Influensa A-virus (IAV) infeksjon aktiverer caspases som spalter vert og virale proteiner, som igjen har pro- og antivirale funksjoner. Ved å bruke inhibitorer, RNA-interferens, stedsrettet mutagenese og western blotting og RT-qPCR-teknikker, ble caspases i infiserte pattedyrceller som spalter vertskortaktin og histondeacetylaser identifisert.
Caspases, en familie av cysteinproteaser, orkestrerer programmert celledød som respons på ulike stimuli, inkludert mikrobielle infeksjoner. Opprinnelig beskrevet å forekomme ved apoptose, er programmert celledød nå kjent for å omfatte tre sammenhengende veier: pyroptose, apoptose og nekroptose, sammen laget som en prosess, PANoptosis. Påvirkning Et virus (IAV) infeksjon induserer PANoptosis i pattedyrceller ved å indusere aktivering av forskjellige caspases, som igjen spalter forskjellige vert så vel som virale proteiner, noe som fører til prosesser som aktivering av vertens medfødte antivirale respons eller nedbrytning av antagonistiske vertsproteiner. I denne forbindelse har caspase 3-mediert spaltning av vertskortaktin, histon deacetylase 4 (HDAC4) og histon deacetylase 6 (HDAC6) blitt oppdaget i både dyre- og humane epitelceller som respons på IAV-infeksjonen. For å demonstrere dette ble inhibitorer, RNA-interferens og stedsrettet mutagenese brukt, og deretter ble spaltning eller motstand mot spaltning og gjenvinning av kortaktin-, HDAC4- og HDAC6-polypeptider målt ved vestlig blotting. Disse metodene, sammen med RT-qPCR, danner en enkel, men effektiv strategi for å identifisere verten så vel som virale proteiner som gjennomgår caspase-mediert spaltning under en infeksjon av IAV eller andre humane og animalske virus. Denne protokollen utdyper de representative resultatene av denne strategien, og måtene å gjøre den mer effektiv diskuteres også.
Influensa A-virus (IAV) er det prototypiske medlemmet av Orthomyxoviridae-familien og er kjent for å forårsake globale epidemier og uforutsigbare pandemier. IAV forårsaker menneskelig luftveissykdom, influensa, kjent som “influensa”. Influensa er en akutt sykdom som resulterer i induksjon av vertspro- og antiinflammatoriske medfødte immunresponser og død av epitelceller i menneskets luftveier. Begge prosessene styres av et fenomen som kalles programmert celledød1. Signaleringen for programmert celledød induseres så snart forskjellige patogengjenkjenningsreseptorer fornemmer de innkommende viruspartiklene i vertsceller. Dette fører til programmering av død av infiserte celler og signalering til de nærliggende friske cellene ved tre sammenhengende veier kalt pyroptose, apoptose og nekroptose – nylig laget som en prosess, PANoptosis1.
PANoptose innebærer proteolytisk behandling av mange verts- og virusproteiner fra induksjon til utførelse. Slik behandling av proteiner ledes primært av en familie av cysteinproteaser kalt caspases 1,2. Opptil 18 caspases (fra caspase 1 til caspase 18) er kjent3. De fleste caspases uttrykkes som pro-caspases og aktiveres ved å gjennomgå sin egen proteolytiske behandling enten ved autokatalyse eller andre caspases4 som svar på en stimulus som en virusinfeksjon. PANoptosis av IAV-infiserte celler ble antatt å være en vertsforsvarsmekanisme, men IAV har utviklet måter å unngå og utnytte den for å lette replikasjonen 1,2,5,6. En av dem er å motvirke vertsfaktorene via caspase-mediert spaltning eller nedbrytning som enten er iboende antivirale eller forstyrrer et av trinnene i IAV-livssyklusen. Til dette formål har vertsfaktorer, cortactin, HDAC4 og HDAC6 blitt oppdaget å gjennomgå caspase-mediert spaltning eller nedbrytning i IAV-infiserte epitelceller 7,8,9. HDAC4 og HDAC6 er anti-IAV-faktorer 8,10, og kortaktin forstyrrer IAV-replikasjon på et senere stadium av infeksjon, potensielt under viral montering og spirende 11.
I tillegg aktiveres også forskjellige caspaser, som igjen spalter flere proteiner for å aktivere vertsinflammatorisk respons under IAV-infeksjon 1,2. Videre gjennomgår nukleoprotein (NP), ionkanal M2-protein av IAV 12,13,14 og forskjellige proteiner av andre virus 3,15,16 også caspasemediert spaltning under infeksjon, noe som påvirker viral patogenese. Derfor er det et kontinuerlig behov for å studere caspase-mediert spaltning eller nedbrytning av verts- og virusproteiner under IAV og andre virusinfeksjoner for å forstå det molekylære grunnlaget for viral patogenese. Her presenteres metodene for å (1) vurdere spaltning eller nedbrytning av slike proteiner av caspases, (2) identifisere disse caspasene og (3) lokalisere spaltningsstedene.
Det er fastslått at virus skreddersyr vertsfaktorene og veiene til deres fordel. I sin tur motstår vertscellene det ved å bruke ulike strategier. En av disse strategiene er PANoptosis, som vertsceller bruker som en antiviral strategi mot virusinfeksjoner. Imidlertid har virus som IAV utviklet sine egne strategier for å motvirke PANoptose og utnytte det til deres fordel 1,3,6. Dette samspillet innebærer spaltning av forskjel…
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren anerkjenner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice og Phyllis Paykel Trust (New Zealand), HS og JC Anderson Trust (Dunedin), og Institutt for mikrobiologi og immunologi og School of Biomedical Sciences (University of Otago).
A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II – Calbiochem' |
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |