Summary
甲型流感病毒（IAV）感染激活半胱天冬酶，切割宿主和病毒蛋白，而宿主和病毒蛋白又具有促病毒和抗病毒功能。通过使用抑制剂、RNA干扰、定点诱变以及蛋白质印迹和RT-qPCR技术，鉴定了受感染哺乳动物细胞中切割宿主皮质肌动蛋白和组蛋白脱乙酰酶的半胱天冬酶。
Abstract
半胱天冬酶是半胱氨酸蛋白酶家族，协调程序性细胞死亡以响应各种刺激，包括微生物感染。最初描述为由细胞凋亡发生，现在已知程序性细胞死亡包括三种相互关联的途径：焦亡，细胞凋亡和坏死性凋亡，共同创造为一个过程，即PANoptosis。影响 病毒（IAV）感染通过诱导不同半胱天冬酶的激活来诱导哺乳动物细胞中的PANoptosis，而半胱天冬酶又会切割各种宿主和病毒蛋白，从而导致宿主先天抗病毒反应的激活或拮抗宿主蛋白的降解等过程。在这方面，在动物和人类上皮细胞中发现了半胱天冬酶 3 介导的宿主皮质素、组蛋白脱乙酰酶 4 （HDAC4） 和组蛋白脱乙酰化酶 6 （HDAC6） 的切割，以响应 IAV 感染。为了证明这一点，采用了抑制剂、RNA干扰和定点诱变，随后通过蛋白质印迹测量了皮质素、HDAC4和HDAC6多肽的切割或抗性以及皮质素、HDAC4和HDAC6多肽的回收率。这些方法与RT-qPCR相结合，形成了一种简单而有效的策略，用于鉴定宿主以及在IAV或其他人类和动物病毒感染期间经历半胱天冬酶介导的切割的病毒蛋白。本议定书阐述了该战略的代表性结果，并讨论了使其更有效的方法。
Introduction
甲型流感病毒（IAV）是 正粘病毒科 的原型成员，已知会引起全球流行病和不可预测的大流行。IAV引起人类呼吸道疾病，流感，俗称“流感”。流感是一种急性疾病，可导致宿主促炎和抗炎先天免疫反应的诱导以及人类呼吸道中上皮细胞的死亡。这两个过程都受到一种称为程序性细胞死亡1的现象的支配。一旦各种病原体识别受体感知宿主细胞中传入的病毒颗粒，就会诱导程序性细胞死亡的信号传导。这导致通过三种相互关联的途径（称为焦亡，凋亡和坏死性凋亡）对感染细胞的死亡进行编程，并向邻近的健康细胞发出信号 - 最近被创造为一个过程，PANoptosis1。
全细胞凋亡涉及许多宿主和病毒蛋白从诱导到执行的蛋白水解加工。蛋白质的这种加工主要由称为半胱天冬酶1，2的半胱氨酸蛋白酶家族带头。已知多达18种半胱天冬酶（从半胱天冬酶1到半胱天冬酶18）3。大多数半胱天冬酶表达为半胱天冬酶原，并通过自催化或其他半胱天冬酶4进行自身的蛋白水解处理来激活，以响应病毒感染等刺激。IAV感染细胞的PANoptosis被认为是宿主防御机制，但IAV已经进化出逃避和利用它以促进其复制的方法1，2，5，6。其中之一是通过半胱天冬酶介导的裂解或降解来拮抗宿主因子，这些切割或降解要么具有固有的抗病毒作用，要么干扰IAV生命周期的一个步骤。为此，已发现宿主因子皮质素、HDAC4 和 HDAC6 在 IAV 感染的上皮细胞中经历半胱天冬酶介导的切割或降解7，8，9。HDAC4 和 HDAC6 是抗 IAV 因子8，10，皮质肌动蛋白在感染后期干扰 IAV 复制，可能在病毒组装和出芽期间干扰IAV 复制 11。
此外，各种半胱天冬酶也被激活，反过来，它们又切割多种蛋白质以激活IAV感染期间的宿主炎症反应1，2。此外，核蛋白（NP）、IAV 12，13，14的离子通道M2蛋白和其他病毒3，15，16的各种蛋白质在感染过程中也经历半胱天冬酶介导的切割，这会影响病毒发病机制。因此，需要持续研究半胱天冬酶介导的IAV和其他病毒感染过程中宿主和病毒蛋白的切割或降解，以了解病毒发病机制的分子基础。本文介绍了以下方法：（1）评估半胱天冬酶对这些蛋白质的切割或降解，（2）鉴定这些半胱天冬酶，以及（3）定位切割位点。
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Protocol
