (um subtipo H1N1 ou outro subtipo).
- Para tal, preparar o inóculo do vírus diluindo o stock do vírus em 400 μL de meio essencial mínimo (MEM) isento de soro (ver Tabela de Materiais) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placas (pfu)/célula 7,11 (um fator da duplicação do número de células no cálculo do MOI).
NOTA: Para infectar células MDCK, complementar o inóculo do vírus com tosilfenilalanil clorometil cetona (TPCK)-tripsina a uma concentração final de 1 μg/mL.
- Para tal, preparar o inóculo do vírus diluindo o stock do vírus em 400 μL de meio essencial mínimo (MEM) isento de soro (ver Tabela de Materiais) a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placas (pfu)/célula 7,11 (um fator da duplicação do número de células no cálculo do MOI).
- Retirar o meio de cultura antigo das células (passo 1.3) e lavar as células com 1 ml/poço de MEM 2x sem soro.
- Adicionar 400 μL de inóculo virado (etapa 1.4.1) às células e incubá-las durante 1 h a 35 °C sob uma atmosfera de CO2 a 5%.
- Enquanto isso, dilua um inibidor da caspase (por exemplo, Z-DEVD-FMK), um inibidor do lisossomo (por exemplo, NH4Cl) ou um inibidor do proteassoma (por exemplo, MG132) (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 40 μM, 20 mM ou 10 μM, respectivamente, na MEM7 livre de soro (ver Tabela de Materiais). Os dois últimos inibidores servem como controle. Diluir um volume igual do solvente (se não for água) utilizado para reconstituir um dos inibidores em meio isento de soro como simulação.
- Remova o inóculo do vírus e lave as células como na etapa 1.5 (1x).
- Adicione o MEM sem soro, 1 mL/poço, simulado ou suplementado com um inibidor, às células e incube as células como na etapa 1.6. Este ponto de tempo é considerado como 0 h de infecção.
- Após 24 h, colha as células raspando-as com um êmbolo de seringa de 1 mL (lado da borracha) e transfira-as para um tubo de polipropileno de 1,5 mL.
- Centrifugar o tubo a 12.000 x g durante 1-2 min à temperatura ambiente. Colete o sobrenadante usando uma pipeta.
NOTA: Este sobrenadante pode ser descartado ou usado para um ensaio de placa8 para medir o título da progênie do vírus liberado. - Lavar o pellet celular com 250 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por recentrifugação, como indicado no passo 1.11.
- Remova o sobrenadante e lise as células adicionando 80-100 μL de tampão de lise celular (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X-100 e 1x coquetel de inibidores de protease, ver Tabela de Materiais) e vórtice.
- Aqueça o tubo a 98 °C durante 10 minutos para lisar completamente e preparar o lisado total das células. Armazene os lisados a 4 °C para executar as etapas 1.15-1.17 no dia seguinte, mas, para obter melhores resultados, termine essas etapas no mesmo dia.
- Estimar a quantidade de proteína em cada amostra usando um kit de ensaio de BCA (consulte Tabela de Materiais).
- Resolver quantidades iguais de proteína de amostras não infectadas e infectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida padrão (SDS-PAGE)11 juntamente com marcadores de peso molecular 11.
- Transfira a proteína para uma membrana de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: A membrana PVDF pode fornecer um fundo alto em alguns imageadores de western blot; verifique a compatibilidade. - Realizar western blotting para detectar a proteína de interesse utilizando o método descrito em outro lugar11.
- Compare os níveis de proteína nas faixas de amostra infectadas tratadas com simulação e tratamento com inibidor.
NOTA: Se o nível de proteína se recuperou na faixa de amostra infectada tratada com inibidor de caspase, a proteína é clivada ou degradada por caspases. Caso contrário, é degradado por lisossomo ou proteassoma. - Quantifique a recuperação de proteínas medindo sua intensidade de banda em cada pista a partir de pelo menos três repetições do mesmo experimento e normalizando-a com a banda de controle de carga correspondente.
- Use qualquer imageador contemporâneo e software associado (consulte Tabela de Materiais) para obter imagens das manchas ocidentais e quantificar a recuperação de proteínas.
2. Confirmação de clivagem mediada por caspase ou degradação de proteínas em células infectadas por IAV por interferência de RNA
- Projetar ou obter um RNA de pequena interferência (siRNA) pré-projeto visando a caspase 3 canina ou humana, a caspase 6 e a caspase 7 (caspases1 do executor) e um siRNA de controle não direcionado (ver Tabela de Materiais).
