Summary
L'infezione da virus dell'influenza A (IAV) attiva le caspasi che scindono le proteine dell'ospite e virali, che, a loro volta, hanno funzioni pro e antivirali. Utilizzando inibitori, interferenza dell'RNA, mutagenesi sito-diretta e tecniche di western blotting e RT-qPCR, sono state identificate caspasi in cellule di mammifero infette che scindono la cortactina ospite e le deacetilasi istoniche.
Abstract
Le caspasi, una famiglia di proteasi della cisteina, orchestrano la morte cellulare programmata in risposta a vari stimoli, comprese le infezioni microbiche. Inizialmente descritta per verificarsi per apoptosi, la morte cellulare programmata è ora nota per comprendere tre percorsi interconnessi: piroptosi, apoptosi e necroptosi, insieme coniati come un unico processo, PANoptosis. L'infezione da virus Influenza A (IAV) induce la PANoptosi nelle cellule di mammifero inducendo l'attivazione di diverse caspasi, che, a loro volta, scindono varie proteine dell'ospite e virali, portando a processi come l'attivazione della risposta antivirale innata dell'ospite o la degradazione delle proteine antagoniste dell'ospite. A questo proposito, la scissione mediata dalla caspasi 3 della cortactina ospite, dell'istone deacetilasi 4 (HDAC4) e dell'istone deacetilasi 6 (HDAC6) è stata scoperta in cellule epiteliali sia animali che umane in risposta all'infezione da IAV. Per dimostrare ciò, sono stati impiegati inibitori, interferenze dell'RNA e mutagenesi diretta al sito e, successivamente, la scissione o resistenza alla scissione e il recupero dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 sono stati misurati mediante western blotting. Questi metodi, in combinazione con RT-qPCR, formano una strategia semplice ma efficace per identificare l'ospite e le proteine virali che subiscono la scissione mediata dalla caspasi durante un'infezione di IAV o altri virus umani e animali. Il presente protocollo elabora i risultati rappresentativi di questa strategia e vengono anche discussi i modi per renderla più efficace.
Introduction
Il virus dell'influenza A (IAV) è il membro prototipo della famiglia Orthomyxoviridae ed è noto per causare epidemie globali e pandemie imprevedibili. IAV causa malattie respiratorie umane, influenza, comunemente noto come "influenza". L'influenza è una malattia acuta che provoca l'induzione di risposte immunitarie innate pro- e anti-infiammatorie dell'ospite e la morte delle cellule epiteliali nel tratto respiratorio umano. Entrambi i processi sono governati da un fenomeno chiamato morte cellulare programmata1. La segnalazione per la morte cellulare programmata viene indotta non appena vari recettori di riconoscimento dei patogeni rilevano le particelle virali in arrivo nelle cellule ospiti. Ciò porta alla programmazione della morte delle cellule infette e alla segnalazione alle cellule sane vicine attraverso tre percorsi interconnessi chiamati piroptosi, apoptosi e necroptosi, recentemente coniati come un unico processo, PANoptosis1.
La PANoptosi comporta l'elaborazione proteolitica di molte proteine dell'ospite e virali dall'induzione all'esecuzione. Tale elaborazione delle proteine è principalmente guidata da una famiglia di proteasi della cisteina chiamate caspasi 1,2. Sono note fino a 18 caspasi (dalla caspasi 1 alla caspasi 18)3. La maggior parte delle caspasi sono espresse come pro-caspasi e attivate subendo il proprio processo proteolitico mediante autocatalisi o altre caspasi4 in risposta a uno stimolo come un'infezione virale. Si pensava che la PANoptosi delle cellule infette da IAV fosse un meccanismo di difesa dell'ospite, ma IAV ha evoluto modi per eludere e sfruttarlo per facilitare la sua replicazione 1,2,5,6. Uno di questi è quello di antagonizzare i fattori dell'ospite attraverso la scissione o la degradazione mediata dalla caspasi che sono intrinsecamente antivirali o interferiscono con una delle fasi del ciclo di vita IAV. A tal fine, è stato scoperto che i fattori dell'ospite, cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscono una scissione o degradazione mediata da caspasi nelle cellule epiteliali infette da IAV 7,8,9. HDAC4 e HDAC6 sono fattori anti-IAV 8,10 e la cortactina interferisce con la replicazione IAV in una fase successiva dell'infezione, potenzialmente durante l'assemblaggio virale e il germogliamento 11.
Inoltre, vengono attivate anche varie caspasi che, a loro volta, scindono più proteine per attivare la risposta infiammatoria dell'ospite durante l'infezione IAV 1,2. Inoltre, la nucleoproteina (NP), la proteina M2 del canale ionico di IAV 12,13,14 e varie proteine di altri virus 3,15,16 subiscono anche una scissione mediata da caspasi durante l'infezione, che influenza la patogenesi virale. Pertanto, vi è una continua necessità di studiare la scissione mediata dalla caspasi o la degradazione delle proteine dell'ospite e virali durante le infezioni da IAV e altri virus per comprendere le basi molecolari della patogenesi virale. Qui, i metodi sono presentati per (1) valutare la scissione o la degradazione di tali proteine da parte delle caspasi, (2) identificare tali caspasi e (3) individuare i siti di scissione.
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Protocol
Le approvazioni normative sono state ottenute dal Comitato istituzionale per la sicurezza biologica dell'Università di Otago per lavorare con IAV e cellule di mammifero. Per il presente studio sono state utilizzate cellule A549 del rene canino Madin-Darby (MDCK) o epitelio alveolare polmonare umano e sottotipi IAV H1N1. IAV è stato coltivato in uova di gallina, come descritto altrove17. Le condizioni sterili e asettiche sono state utilizzate per lavorare con cellule di mammifero e sono state utilizzate una struttura di biosicurezza di livello 2 (o contenimento fisico 2) e un armadio di biosicurezza di classe II per lavorare con i sottotipi IAV.
1. Valutazione della scissione o della degradazione delle proteine nelle cellule infette da IAV da parte delle caspasi
- Seminare 3 x 105 cellule MDCK o A549 per pozzetto in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti.
NOTA: Se si utilizzano cellule MDCK, assicurarsi che l'anticorpo contro la proteina di interesse riconosca la sua specie canina. - Seminare i pozzetti in coppia, cioè una coppia di controllo - un pozzetto per il campione finto non infetto e uno per il campione finto infetto - e una coppia di test - un pozzetto per il campione A inibitore non infetto e uno per il campione A inibitore infetto. Aumentare il numero di coppie con ogni inibitore aggiuntivo (vedere riferimenti 7,8).
- Incubare le cellule a 37 °C sotto un'atmosfera di CO2 al 5% durante la notte.
- Il giorno dopo, infettare le cellule con IAV (un sottotipo H1N1 o un altro sottotipo).
- Per questo, preparare l'inoculo del virus diluendo lo stock virale in 400 μL di mezzo essenziale minimo (MEM) privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5-3,0 unità formanti placca (pfu)/cella 7,11 (un fattore del raddoppio del numero di cellule nel calcolo del MOI).
NOTA: Per infettare le cellule MDCK, integrare l'inoculo del virus con tosil fenilalanile clorometil chetone (TPCK)-tripsina ad una concentrazione finale di 1 μg/ml.
- Per questo, preparare l'inoculo del virus diluendo lo stock virale in 400 μL di mezzo essenziale minimo (MEM) privo di siero (vedi Tabella dei materiali) a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5-3,0 unità formanti placca (pfu)/cella 7,11 (un fattore del raddoppio del numero di cellule nel calcolo del MOI).
- Rimuovere il vecchio terreno di coltura dalle cellule (fase 1.3) e lavare le cellule con 1 mL/pozzetto di MEM 2x senza siero.
- Aggiungere 400 μL di inoculo virale (fase 1.4.1) alle cellule e incubarle per 1 ora a 35 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
- Nel frattempo, diluire un inibitore della caspasi (ad esempio, Z-DEVD-FMK), un inibitore del lisosoma (ad esempio, NH4Cl) o un inibitore del proteasoma (ad esempio, MG132) (vedere Tabella dei materiali) ad una concentrazione finale di 40 μM, 20 mM o 10 μM, rispettivamente, in MEM7 privo di siero (vedere Tabella dei materiali). Gli ultimi due inibitori fungono da controllo. Diluire un volume uguale del solvente (se diverso dall'acqua) utilizzato per ricostituire uno degli inibitori nel mezzo privo di siero come finzione.
- Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule come al punto 1.5 (1x).
- Aggiungere il MEM senza siero, 1 mL/pozzetto, finto o integrato con un inibitore, alle cellule e incubare le cellule come al punto 1.6. Questo punto temporale è considerato come infezione 0 h.
- Dopo 24 ore, raccogliere le cellule raschiandole con uno stantuffo della siringa da 1 mL (lato gomma) e trasferirle in un tubo di polipropilene da 1,5 ml.
- Centrifugare il tubo a 12.000 x g per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante usando una pipetta.
NOTA: Questo surnatante potrebbe essere scartato o utilizzato per un test di placca8 per misurare il titolo della progenie virale rilasciata. - Lavare il pellet cellulare con 250 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) mediante ricentrifugazione come al punto 1.11.
- Rimuovere il surnatante e lisare le cellule aggiungendo 80-100 μL di tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% di sodio dodecilsolfato (SDS), 0,5% di sodio desossicolato, 1% Triton X-100 e 1x cocktail inibitore della proteasi, vedi Tabella dei materiali) e vortexing.
- Riscaldare il tubo a 98 °C per 10 minuti per lisare completamente e preparare il lisato cellulare totale. Conservare i lisati a 4 °C per eseguire i passaggi 1.15-1.17 il giorno successivo, ma, per ottenere risultati ottimali, terminare questi passaggi lo stesso giorno.
- Stimare la quantità di proteine in ciascun campione utilizzando un kit di analisi BCA (vedere la tabella dei materiali).
- Risolvere quantità uguali di proteine da campioni non infetti e infetti mediante elettroforesi su gel standard SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE)11 insieme a marcatori di peso molecolare 11.
- Trasferire la proteina su una membrana di nitrocellulosa o difluoruro di polivinilidene (PVDF) (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: la membrana PVDF può fornire uno sfondo elevato in alcuni imager western blot; Verifica la compatibilità. - Eseguire il western blotting per rilevare la proteina di interesse utilizzando il metodo descritto altrove11.
- Confronta i livelli di proteine nelle corsie campione infette trattate con finzione e inibitori.
NOTA: Se il livello di proteina si è ripreso nella corsia del campione infetto trattata con inibitore della caspasi, la proteina viene scissa o degradata dalle caspasi. Altrimenti, è degradato dal lisosoma o dal proteasoma. - Quantificare il recupero della proteina misurando la sua intensità di banda in ciascuna corsia da almeno tre repliche dello stesso esperimento e normalizzandola con la corrispondente banda di controllo del carico.
- Utilizzare qualsiasi imager contemporaneo e software associato (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare le macchie occidentali e quantificare il recupero delle proteine.
2. Conferma della scissione mediata dalla caspasi o della degradazione delle proteine nelle cellule infette da IAV mediante interferenza dell'RNA
- Progettare o ottenere un RNA a piccola interferenza (siRNA) pre-progettazione che colpisca la caspasi 3, la caspasi 6 e la caspasi 7 canina o umana (caspasi1) e un siRNA di controllo non mirato (vedi Tabella dei materiali).
- Consegnare ogni siRNA alle cellule MDCK o A549 mediante trasfezione inversa 8,11.
- Per questo, diluire in provette separate 100 nM di siRNA di controllo o siRNA caspasi o un volume raccomandato di reagente di trasfezione (vedere Tabella dei materiali) in 100 μL di mezzo appropriato (come OptiMEM, vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare ogni diluizione in duplice copia.
NOTA: Questo duplicato include una replica per analizzare il knockdown dell'espressione della caspasi mediante RT-qPCR o western blotting (se sono disponibili anticorpi contro le caspasi) e un'altra per valutare il recupero della proteina di interesse mediante western blotting. - Mescolare 100 μL di ciascuna soluzione di siRNA con 100 μL di soluzione di reagente di trasfezione (fase 2.3) e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso reagente siRNA-trasfezione.
- Nel frattempo, dividere e aggiungere 1 x 10 5 cellule MDCK o A549 in 800 μL del terreno di coltura completo, mescolare con 200 μL di complesso reagente di trasfezione siRNA (fase2.5 ) e aggiungere 1 mL della sospensione in un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti. Questa diluizione porta la concentrazione finale di siRNA di controllo o siRNA caspasi a 10 nM.