奥塔哥大学机构生物安全委员会获得了监管部门的批准，与IAV和哺乳动物细胞合作。本研究使用Madin-Darby犬肾（MDCK）或人肺泡上皮A549细胞和IAV H1N1亚型。IAV是在鸡蛋中生长的，如其他地方所述17。无菌和无菌条件用于处理哺乳动物细胞，生物安全2级（或物理遏制2）设施和II类生物安全柜用于处理IAV亚型。
1. 评估半胱天冬酶对IAV感染细胞中蛋白质的切割或降解
- 在 12 孔细胞培养板中每孔接种 3 x 105 个 MDCK 或 A549 细胞。
注意：如果使用MDCK细胞，请确保针对目标蛋白的抗体识别其犬种。 - 成对播种孔，即对照对 - 一个用于未感染的模拟样品，一个用于感染的模拟样品 - 以及一个测试对 - 一个用于未感染的抑制剂A样品和一个用于感染的抑制剂A样品。增加每个附加抑制剂的对数（参见参考文献7，8）。
- 将细胞在37°C的5%CO2 气氛下孵育过夜。
- 第二天，用IAV（H1N1亚型或其他亚型）感染细胞。
- 为此，通过将病毒原液稀释在 400 μL 无血清最低必需培养基 （MEM）（参见 材料表）中，以 0.5-3.0 斑块形成单位 （pfu）/细胞7，11 的感染倍数 （MOI）（计算 MOI 时细胞数加倍的因素）稀释病毒接种物。
注意：为了感染MDCK细胞，用终浓度为1μg/ mL的甲苯丙酰氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶补充病毒接种物。
- 为此，通过将病毒原液稀释在 400 μL 无血清最低必需培养基 （MEM）（参见 材料表）中，以 0.5-3.0 斑块形成单位 （pfu）/细胞7，11 的感染倍数 （MOI）（计算 MOI 时细胞数加倍的因素）稀释病毒接种物。
- 从细胞中取出旧培养基（步骤1.3），并用1 mL /孔的无血清MEM 2x洗涤细胞。
- 向细胞中加入400μL病毒接种物（步骤1.4.1），并在5%CO2 气氛下于35°C孵育1小时。
- 同时，在无血清MEM7中分别以40μM，20mM或10μM的终浓度稀释半胱天冬酶抑制剂（例如Z-DEVD-FMK），溶酶体抑制剂（例如NH4Cl）或蛋白酶体抑制剂（例如MG132）（参见材料表）。后两种抑制剂用作对照。稀释等体积的溶剂（如果不是水），用于在无血清培养基中重建其中一种抑制剂作为模拟。
- 取出病毒接种物并按照步骤1.5（1x）洗涤细胞。
- 将无血清MEM，1mL /孔，模拟或补充抑制剂，添加到细胞中，如步骤1.6所示孵育细胞。该时间点被视为0小时感染。
- 24小时后，通过用1mL注射器柱塞（橡胶侧）刮取细胞并将其转移到1.5mL聚丙烯管中来收获细胞。
- 在室温下以12，000× g 离心管1-2分钟。使用移液管收集上清液。
注意：该上清液可以丢弃或用于斑块测定8 ，以测量释放的病毒后代的滴度。 - 用 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞沉淀，如步骤 1.11 中所示。
- 除去上清液并通过加入 80-100 μL 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4、150 mM NaCl、0.5% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、0.5% 脱氧胆酸钠、1% Triton X-100 和 1x 蛋白酶抑制剂混合物，参见 材料表）和涡旋来裂解细胞。
- 将管在98°C下加热10分钟以完全裂解并制备总细胞裂解物。将裂解物储存在4°C，以便在第二天执行步骤1.15-1.17，但为了获得最佳结果，请在同一天完成这些步骤。
