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Immunology and Infection

Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Abstract

Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.

Introduction

El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como "gripe". La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada1. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patógenos detectan las partículas de virus entrantes en las células huésped. Esto conduce a la programación de la muerte de las células infectadas y la señalización a las células sanas vecinas por tres vías interconectadas llamadas piroptosis, apoptosis y necroptosis, recientemente acuñadas como un proceso, PANoptosis1.

La PANoptosis implica el procesamiento proteolítico de muchas proteínas del huésped y virales desde la inducción hasta la ejecución. Tal procesamiento de proteínas está encabezado principalmente por una familia de proteasas de cisteína llamadas caspasas 1,2. Se conocen hasta 18 caspasas (de caspasa 1 a caspasa 18)3. La mayoría de las caspasas se expresan como pro-caspasas y se activan al someterse a su propio procesamiento proteolítico, ya sea por autocatálisis u otras caspasas4 en respuesta a un estímulo como una infección viral. Se pensaba que la PANoptosis de las células infectadas por IAV era un mecanismo de defensa del huésped, pero IAV ha desarrollado formas de evadirlo y explotarlo para facilitar su replicación 1,2,5,6. Uno de ellos es antagonizar los factores del huésped a través de la escisión o degradación mediada por caspasa que son inherentemente antivirales o interfieren con uno de los pasos del ciclo de vida del IAV. Con este fin, se ha descubierto que los factores del huésped, cortactina, HDAC4 y HDAC6 sufren escisión o degradación mediada por caspasa en células epiteliales infectadas por IAV 7,8,9. El HDAC4 y el HDAC6 son factores anti-IAV 8,10, y la cortactina interfiere con la replicación del IAV en una etapa posterior de la infección, potencialmente durante el ensamblaje viral y la gemación11.

Además, también se activan varias caspasas, que, a su vez, escinden múltiples proteínas para activar la respuesta inflamatoria del huésped durante la infección por IAV 1,2. Además, la nucleoproteína (NP), la proteína M2 del canal iónico de IAV 12,13,14 y varias proteínas de otros virus 3,15,16 también sufren escisión mediada por caspasa durante la infección, lo que influye en la patogénesis viral. Por lo tanto, existe una necesidad continua de estudiar la escisión mediada por caspasa o la degradación de las proteínas del huésped y virales durante el IAV y otras infecciones virales para comprender las bases moleculares de la patogénesis viral. En este documento, los métodos se presentan para (1) evaluar la escisión o degradación de dichas proteínas por caspasas, (2) identificar esas caspasas, y (3) localizar los sitios de escisión.

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Protocol

Se obtuvieron aprobaciones regulatorias del Comité Institucional de Seguridad Biológica de la Universidad de Otago para trabajar con el IAV y las células de mamíferos. Para el presente estudio se utilizó el riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células epiteliales a549 alveolares de pulmón humano y subtipos IAV H1N1. El IAV se cultivó en huevos de gallina, como se describe en otra parte17. Se utilizaron condiciones estériles y asépticas para trabajar con células de mamíferos, y se utilizaron una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (o Contención Física 2) y un gabinete de bioseguridad Clase II para trabajar con subtipos de IAV.