- Entregar cada siRNA às células MDCK ou A549 por transfecção reversa 8,11.
- Para isso, diluir em tubos separados 100 nM de siRNA de controle ou siRNA de caspase ou um volume recomendado de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de meio apropriado (como OptiMEM, ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
- Preparar cada diluição em duplicado.
NOTA: Esta duplicata inclui uma réplica para analisar o knockdown da expressão de caspase por RT-qPCR ou western blotting (se anticorpos para caspases estiverem disponíveis) e outra para avaliar a recuperação da proteína de interesse por western blotting. - Misturar 100 μL de cada solução de siRNA com 100 μL de solução reagente de transfecção (passo 2.3) e incubar durante 20-45 min à temperatura ambiente para formar o complexo reagente de transfecção de siRNA.
- Enquanto isso, dividir e adicionar 1 x 10 5 células MDCK ou A549 em 800 μL do meio de crescimento completo, misturar com 200 μL de complexo reagente de transfecção de siRNA (etapa2.5 ) e adicionar 1 mL da suspensão a um poço de uma placa de cultura de 12 poços. Esta diluição eleva a concentração final de siRNA de controlo ou siRNA de caspase para 10 nM.
- Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de CO2 a 5% durante 72 h.
- Colher as células de uma replicação, como na etapa 1.10, e processá-las para validar ou confirmar a derrubada da expressão de caspase 3, caspase 6 e caspase 7 por RT-qPCR ou western blotting, respectivamente, usando métodos e protocolos padrão 8,11.
- Infecte as células na outra réplica com IAV, conforme descrito nas etapas 1.4-1.9 (sem inibidores).
- Após 24 h, colhe, processe e analise as células por western blotting e meça e quantifique a recuperação de proteínas, conforme descrito nas etapas 1.10-1.20.
3. Mutagênese dirigida ao local para localizar o(s) sítio(s) de clivagem da caspase no polipeptídeo
- Clone a proteína codificadora de genes de interesse em um plasmídeo de expressão de mamíferos11 ou obtenha-a de um laboratório de pesquisa ou fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
NOTA: É preferível que o gene seja clonado com uma etiqueta de epítopo ou como fusão de GFP para distinguir o polipeptídeo expresso ectopicamente do expresso endogenamente durante o western blotting. - Usando bancos de dados de substrato de caspase4 ou ferramentas de alinhamento de proteínas, localize os motivos de clivagem de caspase de consenso, XXXD e DXXD, no polipeptídeo. Quase todos os motivos de clivagem da caspase possuem o ácido aspártico no local da clivagem (P1)3,4.
- Mutar o ácido aspártico P1 putativo em ácido glutâmico ou um aminoácido não polar (alanina, valina) por mutagênese sítio-dirigida seguida de sequenciamento de DNA11 usando métodos e protocolos padrão.
- Entregar o DNA plasmidial do tipo selvagem (WT) e mutante às células MDCK ou A549 por transfecção reversa11.
- Para tal, diluir 2 μg de ADN plasmídico ou um volume recomendado do reagente de transfecção em 100 μL de um meio adequado (ver passo 2.3 e Tabela de Materiais) em tubos separados e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Misture 100 μL de cada solução de DNA plasmídico com 100 μL da solução reagente de transfecção e incube por 20-45 min à temperatura ambiente para formar o complexo reagente de transfecção de DNA.
- Enquanto isso, divida e adicione 3 x 105 células MDCK ou A549 a 800 μL do meio de crescimento completo, misture com 200 μL do complexo reagente de transfecção de DNA e adicione a suspensão de 1 mL a um poço de uma placa de cultura de 12 poços.
- Incubar as células a 37 °C sob uma atmosfera de CO2 a 5%.
- Após 48 h, infectar as células com IAV, conforme descrito nas etapas 1.4-1.9 (sem adicionar os inibidores).
- Após 24 h, colhe, processe e analise as células por western blotting (se aplicável, usando o anticorpo para uma etiqueta de epítopo ou GFP). Em seguida, meça e quantifique a recuperação da proteína, conforme descrito nas etapas 1.10-1.20.