- Incubare le cellule a 37 °C sotto un'atmosfera di CO2 al 5% per 72 ore.
- Raccogliere le cellule da una replica come nel passaggio 1.10 ed elaborarle per convalidare o confermare il knockdown dell'espressione di caspasi 3, caspasi 6 e caspasi 7 mediante RT-qPCR o western blotting, rispettivamente, utilizzando metodi e protocolli standard 8,11.
- Infettare le cellule dell'altra replica con IAV come descritto nei passaggi 1.4-1.9 (senza inibitori).
- Dopo 24 ore, raccogliere, elaborare e analizzare le cellule mediante western blotting e misurare e quantificare il recupero proteico come descritto nei passaggi 1.10-1.20.
3. Mutagenesi sito-diretta per localizzare il/i sito/i di scissione della caspasi nel polipeptide
- Clonare la proteina codificante il gene di interesse in un plasmide di espressione11 di un mammifero o ottenerla da un laboratorio di ricerca o da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: È preferibile se il gene è clonato con un tag epitopo o come fusione GFP per distinguere il polipeptide espresso ectopicamente da quello espresso endogenamente durante il western blotting. - Utilizzando database di substrati di caspasi4 o strumenti di allineamento proteico, individuare i motivi di scissione della caspasi di consenso, XXXD e DXXD, sul polipeptide. Quasi tutti i motivi di scissione delle caspasi possiedono l'acido aspartico nel sito di scissione (P1)3,4.
- Mutare il presunto acido aspartico P1 in acido glutammico o in un amminoacido non polare (alanina, valina) mediante mutagenesi sito-diretta seguita da sequenziamento del DNA11 utilizzando metodi e protocolli standard.
- Fornire il DNA plasmidico wild-type (WT) e mutante alle cellule MDCK o A549 mediante trasfezione inversa11.
- Per questo, diluire 2 μg di DNA plasmidico o un volume raccomandato del reagente di trasfezione in 100 μL di un mezzo appropriato (vedere il punto 2.3 e la tabella dei materiali) in provette separate e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Mescolare 100 μL di ciascuna soluzione di DNA plasmidico con 100 μL della soluzione di reagente di trasfezione e incubare per 20-45 minuti a temperatura ambiente per formare il complesso reagente di trasfezione del DNA.
- Nel frattempo, dividere e aggiungere 3 x 105 cellule MDCK o A549 a 800 μL del terreno di coltura completo, mescolare con 200 μL di complesso reagente di trasfezione del DNA e aggiungere la sospensione da 1 mL a un pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti.
- Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
- Dopo 48 ore, infettare le cellule con IAV come descritto nei passaggi 1.4-1.9 (senza aggiungere gli inibitori).
- Dopo 24 ore, raccogliere, elaborare e analizzare le cellule mediante western blotting (se applicabile, utilizzando l'anticorpo di un tag epitopo o GFP). Quindi, misurare e quantificare il recupero proteico come descritto nei passaggi 1.10-1.20.
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Representative Results
Trattamento con inibitore della caspasi 3
È stato scoperto che i polipeptidi di cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 subiscono degradazione in risposta all'infezione da IAV sia nelle cellule canine (MDCK) che umane (A549, NHBE) 7,8,9. Utilizzando gli approcci di cui sopra, è stato scoperto che le caspasi ospiti indotte da IAV, in particolare la caspasi 3, causano la loro degradazione 7,8,9. La cortactina è stata degradata in modo dipendente dalla dose e dal tempo dell'infezione e in modo indipendente dal ceppo della cellula ospite e IAV7. Risultati simili sono stati ottenuti per HDAC48 e HDAC69. È interessante notare che la degradazione di tutte e tre le proteine ospiti ha coinciso con la scissione di NP virale 7,8,9, che è noto per subire la scissione mediata dalla caspasi14. Pertanto, è stato ipotizzato che anche la cortactina, HDAC4 e HDAC6 subiscano una scissione mediata dalla caspasi e la successiva degradazione. Per testare questo, in primo luogo, le cellule infette da IAV sono state trattate con un inibitore della caspasi 3 e il salvataggio dei polipeptidi cortactina, HDAC4 e HDAC6 è stato analizzato mediante western blotting. Tutti e tre i polipeptidi (così come le NP virali) si sono ripresi dalla degradazione indotta dall'infezione IAV dopo il trattamento con inibitori della caspasi 3 7,8,9. I dati rappresentativi7 per la cortactina sono mostrati nella Figura 1A. Questo recupero è stato quantificato misurando l'intensità delle bande proteiche e normalizzando il valore della banda della cortactina dal valore della corrispondente banda di actina (controllo del carico). Successivamente, il valore normalizzato di cortactina nei corrispondenti campioni non infetti è stato considerato al 100% per determinarne il valore nei campioni infetti. Questo metodo di quantificazione ha rappresentato il recupero del polipeptide della cortactina nelle cellule infette trattate con inibitore della caspasi 3 al 78,8% dal 20,7% nelle cellule infette non trattate7 (Figura 1B).