1. Evaluación de la escisión o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por caspasas

  1. Semilla 3 x 105 células MDCK o A549 por pocillo en una placa de cultivo celular de 12 pocillos.
    NOTA: Si utiliza células MDCK, asegúrese de que el anticuerpo contra la proteína de interés reconozca su especie canina.
  2. Sembrar los pocillos en pares, es decir, un par de control, un pozo para la muestra simulada no infectada y otro para la muestra simulada infectada, y un par de pruebas, un pocillo para la muestra A del inhibidor A no infectado y otro para la muestra del inhibidor A infectado. Aumentar el número de pares con cada inhibidor adicional (ver referencias 7,8).
  3. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera deCO2 al 5% durante la noche.
  4. Al día siguiente, infecte las células con IAV (un subtipo H1N1 u otro subtipo).
    1. Para ello, preparar el inóculo del virus diluyendo las existencias de virus en 400 μL de medio esencial mínimo (MEM) libre de suero (véase la Tabla de materiales) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placa (ufp)/célula 7,11 (un factor de duplicación del número de células al calcular el MOI).
      NOTA: Para infectar células MDCK, complementar el inóculo del virus con tosilfenilanil clorometilcetona (TPCK)-tripsina a una concentración final de 1 μg/ml.
  5. Retirar el medio de cultivo antiguo de las células (paso 1.3) y lavar las células con 1 ml/pocillo de MEM 2x sin suero.
  6. Añadir 400 μL de inóculo vírico (paso 1.4.1) a las células e incubarlas durante 1 h a 35 °C en una atmósfera deCO2 al 5%.
  7. Mientras tanto, diluya un inhibidor de caspasa (por ejemplo, Z-DEVD-FMK), un inhibidor de lisosoma (por ejemplo, NH4Cl) o un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, MG132) (consulte la Tabla de materiales) a una concentración final de 40 μM, 20 mM o 10 μM, respectivamente, en MEM7 sin suero (consulte la Tabla de materiales). Los dos últimos inhibidores sirven como control. Diluir un volumen igual del disolvente (si no es agua) utilizado para reconstituir uno de los inhibidores en medio libre de suero como simulacro.
  8. Retire el inóculo del virus y lave las células como en el paso 1.5 (1x).
  9. Agregue la MEM sin suero, 1 ml / pocillo, simulada o suplementada con un inhibidor, a las células e incube las células como en el paso 1.6. Este punto de tiempo se considera como infección de 0 h.
  10. Después de 24 h, recolecte las células raspándolas con un émbolo de jeringa de 1 ml (lado de goma) y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 1,5 ml.
  11. Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: Este sobrenadante podría descartarse o usarse para un ensayo de placa8 para medir el título de la progenie del virus liberado.
  12. Lavar el pellet celular con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante recentrifugación como en el paso 1.11.
  13. Retire el sobrenadante y lisar las células agregando 80-100 μL de tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5% de desoxicolato de sodio, 1% Triton X-100 y 1x cóctel de inhibidores de proteasa, ver Tabla de materiales) y vórtice.
  14. Calentar el tubo a 98 °C durante 10 min para lisar completamente y preparar el lisado celular total. Guarde los lisados a 4 °C para realizar los pasos 1.15-1.17 al día siguiente, pero, para obtener mejores resultados, finalice estos pasos el mismo día.
  15. Calcule la cantidad de proteína en cada muestra utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la Tabla de materiales).
  16. Resolver cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis estándar en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)11 junto con marcadores de peso molecular 11.
  17. Transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La membrana de PVDF puede dar un fondo alto en algunas imágenes de Western blot; Compruebe la compatibilidad.
  18. Realizar Western blot para detectar la proteína de interés utilizando el método descrito en otra parte11.
  19. Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores.
    NOTA: Si el nivel de proteína se ha recuperado en el carril de muestra infectado tratado con inhibidores de caspasas, entonces la proteína es escindida o degradada por caspasas. De lo contrario, es degradado por lisosoma o proteasoma.
  20. Cuantificar la recuperación de proteínas midiendo su intensidad de banda en cada carril a partir de al menos tres réplicas del mismo experimento y normalizándola con la banda de control de carga correspondiente.
  21. Utilice cualquier generador de imágenes contemporáneo y el software asociado (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de las manchas occidentales y cuantificar la recuperación de proteínas.