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Representative Results
Tratamento com inibidor da caspase 3
Verificou-se que os polipeptídeos cortactina, HDAC4 e HDAC6 do hospedeiro sofrem degradação em resposta à infecção por IAV em células caninas (MDCK) e humanas (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizando as abordagens acima, descobriu-se que as caspases do hospedeiro induzidas por IAV, particularmente a caspase 3, causam sua degradação 7,8,9. A cortactina foi degradada de forma dependente da dose e do tempo da infecção e de forma independente da cepa das células hospedeiras e do IAV7. Resultados semelhantes foram obtidos para HDAC48 e HDAC69. Curiosamente, a degradação de todas as três proteínas hospedeiras coincidiu com a clivagem da NP viral 7,8,9, que é conhecida por sofrer clivagem mediada por caspase14. Assim, hipotetizou-se que a cortactina, HDAC4 e HDAC6 também sofrem clivagem mediada por caspase e subsequente degradação. Para testar isso, primeiro, as células infectadas por IAV foram tratadas com um inibidor da caspase 3, e o resgate dos polipeptídeos de cortactina, HDAC4 e HDAC6 foi analisado por western blotting. Todos os três polipeptídeos (assim como o NP viral) se recuperaram da degradação induzida pela infecção por IAV após o tratamento com inibidor da caspase 3 7,8,9. Os dadosrepresentativos 7 para a cortactina são mostrados na Figura 1A. Essa recuperação foi quantificada medindo-se a intensidade das bandas proteicas e normalizando-se o valor da banda de cortactina pelo valor da banda de actina (controle de carga) correspondente. Posteriormente, o valor normalizado de cortactina nas amostras não infectadas correspondentes foi considerado 100% para determinar seu valor nas amostras infectadas. Esse método de quantificação contabilizou a recuperação do polipeptídeo de cortactina em células infectadas tratadas com inibidor da caspase 3 em 78,8% de 20,7% em células infectadas não tratadas7 (Figura 1B).
knockdown mediado por interferência de RNA da expressão da caspase 3
Em seguida, uma ferramenta genética, a interferência de RNA (RNAi), foi empregada, seguida de western blotting para confirmar o papel das caspases na degradação induzida pela infecção por IAV da cortactina11 e HDAC48. Nas células empobrecidas com caspase 3 (Figura 2C)11, os polipeptídeos cortactina (Figura 2A)11 e HDAC48 se recuperaram da degradação induzida pela infecção por IAV. Entretanto, nas células depletadas de caspase 6 ou caspase 7 (Figura 2C)11, não foi observada recuperação significativa nos níveis de polipeptídeo de cortactina (Figura 2A)11. Especificamente, quando quantificado e comparado aos seus níveis em células não infectadas correspondentes, como mencionado acima, o nível de polipeptídeo de cortactina em células infectadas com expressão de caspase 3 esgotada recuperou para 83% de 28,6% em células infectadas com expressão normal de caspase 3 (Figura 2B)11.
Motivos de clivagem de caspase em polipeptídeos de cortactina e HDAC6
Finalmente, a sequência de aminoácidos em polipeptídeos cortactina e HDAC6 foi rastreada e, em motivos de clivagem de caspase putativa, o ácido aspártico na posição P1 foi mutado para ácido glutâmico 9,11. Esta abordagem identificou o ácido aspártico 116 no polipeptídeo de cortactina11 e o ácido aspártico 1088 no polipeptídeoHDAC6 9 como um local de clivagem da caspase. A mutação de ambos os resíduos de ácido aspártico em ácido glutâmico tornou os polipeptídeos cortactina (Figura 3A)11 e HDAC69 resistentes à degradação induzida pela infecção por IAV. Especificamente, quando quantificado e comparado aos seus níveis em células não infectadas correspondentes, como mencionado acima, o nível de polipeptídeo de cortactina mutante expresso por plasmídeo em células infectadas foi de 77,9%, enquanto o nível de polipeptídeo de cortactina do tipo selvagem expresso por plasmídeo em células infectadas foi de 23,6% (Figura 3B)11.