- 使用BCA检测试剂盒估计每个样品中的蛋白质量（参见 材料表）。
- 通过标准 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）11 以及分子量标记物11 分离未感染和感染样品中等量的蛋白质。
- 将蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（见 材料表）。
注意：PVDF膜在某些蛋白质印迹成像仪中可能会产生高背景;检查兼容性。 - 使用其他地方描述的方法进行蛋白质免疫印迹以检测目标蛋白11。
- 比较模拟处理和抑制剂处理的感染样品泳道中的蛋白质水平。
注意：如果蛋白质水平在半胱天冬酶抑制剂处理的感染样品泳道中恢复，则蛋白质被半胱天冬酶切割或降解。否则，它被溶酶体或蛋白酶体降解。 - 通过测量同一实验至少三次重复的每个泳道中的条带强度并用相应的上样对照条带对其进行归一化来量化蛋白质回收率。
- 使用任何现代成像仪和相关软件（参见 材料表）对蛋白质印迹进行成像并量化蛋白质回收率。
2. 通过RNA干扰确认半胱天冬酶介导的切割或IAV感染细胞中蛋白质的降解
- 设计或获得预先设计的针对犬或人半胱天冬酶3、半胱天冬酶6和半胱天冬酶7（刽子手半胱天冬酶1）的小干扰RNA（siRNA）和非靶向对照siRNA（参见 材料表）。
- 通过反向转染将每个siRNA递送到MDCK或A549细胞8，11。
- 为此，在单独的管中稀释100nM的对照siRNA或半胱天冬酶siRNA或推荐体积的转染试剂（参见材料表）在100μL适当的培养基（如OptiMEM，参见材料表），并在室温下孵育5分钟。
- 准备每个稀释液一式两份。
注意：该副本包括一个重复，用于分析通过RT-qPCR或蛋白质印迹敲低半胱天冬酶表达（如果有半胱天冬酶抗体），另一个用于评估通过蛋白质印迹评估目标蛋白的回收率。 - 将 100 μL 每种 siRNA 溶液与 100 μL 转染试剂溶液（步骤 2.3）混合，并在室温下孵育 20-45 分钟以形成 siRNA-转染试剂复合物。
- 同时，在 800 μL 的完整生长培养基中拆分并加入 1 x 10 5 MDCK 或 A549 细胞，与 200 μL siRNA 转染试剂复合物混合（步骤2.5 ），并将 1 mL 悬浮液加入 12 孔培养板的孔中。这种稀释使对照siRNA或半胱天冬酶siRNA的最终浓度达到10nM。
- 将细胞在37°C下在5%CO2 气氛下孵育72小时。
- 如步骤1.10所示从一个重复中收获细胞，并分别使用标准方法和方案8，11通过RT-qPCR或蛋白质印迹验证或确认半胱天冬酶3，半胱天冬酶6和半胱天冬酶7的表达。
- 如步骤1.4-1.9（无抑制剂）中所述，用IAV感染另一个重复中的细胞。
- 24小时后，通过蛋白质印迹收获，处理和分析细胞，并如步骤1.10-1.20所述测量和定量蛋白质回收率。
3. 用于定位多肽中半胱天冬酶裂解位点的定点诱变
- 克隆哺乳动物表达质粒11 中感兴趣的基因编码蛋白，或从研究实验室或商业来源获得（见 材料表）。
注意：如果用表位标签克隆基因或作为GFP融合，则首选基因以区分异位表达的多肽和蛋白质印迹过程中内源表达的多肽。 - 使用半胱天冬酶底物数据库4或蛋白质比对工具，在多肽上找到共识半胱天冬酶切割基序XXXD和DXXD。几乎所有半胱天冬酶裂解基序在裂解位点（P1）处都具有天冬氨酸3，4。
- 通过定点诱变将假定的P1天冬氨酸突变为谷氨酸或非极性氨基酸（丙氨酸，缬氨酸），然后使用标准方法和协议进行DNA测序11 。
- 通过反向转染将野生型 （WT） 和突变质粒 DNA 递送至 MDCK 或 A549 细胞11。
- 为此，在单独的管中将2μg质粒DNA或推荐体积的转染试剂稀释在100μL适当的培养基（参见步骤2.3和 材料表）中，并在室温下孵育5分钟。