2. Confirmación de la escisión mediada por caspasa o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por interferencia de ARN

  1. Diseñar u obtener un ARN de interferencia pequeña (ARNsi) prediseñado dirigido a la caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7 canina o humana (caspasas de verdugo1) y un ARNip de control no dirigido (consulte la Tabla de materiales).
  2. Administrar cada siRNA a células MDCK o A549 por transfección inversa 8,11.
  3. Para ello, diluir en tubos separados 100 nM de siRNA de control o siRNA de caspasa o un volumen recomendado de reactivo de transfección (ver Tabla de materiales) en 100 μL de medio apropiado (como OptiMEM, ver Tabla de materiales), e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Preparar cada dilución por duplicado.
    NOTA: Este duplicado incluye una réplica para analizar la eliminación de la expresión de caspasa por RT-qPCR o western blot (si se dispone de anticuerpos contra caspasas) y otra para evaluar la recuperación de la proteína de interés por western blotting.
  5. Mezclar 100 μL de cada solución de ARNip con 100 μL de solución de reactivo de transfección (paso 2.3) e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo reactivo siRNA-transfección.
  6. Mientras tanto, dividir y añadir 1 x 10 5 células MDCK o A549 en 800 μL del medio de crecimiento completo, mezclar con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ARNip (paso2.5 ) y añadir 1 ml de la suspensión a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos. Esta dilución eleva la concentración final de siRNA de control o siRNA de caspasa a 10 nM.
  7. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante72 h.
  8. Recolectar las células de una réplica como en el paso 1.10, y procesarlas para validar o confirmar la eliminación de la expresión de caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7, ya sea por RT-qPCR o western blotting, respectivamente, utilizando métodos y protocolos estándar 8,11.
  9. Infectar las células en el otro replicar con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin inhibidores).
  10. Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot y medir y cuantificar la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.

3. Mutagénesis dirigida al sitio para localizar el sitio o sitios de escisión de la caspasa en el polipéptido

  1. Clone la proteína codificante de genes de interés en un plásmido de expresión de mamífero11 u obténgala de un laboratorio de investigación o fuente comercial (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Se prefiere si el gen se clona con una etiqueta de epítopo o como fusión GFP para distinguir el polipéptido expresado ectópicamente del expresado endógenamente durante la transferencia occidental.
  2. Utilizando bases de datos de sustrato de caspasa 4 o herramientas de alineación de proteínas, localice los motivos de escisión de caspasade consenso, XXXD y DXXD, en el polipéptido. Casi todos los motivos de escisión de caspasa poseen el ácido aspártico en el sitio de escisión (P1)3,4.
  3. Mutar el ácido aspártico P1 putativo a ácido glutámico o un aminoácido no polar (alanina, valina) mediante mutagénesis dirigida al sitio seguida de secuenciación de ADN11 utilizando métodos y protocolos estándar.
  4. Entregar el ADN plásmido mutante (WT) y de tipo salvaje a las células MDCK o A549 mediante transfección inversa11.
    1. Para ello, diluir 2 μg de ADN plásmido o un volumen recomendado del reactivo de transfección en 100 μL de un medio apropiado (ver paso 2.3 y Tabla de materiales) en tubos separados, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Mezclar 100 μL de cada solución de ADN plásmido con 100 μL de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo de reactivos de transfección de ADN.
  5. Mientras tanto, divida y agregue 3 x 105 células MDCK o A549 a 800 μL del medio de crecimiento completo, mezcle con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ADN y agregue la suspensión de 1 ml a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.
  6. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera deCO2 al 5%.
  7. Después de 48 h, infectar las células con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin agregar los inhibidores).
  8. Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot (si corresponde, utilizando el anticuerpo contra una etiqueta de epítopo o GFP). Luego, mida y cuantifique la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.