Figura 1: Polipeptídeo de cortactina sofre degradação mediada por caspase 3 em células infectadas por IAV. (A) As células MDCK foram infectadas com a cepa do vírus influenza A/Nova Caledônia/20/1999/H1N1 a um MOI de 0,5 e posteriormente tratadas como simuladas ou com inibidor da caspase 3 (Cas3-I, 40 μM). Após 24 h, os polipeptídeos cortactina, NP viral e actina foram detectados em lisados celulares totais por western blotting. UNI, não infectado; INF, infectado. As setas apontam para o NP de comprimento total e clivado. (B) A intensidade das bandas de cortactina e actina foi quantificada. Em seguida, o valor de cortactin foi normalizado com o valor de actina. A quantidade normalizada de cortactina nas amostras de UNI foi considerada 100% para determinar sua quantidade nas amostras INF correspondentes. Os dados apresentados são médias ± SE de três replicações biológicas. P = 0,0006, calculado por ANOVA bidirecional. ns, não significativo. Esse número foi modificado a partir de Chen et al.7. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Knockdown da expressão da caspase 3 resgatou a degradação do polipeptídeo de cortactina em células infectadas por IAV. (A) As células A549 foram transfectadas em duplicatas com 10 nM de controle (Ctrl), caspase 3 (Cas3), caspase 6 (Cas6) ou caspase 7 (Cas7) siRNA. Após 72 h, as células em uma única repetição foram colhidas e processadas para extração de RNA total. As células do outro replicado foram infectadas com o subtipo A/WSN/1933/H1N1 do vírus influenza a um MOI de 3,0. Após 24 h, os polipeptídeos cortactina, NP viral e actina foram detectados por western blotting. UNI, não infectado; INF, infectado. (B) A intensidade das bandas de cortactina e actina foi quantificada, e o valor de cortactina foi normalizado com o valor de actina. Em seguida, a quantidade normalizada de cortactina nas amostras de UNI foi considerada 100% para determinar sua quantidade nas amostras INF correspondentes. Os dados apresentados são médias ± SE de três replicações biológicas. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, calculado usando ANOVA bidirecional. ns, não significativo. (C) O RNA total extraído acima foi convertido em cDNA, que foi então usado como molde para detectar os níveis de mRNA de caspase 3, caspase 6, caspase 7 e actina por RT-qPCR. O nível de mRNA da actina foi utilizado como referência, e o nível de mRNA de cada caspase em células transfectadas de siRNA controle (Ctrl) e respectivo siRNA de caspase (Cas) foi calculado pelo método padrão 2−ΔΔCT. P < 0,0001, calculado usando ANOVA bidirecional. Esse número foi modificado a partir de Chen et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A mutação do ácido aspártico 116 para ácido glutâmico tornou o polipeptídeo de cortactina resistente à degradação induzida pela infecção por IAV. (A) As células MDCK foram transfectadas com um plasmídeo expressando a fusão GFP-cortactina do tipo selvagem (WT) ou mutada (D116E). Após 48 h, as células foram infectadas com o subtipo A/WSN/1933/H1N1 do vírus influenza a um MOI de 3,0. Após 24 h, os polipeptídeos GFP-cortactina, NP viral e actina foram detectados por western blotting. UNI, não infectado; INF, infectado. (B) A intensidade das bandas de cortactina e actina foi quantificada, e o valor de cortactina foi normalizado com o valor de actina. Em seguida, a quantidade normalizada de cortactina em amostras de UNI foi considerada 100% para determinar sua quantidade nas amostras INF correspondentes. Os dados apresentados são médias ± SE de três replicações biológicas. **P = 0,001, calculado usando ANOVA bidirecional. ns, não significativo. Esse número foi modificado a partir de Chen et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Está estabelecido que os vírus adaptam os fatores e vias do hospedeiro para seu benefício. Por sua vez, as células hospedeiras resistem a isso, empregando várias estratégias. Uma dessas estratégias é a PANoptosis, que as células hospedeiras usam como estratégia antiviral contra infecções por vírus. No entanto, vírus como o IAV desenvolveram suas próprias estratégias para combater a PANoptose e explorá-la a seu favor 1,3,6. Essa interação envolve a clivagem de várias proteínas hospedeiras e virais por caspases. A identificação dessas caspases e seus locais de clivagem nas proteínas do substrato é importante para elucidar os mecanismos e o significado dessa interação.
Para tanto, foram utilizados métodos bioquímicos e moleculares padrão para identificar as caspases e seus sítios de clivagem na cortactina hospedeira, HDAC4 e HDAC6 7,8,9,11. Os protocolos descritos acima podem ser usados para tais estudos envolvendo vírus da gripe, outros vírus de mamíferos, outros micróbios e estímulos externos, como toxinas e produtos químicos. Além disso, esses métodos podem ser replicados em um laboratório de biologia molecular padrão com habilidades pertinentes e não exigem treinamento especializado em equipamentos e software. O formato de placa de cultura celular de 12 poços foi adaptado com sucesso para esses e estudos similares para gerar quantidades de amostra suficientes para análises a jusante por western blotting e RT-qPCR. No entanto, conforme necessário, esse formato pode ser reduzido ou ampliado de acordo. Ao fazer um experimento envolvendo um inibidor de caspase pela primeira vez, o uso de um inibidor de pan-caspase (Z-VAD-FMK) ao lado de um inibidor de lisossomo e proteassoma é sugerido para avaliar se a proteína de interesse sofre degradação mediada por caspase. Além disso, além do NH4Cl e MG132, outros inibidores de lisossomo e proteassoma como Bafilomicina A e Epoxomicina, respectivamente, podem ser usados. Após resultados positivos com um inibidor da pan-caspase, inibidores específicos de caspases individuais podem ser usados, ou a interferência de RNA pode ser empregada. Para o primeiro, é importante otimizar as concentrações inibitórias efetivas para evitar toxicidade para o tipo de célula-alvo e resultados não específicos.
Uma ferramenta genética como a interferência de RNA ou CRISPR deve ser empregada ao lado para confirmar o envolvimento de caspases porque os inibidores reagem cruzadamente. Alternativamente, uma interferência de RNA ou tela CRISPR visando individualmente todas as caspases conhecidas pode ser realizada. Os pares de iniciadores siRNA, gRNA e RT-qPCR para todas as caspases conhecidas podem ser adquiridos como pré-projetados ou projetados usando ferramentas on-line. Além disso, duas ou mais caspases podem ser esgotadas simultaneamente para avaliar a clivagem sequencial ou cooperativa de polipeptídeos (essa estratégia foi usada recentemente em um estudo ainda a ser publicado). Acredita-se que a interferência de RNA seja uma ferramenta ideal para a pesquisa da interação vírus-célula hospedeira. Este último requer uma manipulação controlada da expressão gênica do hospedeiro para que as células hospedeiras permaneçam relativamente viáveis para a infecção pelo vírus e a conclusão do ciclo de vida para exibir o fenótipo dessa manipulação. No entanto, a otimização de uma concentração efetiva de siRNA e a combinação de reagentes de transfecção de siRNA são necessárias para cada tipo de célula para uma ótima relação de knockdown e viabilidade para infecção subsequente.
Para localizar os supostos motivos de clivagem caspase, muitos bancos de dados como CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS22 e TopFIND23,24 foram desenvolvidos. Uma triagem visual foi realizada para localizar esses motivos no polipeteto9 HDAC6, mas para a cortactina11, o CaspDB foi usado (embora o site do CaspDB tenha sido inacessível ultimamente). Esses motivos foram confirmados com sucesso como locais de clivagem da caspase pela mutação do ácido aspártico P1 em ácido glutâmico. No entanto, a mutação do ácido aspártico para uma alanina ou valina amilana, semelhante a um aminoácido não polar, é sugerida primeiro, porque algumas caspases podem clivar após o ácido glutâmico P14. Este exercício pode resultar prontamente na identificação do(s) local(is) de clivagem da caspase, mas pode exigir a geração de dezenas de mutantes se o polipeptídeo alvo for rico em ácidos aspárticos e os motivos alvo putativos não forem canônicos. Para a entrega de plasmídeos (e siRNA) às células, a transfecção para a frente, em vez de reverter, pode ser realizada. Além disso, a dose de infecção e a cinética de tempo devem ser realizadas usando um gradiente SDS-PAGE de 4%-20% para western blotting para avaliar a cinética de degradação dos polipeptídeos e identificar quaisquer produtos de clivagem de tamanho menor. Finalmente, para confirmar a proteína de interesse como substrato direto da caspase, ensaios bioquímicos in vitro contendo caspases purificadas e proteínas-alvo (WT ou mutantes) e quaisquer cofatores poderiam ser desenvolvidos.
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Disclosures
O autor não tem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
O autor reconhece Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), o Health Research Council of New Zealand, o Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nova Zelândia), o H.S. e J.C. Anderson Trust (Dunedin) e o Departamento de Microbiologia e Imunologia e Escola de Ciências Biomédicas (Universidade de Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
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