Knockdown mediato dall'interferenza dell'RNA dell'espressione della caspasi 3
Successivamente, è stato utilizzato uno strumento genetico, RNA interference (RNAi), seguito da western blotting per confermare il ruolo delle caspasi nella degradazione indotta dall'infezione IAV di cortactina11 e HDAC48. Nelle cellule caspasi 3-depleted (Figura 2C)11, sia i polipeptidi cortactina (Figura 2A)11 che HDAC48 recuperati dalla degradazione indotta dall'infezione IAV. Tuttavia, nelle cellule impoverite di caspasi 6 o caspasi 7 (Figura 2C)11, non è stato osservato alcun recupero significativo dei livelli di polipeptide della cortactina (Figura 2A)11. In particolare, quando quantificato e confrontato con i loro livelli nelle corrispondenti cellule non infette come menzionato sopra, il livello di polipeptide della cortactina nelle cellule infette con espressione di caspasi 3 impoverita è tornato all'83% dal 28,6% nelle cellule infette con espressione normale di caspasi 3 (Figura 2B)11.
Motivi di scissione della caspasi in cortictina e polipeptidi HDAC6
Infine, è stata esaminata la sequenza amminoacidica nei polipeptidi cortictina e HDAC6 e, nei motivi di scissione delle caspasi putative, l'acido aspartico in posizione P1 è stato mutato in acido glutammico 9,11. Questo approccio ha identificato l'acido aspartico 116 nel polipeptide 11 della cortactina e l'acido aspartico 1088 nelpolipeptide 9 HDAC6come sito di scissione della caspasi. La mutazione di entrambi i residui di acido aspartico in acido glutammico ha reso i polipeptidi cortactina (Figura 3A)11 e HDAC69 resistenti alla degradazione indotta dall'infezione da IAV. In particolare, quando quantificato e confrontato con i loro livelli nelle corrispondenti cellule non infette come menzionato sopra, il livello di polipeptide di cortactina mutante espresso da plasmide nelle cellule infette era del 77,9%, mentre il livello di polipeptide di cortactina wild-type espresso da plasmide nelle cellule infette era del 23,6% (Figura 3B)11.