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Representative Results

Tratamiento con inhibidor de caspasa 3
Se ha descubierto que los polipéptidos cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 sufren degradación en respuesta a la infección por IAV tanto en células caninas (MDCK) como humanas (A549, NHBE) 7,8,9. Mediante el uso de los enfoques anteriores, se descubrió que las caspasas del huésped inducidas por IAV, particularmente la caspasa 3, causan su degradación 7,8,9. La cortactina se degradó de manera dependiente de la dosis y el tiempo de la infección y de una cepa de la célula huésped y del IAV7. Se obtuvieron resultados similares para HDAC48 y HDAC69. Curiosamente, la degradación de las tres proteínas del huésped coincidió con la escisión de NP viral 7,8,9, que se sabe que sufre una escisión mediada por caspasa14. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la cortactina, HDAC4 y HDAC6 también sufren escisión mediada por caspasa y posterior degradación. Para probar esto, primero, las células infectadas por IAV se trataron con un inhibidor de caspasa 3, y el rescate de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 se analizó mediante western blotting. Los tres polipéptidos (así como NP viral) se recuperaron de la degradación inducida por la infección por IAV después del tratamiento con inhibidores de la caspasa 3 7,8,9. Los datos representativos7 para la cortactina se muestran en la Figura 1A. Esta recuperación se cuantificó midiendo la intensidad de las bandas proteicas y normalizando el valor de la banda de cortactina por el valor de la banda de actina (control de carga) correspondiente. Posteriormente, el valor normalizado de cortactina en las muestras no infectadas correspondientes se consideró al 100% para determinar su valor en las muestras infectadas. Este método de cuantificación representó la recuperación del polipéptido de cortactina en células infectadas tratadas con inhibidores de caspasa 3 como 78,8% desde 20,7% en células infectadas no tratadas7 (Figura 1B).

Knockdown mediado por interferencia de ARN de la expresión de caspasa 3
A continuación, se empleó una herramienta genética, la interferencia de ARN (ARNi), seguida de Western blot para confirmar el papel de las caspasas en la degradación inducida por la infección por IAV de la cortactina11 y HDAC48. En células agotadas en la caspasa 3 (Figura 2C)11, tanto la cortactina (Figura 2A)11 como los polipéptidos HDAC48 se recuperaron de la degradación inducida por la infección por IAV. Sin embargo, en las células agotadas de la caspasa 6 o caspasa 7 (Figura 2C)11, no se observó una recuperación significativa en los niveles de polipéptido cortactina (Figura 2A)11. Específicamente, cuando se cuantificó y comparó con sus niveles en las células no infectadas correspondientes como se mencionó anteriormente, el nivel de polipéptido de cortactina en células infectadas con expresión de caspasa 3 agotada se recuperó al 83% desde el 28,6% en células infectadas con expresión normal de caspasa 3 (Figura 2B)11.

Motivos de escisión de caspasa en polipéptidos de cortactina y HDAC6
Finalmente, se cribó la secuencia de aminoácidos en polipéptidos cortactina y HDAC6 y, en supuestos motivos de escisión de caspasas, el ácido aspártico en la posición P1 se mutó a ácido glutámico 9,11. Este enfoque identificó el ácido aspártico 116 en el polipéptido de cortactina11 y el ácido aspártico 1088 en el polipéptido 9 HDAC6como un sitio de escisión de la caspasa. La mutación de ambos residuos de ácido aspártico a ácido glutámico hizo que los polipéptidos cortactina (Figura 3A)11 y HDAC69 fueran resistentes a la degradación inducida por la infección por IAV. Específicamente, cuando se cuantificó y comparó con sus niveles en las células no infectadas correspondientes como se mencionó anteriormente, el nivel de polipéptido de cortactina mutante expresado por plásmidos en células infectadas fue de 77,9%, mientras que el nivel de polipéptido de cortactina de tipo salvaje expresado por plásmidos en células infectadas fue de 23,6% (Figura 3B)11.