- 将 100 μL 每种质粒 DNA 溶液与 100 μL 转染试剂溶液混合，并在室温下孵育 20-45 分钟以形成 DNA-转染试剂复合物。
- 同时，将 3 x 105 MDCK 或 A549 细胞拆分并加入到 800 μL 的完整生长培养基中，与 200 μL DNA 转染试剂复合物混合，并将 1 mL 悬浮液加入 12 孔培养板的孔中。
- 将细胞在37°C的5%CO2 气氛下孵育。
- 48小时后，如步骤1.4-1.9中所述用IAV感染细胞（不添加抑制剂）。
- 24小时后，通过蛋白质印迹（如果适用，使用抗表位标签或GFP）收获，处理和分析细胞。然后，如步骤1.10-1.20中所述测量和定量蛋白质回收率。
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Representative Results
用半胱天冬酶3抑制剂治疗
已经发现宿主皮质素，HDAC4和HDAC6多肽在犬（MDCK）和人（A549，NHBE）细胞中响应IAV感染而降解7，8，9。通过使用上述方法，发现IAV诱导的宿主半胱天冬酶，特别是半胱天冬酶3，导致其降解7，8，9。皮质肌动蛋白以感染剂量和时间依赖性方式以及宿主细胞和IAV菌株依赖性方式降解7。HDAC48 和 HDAC69 也获得了类似的结果。有趣的是，所有三种宿主蛋白的降解与病毒NP7，8，9的切割一致，已知该病毒经历半胱天冬酶介导的切割14。因此，假设皮质素，HDAC4和HDAC6也经历半胱天冬酶介导的切割和随后的降解。为了测试这一点，首先，用半胱天冬酶3抑制剂处理IAV感染的细胞，并通过蛋白质印迹分析皮质素，HDAC4和HDAC6多肽的拯救。所有三种多肽（以及病毒NP）在半胱天冬酶3抑制剂处理后从IAV感染诱导的降解中回收7，8，9。皮肌动蛋白的代表性数据7如图1A所示。通过测量蛋白质条带的强度并通过相应的肌动蛋白（负荷对照）带的值标准化皮质肌动蛋白条带的值来量化这种回收率。随后，将相应未感染样本中皮质肌动蛋白的标准化值视为100%，以确定其在感染样本中的值。该定量方法将半胱天冬酶3抑制剂处理的感染细胞中皮质肌动蛋白多肽的回收率为78.8%，而未处理的感染细胞中的回收率为70.7%7（图1B）。
RNA干扰介导的半胱天冬酶3表达敲低
接下来，使用遗传工具RNA干扰（RNAi），然后进行蛋白质印迹以确认半胱天冬酶在IAV感染诱导的皮质肌动蛋白11和HDAC48降解中的作用。在半胱天冬酶3耗竭的细胞（图2C）11中，皮质肌动蛋白（图2A）11和HDAC48多肽均从IAV感染诱导的降解中回收。然而，在半胱天冬酶6或半胱天冬酶7-去除的细胞中（图2C）11，没有观察到皮质肌动蛋白多肽水平的显着恢复（图2A）11。具体而言，当定量并与上述相应未感染细胞中的水平进行比较时，具有耗尽半胱天冬酶3表达的感染细胞中的皮质肌动蛋白多肽水平从具有正常半胱天冬酶3表达的感染细胞中的28.6%恢复到83%（图2B）11。
皮质肌动蛋白和HDAC6多肽中的半胱天冬酶切割基序
最后，筛选皮质肌动蛋白和HDAC6多肽中的氨基酸序列，在假定的半胱天冬酶切割基序中，P1位置的天冬氨酸突变为谷氨酸9，11。该方法将皮质肌动蛋白多肽11 中的天冬氨酸116和HDAC6多肽9 中的天冬氨酸1088鉴定为半胱天冬酶切割位点。两种天冬氨酸残基突变为谷氨酸，使皮质肌动蛋白（图3A）11 和HDAC69 多肽对IAV感染诱导的降解具有抗性。具体来说，当定量并与上述相应未感染细胞中的水平进行比较时，感染细胞中质粒表达的突变皮质肌动蛋白多肽水平为77.9%，而感染细胞中质粒表达的野生型皮质肌动蛋白多肽水平为23.6%（图3B）11。