Figura 1: Il polipeptide della cortactina subisce una degradazione mediata dalla caspasi 3 nelle cellule infette da IAV. (A) Le cellule MDCK sono state infettate dal ceppo del virus dell'influenza A/Nuova Caledonia/20/1999/H1N1 con un MOI di 0,5 e successivamente trattate come finte o con inibitore della caspasi 3 (Cas3-I, 40 μM). Dopo 24 ore, i polipeptidi di cortactina, NP virale e actina sono stati rilevati nei lisati cellulari totali mediante western blotting. UNI, non infetti; INF, infetto. Le frecce puntano al NP a tutta lunghezza e spaccato. (B) È stata quantificata l'intensità delle bande di cortactina e actina. Quindi, il valore della cortactina è stato normalizzato con il valore dell'actina. La quantità normalizzata di cortactina nei campioni UNI è stata considerata al 100% per determinarne la quantità nei corrispondenti campioni INF. I dati presentati sono mezzi ± SE di tre repliche biologiche. P = 0,0006, calcolato utilizzando ANOVA bidirezionale. ns, non significativo. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il knockdown dell'espressione della caspasi 3 ha salvato la degradazione del polipeptide della cortactina nelle cellule infette da IAV. (A) Le cellule A549 sono state trasfettate in duplicati con 10 nM di controllo (Ctrl), caspasi 3 (Cas3), caspasi 6 (Cas6) o caspasi 7 (Cas7) siRNA. Dopo 72 ore, le cellule in una replica sono state raccolte e lavorate per estrarre l'RNA totale. Le cellule nell'altra replica sono state infettate con il sottotipo di virus influenzale A / WSN / 1933 / H1N1 con un MOI di 3.0. Dopo 24 ore, i polipeptidi di cortactina, NP virale e actina sono stati rilevati mediante western blotting. UNI, non infetti; INF, infetto. (B) L'intensità delle bande di cortactina e actina è stata quantificata e il valore della cortactina è stato normalizzato con il valore dell'actina. Quindi, la quantità normalizzata di cortactina nei campioni UNI è stata considerata al 100% per determinare la sua quantità nei corrispondenti campioni INF. I dati presentati sono mezzi ± SE di tre repliche biologiche. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, calcolato utilizzando ANOVA bidirezionale. ns, non significativo. (C) L'RNA totale estratto sopra è stato convertito in cDNA, che è stato poi utilizzato come modello per rilevare i livelli di mRNA di caspasi 3, caspasi 6, caspasi 7 e actina mediante RT-qPCR. Il livello di mRNA di actina è stato utilizzato come riferimento e il livello di mRNA di ciascuna caspasi nelle cellule trasfettate dal siRNA di controllo (Ctrl) e dalle rispettive cellule trasfettate di caspasi siRNA (Cas) è stato calcolato utilizzando il metodo standard 2-ΔΔCT. P < 0,0001, calcolato utilizzando ANOVA bidirezionale. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: La mutazione dell'acido aspartico 116 in acido glutammico ha reso il polipeptide della cortactina resistente alla degradazione indotta dall'infezione da IAV . (A) Le cellule MDCK sono state trasfettate con un plasmide che esprime la fusione wild-type (WT) o mutata (D116E) GFP-cortactina. Dopo 48 ore, le cellule sono state infettate con il sottotipo di virus influenzale A / WSN / 1933 / H1N1 con un MOI di 3.0. Dopo 24 ore, i polipeptidi GFP-cortactina, NP virale e actina sono stati rilevati mediante western blotting. UNI, non infetti; INF, infetto. (B) L'intensità delle bande di cortactina e actina è stata quantificata e il valore della cortactina è stato normalizzato con il valore dell'actina. Quindi, la quantità normalizzata di cortactina nei campioni UNI è stata considerata al 100% per determinare la sua quantità nei corrispondenti campioni INF. I dati presentati sono mezzi ± SE di tre repliche biologiche. **P = 0,001, calcolato utilizzando ANOVA bidirezionale. ns, non significativo. Questa cifra è stata modificata da Chen et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
È stabilito che i virus adattano i fattori e i percorsi dell'ospite a loro vantaggio. A loro volta, le cellule ospiti resistono a ciò impiegando varie strategie. Una di queste strategie è la PANoptosis, che le cellule ospiti usano come strategia antivirale contro le infezioni virali. Tuttavia, virus come IAV hanno evoluto le proprie strategie per contrastare la PANoptosi e sfruttarla a loro vantaggio 1,3,6. Questa interazione comporta la scissione di varie proteine dell'ospite e virali da parte delle caspasi. Identificare queste caspasi e i loro siti di scissione nelle proteine del substrato è importante per chiarire i meccanismi e il significato di tale interazione.