Figure 1
Figura 1: El polipéptido cortactina sufre degradación mediada por caspasa 3 en células infectadas por IAV. (A) Las células MDCK se infectaron con la cepa A/New Caledonia/20/1999/H1N1 del virus de la influenza a un MOI de 0,5 y posteriormente se trataron como simulacros o con inhibidores de la caspasa 3 (Cas3-I, 40 μM). Después de 24 h, los polipéptidos de cortactina, NP viral y actina se detectaron en lisados celulares totales por western blotting. UNI, no infectados; INF, infectado. Las flechas apuntan al NP de longitud completa y escindido. (B) Se cuantificó la intensidad de las bandas de cortactina y actina. Luego, el valor de la cortactina se normalizó con el valor de la actina. La cantidad normalizada de cortactina en muestras UNI se consideró al 100% para determinar su cantidad en las muestras INF correspondientes. Los datos presentados son medias ± SE de tres réplicas biológicas. P = 0,0006, calculado mediante ANOVA bidireccional. ns, no significativo. Esta cifra ha sido modificada de Chen et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La eliminación de la expresión de caspasa 3 rescató la degradación del polipéptido cortactina en células infectadas por IAV. (A) Las células A549 se transfectaron por duplicado con 10 nM de control (Ctrl), caspasa 3 (Cas3), caspasa 6 (Cas6) o caspasa 7 (Cas7) siRNA. Después de 72 h, las células en una réplica fueron cosechadas y procesadas para extraer el ARN total. Las células en la otra replicación fueron infectadas con el subtipo del virus de la influenza A/WSN/1933/H1N1 a un MOI de 3.0. Después de 24 h, los polipéptidos de cortactina, NP viral y actina se detectaron mediante Western blotting. UNI, no infectados; INF, infectado. (B) Se cuantificó la intensidad de las bandas de cortactina y actina, y el valor de la cortactina se normalizó con el valor de actina. Luego, la cantidad normalizada de cortactina en las muestras de UNI se consideró al 100% para determinar su cantidad en las muestras INF correspondientes. Los datos presentados son medias ± SE de tres réplicas biológicas. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, calculado utilizando ANOVA bidireccional. ns, no significativo. (C) El ARN total extraído anteriormente se convirtió en ADNc, que luego se utilizó como plantilla para detectar los niveles de caspasa 3, caspasa 6, caspasa 7 y ARNm de actina mediante RT-qPCR. Se utilizó como referencia el nivel de ARNm de actina, y se calculó el nivel de ARNm de cada caspasa en siRNA de control (Ctrl) y las respectivas células transfectadas de siRNA caspasa (Cas) utilizando el método estándar 2-ΔΔCT. P < 0,0001, calculado utilizando ANOVA bidireccional. Esta cifra ha sido modificada de Chen et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La mutación del ácido aspártico 116 a ácido glutámico hizo que el polipéptido de cortactina fuera resistente a la degradación inducida por la infección por IAV. (A) Las células MDCK se transfectaron con un plásmido que expresaba la fusión GFP-cortactina de tipo salvaje (WT) o mutada (D116E). Después de 48 h, las células se infectaron con el subtipo A/WSN/1933/H1N1 del virus de la influenza a un MOI de 3.0. Después de 24 h, los polipéptidos GFP-cortactina, NP viral y actina fueron detectados por Western blotting. UNI, no infectados; INF, infectado. (B) Se cuantificó la intensidad de las bandas de cortactina y actina, y el valor de la cortactina se normalizó con el valor de actina. Luego, la cantidad normalizada de cortactina en muestras UNI se consideró al 100% para determinar su cantidad en las muestras INF correspondientes. Los datos presentados son medias ± SE de tres réplicas biológicas. **P = 0,001, calculado mediante ANOVA bidireccional. ns, no significativo. Esta cifra ha sido modificada de Chen et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio 1,3,6. Esta interacción implica la escisión de varias proteínas del huésped y virales por caspasas. La identificación de esas caspasas y sus sitios de escisión en las proteínas de sustrato es importante para dilucidar los mecanismos y la importancia de dicha interacción.