图1：皮质肌动蛋白多肽在IAV感染的细胞中经历半胱天冬酶3介导的降解。 （A） MDCK细胞以0.5的MOI感染甲型/新喀里多尼亚/20/1999/H1N1流感病毒株，随后作为模拟或半胱天冬酶3抑制剂（Cas3-I，40μM）处理。24 小时后，通过蛋白质印迹在总细胞裂解物中检测皮质素、病毒 NP 和肌动蛋白多肽。UNI，未感染;INF，感染。箭头指向全长和切割的NP。（B）量化皮质肌动蛋白和肌动蛋白条带的强度。然后，皮质肌动蛋白的值与肌动蛋白的值归一化。UNI样品中皮质肌动蛋白的标准化量被认为是100%，以确定其在相应INF样品中的含量。所提供的数据是三个生物学重复±SE的手段。P = 0.0006，使用双向方差分析计算。ns，不重要。这个数字是从Chen等人7修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图2：敲低半胱天冬酶3表达在IAV感染的细胞中拯救了皮质肌动蛋白多肽降解。 （A）A549细胞用10nM对照（Ctrl），半胱天冬酶3（Cas3），半胱天冬酶6（Cas6）或半胱天冬酶7（Cas7）siRNA一式两份转染。72小时后，收获并处理一个重复中的细胞以提取总RNA。另一个重复中的细胞感染流感病毒A / WSN / 1933 / H1N1亚型，MOI为3.0。24 h后，通过蛋白质印迹检测皮质素、病毒 NP 和肌动蛋白多肽。UNI，未感染;INF，感染。（B）量化皮质肌动蛋白和肌动蛋白条带的强度，并将皮质肌动蛋白的值与肌动蛋白的值归一化。然后，将UNI样品中皮质肌动蛋白的标准化量考虑为100%，以确定其在相应INF样品中的含量。所提供的数据是三个生物学重复±SE的手段。P < 0.0001， ***P = 0.0007， ***P = 0.0002， 使用双向方差分析计算。ns，不重要。（C）将上述提取的总RNA转化为cDNA，然后用作模板，通过RT-qPCR检测半胱天冬酶3，半胱天冬酶6，半胱天冬酶7和肌动蛋白mRNA水平。以肌动蛋白mRNA水平为参考，使用标准2−ΔΔCT方法计算对照siRNA（Ctrl）和相应半胱天冬酶siRNA（Cas）转染细胞中每种半胱天冬酶的mRNA水平。P < 0.0001，使用双向方差分析计算。这个数字是从Chen等人11修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图 3：天冬氨酸 116 突变为谷氨酸，使皮质肌动蛋白多肽对 IAV 感染诱导的降解具有抗性 。 （A）MDCK细胞转染表达野生型（WT）或突变（D116E）GFP-皮质肌动蛋白融合的质粒。48小时后，细胞感染流感病毒A / WSN / 1933 / H1N1亚型，MOI为3.0。24 h后，通过蛋白质印迹检测GFP-皮质素、病毒NP和肌动蛋白多肽。UNI，未感染;INF，感染。（B）量化皮质肌动蛋白和肌动蛋白条带的强度，并将皮质肌动蛋白的值与肌动蛋白的值归一化。然后，考虑UNI样品中皮质肌动蛋白的标准化量100%，以确定其在相应INF样品中的含量。所提供的数据是三个生物学重复±SE的手段。**P = 0.001，使用双向方差分析计算。ns，不重要。这个数字是从Chen等人11修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
已经确定，病毒会根据宿主因素和途径进行调整。反过来，宿主细胞通过采用各种策略来抵抗它。其中一种策略是PANoptosis，宿主细胞将其用作对抗病毒感染的抗病毒策略。然而，像IAV这样的病毒已经进化出自己的策略来对抗PANoptosis并利用它来发挥自己的优势1，3，6。这种相互作用涉及半胱天冬酶切割各种宿主和病毒蛋白。鉴定底物蛋白中的半胱天冬酶及其切割位点对于阐明这种相互作用的机制和意义非常重要。