A tal fine, sono stati utilizzati metodi biochimici e molecolari standard per identificare le caspasi e i loro siti di scissione nella cortactina ospite, HDAC4 e HDAC6 7,8,9,11. I protocolli sopra descritti possono essere utilizzati per tali studi che coinvolgono virus influenzali, altri virus di mammiferi, altri microbi e stimoli esterni come tossine e sostanze chimiche. Inoltre, questi metodi possono essere replicati in un laboratorio di biologia molecolare standard con competenze pertinenti e non richiedono attrezzature specializzate e formazione software. Il formato della piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti è stato adattato con successo per questi e simili studi per generare quantità di campione sufficienti per le analisi a valle mediante western blotting e RT-qPCR. Tuttavia, se necessario, questo formato può essere ridimensionato o upscalato di conseguenza. Quando si esegue un esperimento che coinvolge un inibitore della caspasi per la prima volta, si suggerisce di utilizzare un inibitore pan-caspasi (Z-VAD-FMK) insieme a un inibitore del lisosoma e del proteasoma per valutare se la proteina di interesse subisce una degradazione mediata dalla caspasi. Inoltre, oltre a NH4Cl e MG132, possono essere utilizzati altri inibitori del lisosoma e del proteasoma come la Bafilomicina A e l'Epossicomica, rispettivamente. Dopo risultati positivi con un inibitore della pan-caspasi, possono essere utilizzati inibitori specifici delle singole caspasi o possono essere impiegate interferenze RNA. Per i primi, è importante ottimizzare le concentrazioni inibitorie efficaci per evitare tossicità per il tipo di cellula bersaglio e risultati non specifici.
Uno strumento genetico come l'interferenza dell'RNA o CRISPR deve essere impiegato accanto per confermare il coinvolgimento delle caspasi perché gli inibitori reagiscono in modo incrociato. In alternativa, è possibile eseguire un'interferenza RNA o uno schermo CRISPR che mira individualmente a tutte le caspasi conosciute. Le coppie di primer siRNA, gRNA e RT-qPCR a tutte le caspasi conosciute potrebbero essere acquistate come pre-progettate o progettate utilizzando strumenti online. Inoltre, due o più caspasi possono essere esaurite contemporaneamente per valutare la scissione sequenziale o cooperativa dei polipeptidi (questa strategia è stata recentemente utilizzata in uno studio ancora da pubblicare). Si ritiene che l'interferenza dell'RNA sia uno strumento ideale per la ricerca sull'interazione virus-cellula ospite. Quest'ultimo richiede una manipolazione controllata dell'espressione genica dell'ospite in modo che le cellule ospiti rimangano relativamente vitali per l'infezione virale e il completamento del ciclo di vita per visualizzare il fenotipo di tale manipolazione. Tuttavia, è necessario ottimizzare un'efficace concentrazione di siRNA e una combinazione di reagenti siRNA-trasfezione per ciascun tipo di cellula per un knockdown ottimale e un rapporto di vitalità per la successiva infezione.
Per individuare i presunti motivi di scissione delle caspasi, sono stati sviluppati molti database come CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 e TopFIND23,24. È stato eseguito uno screening visivo per localizzare questi motivi sullapolipetide 9 HDAC6, ma per la cortactina11, è stato utilizzato il CaspDB (anche se il sito Web CaspDB è stato inaccessibile ultimamente). Questi motivi sono stati confermati con successo come siti di scissione della caspasi mutando l'acido aspartico P1 in acido glutammico. Tuttavia, si suggerisce di mutare l'acido aspartico in un amminoacido non polare simile all'alanina o alla valina perché alcune caspasi possono scindersi dopo l'acido glutammico P14. Questo esercizio può portare prontamente all'identificazione dei siti di scissione delle caspasi, ma potrebbe richiedere la generazione di decine di mutanti se il polipeptide bersaglio è ricco di acidi aspartico e i presunti motivi bersaglio non sono canonici. Per la consegna di plasmidi (e siRNA) alle cellule, è possibile eseguire la trasfezione in avanti, anziché inversa. Inoltre, la dose di infezione e la cinetica del tempo devono essere eseguite utilizzando un gradiente del 4% -20% SDS-PAGE per il western blotting per valutare la cinetica di degradazione dei polipeptidi e identificare eventuali prodotti di scissione di dimensioni più piccole. Infine, per confermare la proteina di interesse come substrato diretto della caspasi, potrebbero essere sviluppati saggi biochimici in vitro contenenti caspasi purificate e proteine bersaglio (WT o mutanti) ed eventuali cofattori.
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Disclosures
L'autore non ha conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
L'autore riconosce Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nuova Zelanda), H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), Dipartimento di Microbiologia e Immunologia e Scuola di Scienze Biomediche (Università di Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
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