Para ello, se utilizaron métodos bioquímicos y moleculares estándar para identificar las caspasas y sus sitios de escisión en la cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 7,8,9,11. Los protocolos descritos anteriormente se pueden usar para tales estudios que involucran virus de influenza, otros virus de mamíferos, otros microbios y estímulos externos como toxinas y productos químicos. Además, estos métodos se pueden replicar en un laboratorio estándar de biología molecular con las habilidades pertinentes y no requieren equipo especializado y capacitación en software. El formato de placa de cultivo celular de 12 pocillos se adaptó con éxito para estos y otros estudios similares para generar cantidades de muestra suficientes para los análisis posteriores mediante western blotting y RT-qPCR. Sin embargo, según sea necesario, este formato se puede reducir o ampliar en consecuencia. Al realizar un experimento con un inhibidor de caspasa por primera vez, se sugiere el uso de un inhibidor de pan-caspasa (Z-VAD-FMK) junto con un inhibidor de lisosoma y proteasoma para evaluar si la proteína de interés sufre degradación mediada por caspasa. Además, además de NH4Cl y MG132, se pueden usar otros inhibidores de lisosomas y proteasoma como Bafilomicina A y Epoxomicina, respectivamente. Después de resultados positivos con un inhibidor de pan-caspasa, se pueden usar inhibidores específicos de caspasas individuales o se puede emplear interferencia de ARN. Para el primero, es importante optimizar las concentraciones inhibitorias efectivas para evitar la toxicidad para el tipo de célula diana y resultados no específicos.

Una herramienta genética como la interferencia de ARN o CRISPR debe emplearse a continuación para confirmar la participación de las caspasas porque los inhibidores reaccionan de forma cruzada. Alternativamente, se puede llevar a cabo una pantalla de interferencia de ARN o CRISPR dirigida individualmente a todas las caspasas conocidas. Los pares de cebadores siRNA, gRNA y RT-qPCR para todas las caspasas conocidas podrían adquirirse como prediseñados o diseñados utilizando herramientas en línea. Además, dos o más caspasas pueden agotarse simultáneamente para evaluar la escisión secuencial o cooperativa de los polipéptidos (esta estrategia se utilizó recientemente en un estudio aún por publicar). Se cree que la interferencia de ARN es una herramienta ideal para la investigación de la interacción virus-célula huésped. Esto último requiere una manipulación controlada de la expresión génica del huésped para que las células huésped permanezcan relativamente viables para la infección del virus y la finalización del ciclo de vida para mostrar el fenotipo de esa manipulación. Sin embargo, es necesario optimizar una concentración efectiva de siRNA y una combinación de reactivos de siRNA-transfección para cada tipo de célula para una relación óptima de knockdown y viabilidad para la infección posterior.

Para localizar los supuestos motivos de escisión de caspasa, se han desarrollado muchas bases de datos como CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 y TopFIND23,24. Se realizó un cribado visual para localizar estos motivos en el polipétido9 de HDAC6, pero para la cortactina11, se utilizó el CaspDB (aunque el sitio web de CaspDB ha sido inaccesible últimamente). Esos motivos se confirmaron con éxito como sitios de escisión de caspasa mutando el ácido aspártico P1 a ácido glutámico. Sin embargo, se sugiere mutar el ácido aspártico a un aminoácido no polar similar a la alanina o valina primero porque algunas caspasas pueden escindirse después del ácido glutámico P14. Este ejercicio puede resultar rápidamente en la identificación de los sitios de escisión de caspasas, pero podría requerir la generación de decenas de mutantes si el polipéptido objetivo es rico en ácidos aspárticos y los motivos objetivo putativos no son canónicos. Para la administración de plásmidos (y ARNsi) a las células, hacia adelante, en lugar de hacia atrás, se puede llevar a cabo la transfección. Además, la dosis de infección y la cinética de tiempo deben realizarse utilizando un gradiente SDS-PAGE del 4% -20% para Western blotting para evaluar la cinética de degradación de los polipéptidos e identificar cualquier producto de escisión de menor tamaño. Finalmente, para confirmar la proteína de interés como sustrato directo de caspasa, se podrían desarrollar ensayos bioquímicos in vitro que contengan caspasas purificadas y proteínas diana (WT o mutantes) y cualquier cofactor.

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Disclosures

El autor no tiene conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

El autor reconoce a Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), el Health Research Council of New Zealand, el Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nueva Zelanda), el H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), y el Departamento de Microbiología e Inmunología y la Facultad de Ciencias Biomédicas (Universidad de Otago).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

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References

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Inmunología e infección Número 185
Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A
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Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

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