为此，使用标准的生化和分子方法来鉴定宿主皮质素、HDAC4 和 HDAC67，8，9，11 中的半胱天冬酶及其切割位点。上述方案可用于涉及流感病毒，其他哺乳动物病毒，其他微生物以及毒素和化学物质等外部刺激的此类研究。此外，这些方法可以在具有相关技能的标准分子生物学实验室中复制，并且不需要专门的设备和软件培训。12孔细胞培养板形式成功地适用于这些和类似的研究，以产生足够的样品量，用于蛋白质印迹和RT-qPCR的下游分析。但是，根据需要，可以相应地缩小或放大此格式。当首次进行涉及半胱天冬酶抑制剂的实验时，建议使用泛半胱天冬酶抑制剂（Z-VAD-FMK）以及溶酶体和蛋白酶体抑制剂来评估感兴趣的蛋白质是否经历半胱天冬酶介导的降解。此外，除了NH4Cl和MG132外，还可以使用其他溶酶体和蛋白酶体抑制剂，如巴非霉素A和依泊霉素。在泛半胱天冬酶抑制剂获得阳性结果后，可以使用单个半胱天冬酶的特异性抑制剂，也可以使用RNA干扰。对于前者，重要的是优化有效抑制浓度，以避免对靶细胞类型和非特异性结果的毒性。
接下来必须使用RNA干扰或CRISPR等遗传工具来确认半胱天冬酶的参与，因为抑制剂确实会发生交叉反应。或者，可以单独进行针对所有已知半胱天冬酶的RNA干扰或CRISPR筛选。所有已知半胱天冬酶的siRNA，gRNA和RT-qPCR引物对可以按照预先设计或使用在线工具设计获得。此外，可以同时去除两种或多种半胱天冬酶以评估多肽的顺序或合作切割（该策略最近用于一项尚未发表的研究中）。RNA干扰被认为是病毒-宿主细胞相互作用研究的理想工具。后者需要对宿主基因表达进行受控操作，以便宿主细胞在病毒感染和完成生命周期以显示该操作的表型时保持相对存活。然而，每种细胞类型都需要优化有效的siRNA浓度和siRNA-转染试剂组合，以获得最佳的敲低率和活力比，以应对后续感染。
为了定位假定的半胱天冬酶切割基序，已经开发了许多数据库，例如CASBAH18，CaspDB19，CutDB 20，DegraBase 21，MEROPS22和TopFIND23，24。进行了视觉筛选以在HDAC6聚petide9上定位这些基序，但对于皮质肌动蛋白11，使用了CaspDB（尽管CaspDB网站最近无法访问）。这些基序通过将P1天冬氨酸突变为谷氨酸，成功地被证实为半胱天冬酶裂解位点。然而，建议首先将天冬氨酸突变为非极性氨基酸样丙氨酸或缬氨酸，因为一些半胱天冬酶可以在 P1 谷氨酸4 后裂解。该练习可能会迅速导致半胱天冬酶切割位点的鉴定，但如果目标多肽富含天冬氨酸并且推定的靶基序是非规范的，则可能需要产生数十个突变体。为了将质粒（和siRNA）递送到细胞，可以进行正向转染，而不是反向转染。此外，应使用4%-20%梯度SDS-PAGE进行免疫印迹，以评估多肽的降解动力学并鉴定任何较小尺寸的切割产物。最后，为了确认感兴趣的蛋白质作为直接半胱天冬酶底物，可以开发含有纯化的半胱天冬酶和靶蛋白（WT或突变体）和任何辅因子的体外生化测定。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Jennifer Tipper，Bilan Li，Jesse vanWestrienen，Kevin Harrod，Da-Yuan Chen，Farjana Ahmed，Sonya Mros，Kenneth Yamada，Richard Webby，BEI Resources（NIAID），新西兰健康研究委员会，Maurice和Phyllis Paykel信托（新西兰），H.S.和J.C.安德森信托（但尼丁），微生物学和免疫学系以及生物医学科学学院（奥塔哥大学）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
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