Identificare le caspasi e i loro motivi che scindono le proteine durante l'infezione da virus dell'influenza A

Summary

L’infezione da virus dell’influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell’ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell’RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.

Abstract

Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L’infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l’attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell’ospite e virali, portando a processi come l’attivazione della risposta antivirale innata dell’ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell’ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell’istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell’istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all’infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell’RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l’ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un’infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.

Introduction

Il virus dell’influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come “influenza”. L’influenza è una malattia acuta che provoca l’induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell’ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata¹. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni rilevano le particelle virali in arrivo nelle cellule ospiti. Ciò porta alla programmazione della morte delle cellule infette e alla segnalazione alle cellule sane vicine attraverso tre percorsi interconnessi chiamati piroptosi, apoptosi e necroptosi, recentemente coniati come un unico processo, PANoptosis¹.

La PANoptosi comporta l’elaborazione proteolitica di molte proteine dell’ospite e virali dall’induzione all’esecuzione. Tale elaborazione delle proteine è principalmente guidata da una famiglia di proteasi della cisteina chiamate caspasi ^1,2. Sono note fino a 18 caspasi (dalla caspasi 1 alla caspasi 18)³. La maggior parte delle caspasi sono espresse come pro-caspasi e attivate subendo il proprio processo proteolitico mediante autocatalisi o altre caspasi⁴ in risposta a uno stimolo come un’infezione virale. Si pensava che la PANoptosi delle cellule infette da IAV fosse un meccanismo di difesa dell’ospite, ma IAV ha evoluto modi per eludere e sfruttarlo per facilitare la sua replicazione 1,2,5,6. Uno di questi è quello di antagonizzare i fattori dell’ospite attraverso la scissione o la degradazione mediata dalla caspasi che sono intrinsecamente antivirali o interferiscono con una delle fasi del ciclo di vita IAV. A tal fine, è stato scoperto che i fattori dell’ospite, cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscono una scissione o degradazione mediata da caspasi nelle cellule epiteliali infette da IAV ^7,8,9. HDAC4 e HDAC6 sono fattori anti-IAV 8,10 e la cortactina interferisce con la replicazione IAV in una fase successiva dell’infezione^, potenzialmente durante l’assemblaggio virale e il germogliamento ¹¹.

Inoltre, vengono attivate anche varie caspasi che, a loro volta, scindono più proteine per attivare la risposta infiammatoria dell’ospite durante l’infezione IAV ^1,2. Inoltre, la nucleoproteina (NP), la proteina M2 del canale ionico di IAV 12,13,14 e varie proteine di altri virus 3,15,16 subiscono anche una scissione mediata da caspasi durante l’infezione^, che influenza la patogenesi virale. Pertanto, vi è una continua necessità di studiare la scissione mediata dalla caspasi o la degradazione delle proteine dell’ospite e virali durante le infezioni da IAV e altri virus per comprendere le basi molecolari della patogenesi virale. Qui, i metodi sono presentati per (1) valutare la scissione o la degradazione di tali proteine da parte delle caspasi, (2) identificare tali caspasi e (3) individuare i siti di scissione.

Protocol

Le approvazioni normative sono state ottenute dal Comitato istituzionale per la sicurezza biologica dell’Università di Otago per lavorare con IAV e cellule di mammifero. Per il presente studio sono state utilizzate cellule A549 del rene canino Madin-Darby (MDCK) o epitelio alveolare polmonare umano e sottotipi IAV H1N1. IAV è stato coltivato in uova di gallina, come descritto altrove17. Le condizioni sterili e asettiche sono state utilizzate per lavorare con cellule di mammifero e sono state uti…

Representative Results

Trattamento con inibitore della caspasi 3È stato scoperto che i polipeptidi di cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 subiscono degradazione in risposta all’infezione da IAV sia nelle cellule canine (MDCK) che umane (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizzando gli approcci di cui sopra, è stato scoperto che le caspasi ospiti indotte da IAV, in particolare la caspasi 3, causano la loro degradazione <su…

Discussion

È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell’ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio ^1,3,6. Questa interazione…

Materials

A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185	Human, epithelial, lung
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Caspase 3 Inhibitor	Sigma-Aldrich	264156-M	Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Goat anti-NP antibody			Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	13778150
MDCK cells	ATCC	CCL-34	Dog, epithelial, kidney
MG132	Sigma-Aldrich	M7449
Minimum Essential Medium (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2	LI-COR		Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion	Addgene	50728	Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3	Sigma-Aldrich	NM_004346	siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6	Sigma-Aldrich	NM_001226	siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7	Sigma-Aldrich	NM_001227	siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs	Sigma-Aldrich	KSPQ12012	Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane	Cytiva (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Rabbit anti-actin antibody	Abcam	ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody	Cell Signaling	3502
Rabbit anti-GFP antibody	Takara	632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	ThermoFisher Scientific	LC5625
Transfection medium, Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100	Merck
Trypsin, TPCK-Treated	Sigma-Aldrich	4370285