Summary
אנו מתארים שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי הרג טבעיים). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר ולנתח תאים מגנטיים ובעלי תווית פלואורסצנטית.
Abstract
מונונוקלאוזיס זיהומית (IM) היא תסמונת חריפה הקשורה בעיקר לזיהום ראשוני בנגיף אפשטיין-בר (EBV). הסימפטומים הקליניים העיקריים כוללים חום לא סדיר, לימפדנופתיה, ועלייה משמעותית בלימפוציטים בדם היקפי. המנגנון הפתוגני של IM עדיין לא ברור; אין שיטה טיפולית יעילה עבורו, כאשר קיימים בעיקר טיפולים סימפטומטיים. השאלה העיקרית ב- EBV אימונוביולוגיה היא מדוע רק תת-קבוצה קטנה של אנשים נגועים מראה תסמינים קליניים חמורים ואף לפתח ממאירויות הקשורות ל- EBV, בעוד שרוב האנשים הם אסימפטומטיים לכל החיים עם הנגיף.
תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. תאי הרג טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים ציטוטוקסיים החשובים להריגת תאים נגועים ב-EBV. חלקם של תאי CD4+ T פוחת בעוד זה של תאי CD8+ T מתרחב באופן דרמטי במהלך זיהום EBV חריף, וההתמדה של תאי CD8+ T חשובה לשליטה לכל החיים ב- IM. תאי מערכת החיסון האלה ממלאים תפקידים חשובים בהודעות מיידיות, ויש לזהות את תפקודם בנפרד. לשם כך, מונוציטים מופרדים תחילה מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) של אנשים עם הודעות מיידיות באמצעות מיקרובי CD14, עמודה ומפריד מגנטי.
יתר ה-PBMCs מוכתמים בחלבון פרידינין-כלורופיל (PerCP)/ציאנין 5.5 אנטי-CD3, אלופיקוציאנין (APC)/ציאנין 7 אנטי-CD4, פיקואריתרין (PE) אנטי-CD8, פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-CD19, APC אנטי-CD56 ונוגדנים APC נגד CD16 למיון תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK באמצעות ציטומטר זרימה. יתר על כן, ריצוף תעתיק של חמש תת-אוכלוסיות בוצע כדי לחקור את תפקידיהן ואת המנגנונים הפתוגניים שלהן ב- IM.
Introduction
נגיף אפשטיין-בר (EBV), נגיף γ-הרפס הידוע גם בשם נגיף הרפס אנושי מסוג 4, נמצא בכל מקום באוכלוסייה האנושית ויוצר זיהום סמוי לכל החיים ביותר מ-90% מהאוכלוסייה הבוגרת1. רוב ההדבקות הראשוניות ב-EBV מתרחשות במהלך הילדות וההתבגרות, כאשר חלק קטן מהחולים מתבטאים במונונוקלאוזיס זיהומי (IM)2, ומראים אימונופתולוגיה אופיינית, כולל תגובה חיסונית פעילה עם תאי CD8+ T בדם והתפשטות חולפת של תאי B נגועים ב-EBV בלוע3. מהלך ה- IM עשוי להימשך 2-6 שבועות ורוב החולים מחלימים היטב4. עם זאת, אנשים מסוימים מפתחים תסמינים מתמשכים או חוזרים דמויי IM עם תחלואה ותמותה גבוהות, המסווגות כזיהום EBV פעיל כרוני (CAEBV)5. בנוסף, EBV הוא נגיף אונקוגני חשוב, הקשור קשר הדוק למגוון ממאירויות, כולל ממאירות אפיתליואידית ולימפואידית כגון קרצינומה של הלוע, לימפומה של בורקיט, לימפומה של הודג'קין (HL) ולימפומה של תאי T/NK6. למרות ש- EBV נחקר במשך למעלה מ -50 שנה, הפתוגנזה שלו והמנגנון שבאמצעותו הוא גורם להתפשטות הלימפוציטים לא הובהרו במלואם.
מספר מחקרים חקרו את החתימות המולקולריות לאימונופתולוגיה של זיהום EBV על ידי ריצוף תעתיק. Zhong et al. ניתחו פרופילים של תעתיק שלם של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מילדים סינים עם IM או CAEBV כדי למצוא שהרחבת תאי T CD8+ נמצאה בעיקר בקבוצת IM7, מה שמרמז על כך שתאי CD8+ T עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-IM. באופן דומה, מחקר אחר מצא שיעורים נמוכים יותר של תאי T ו-CD19+ B ציטוטוקסיים ספציפיים ל-EBV ואחוזים גבוהים יותר של תאי CD8+ T בחולים עם IM שנגרם על ידי זיהום EBV ראשוני מאשר בחולים עם IM שנגרם הן על ידי הפעלה מחדש של EBV והן על ידי סוכנים אחרים8. תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. Al Tabaa et al. מצאו שתאי B היו אינטופלסמבלסטים פעילים ומתמיינים באופן פוליקלונלי (CD19+, CD27+ ו-CD20−, ו-CD138− תאים) ותאי פלזמה (CD19+, CD27+ ו-CD20− ו-CD138+) במהלך IM9. יתר על כן, Zhong et al. מצאו כי סמני מונוציטים CD14 ו- CD64 היו מווסתים ב- CAEBV, מה שמרמז על כך שמונוציטים עשויים למלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית של CAEBV באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) ופאגוציטוזה היפראקטיבית7. Alka et al. אפיינו את התעתיק של MACS מיון CD56 dimCD16+ NK תאים מארבעה חולים של IM או HL ומצאו כי תאי NK הן IM והן HL היו בעלי חסינות מולדת מווסתת וגנים לאיתות כימוקין, אשר יכול להיות אחראי על תגובתיות נמוכה של תאי NK10. בנוסף, Greenough et al. ניתחו ביטוי גנים של תאי CD8+ T ממוינים מ-10 PBMCs של אנשים עם IM. הם דיווחו כי חלק גדול מתאי ה-CD8+ T בהודעות מיידיות היו ספציפיים לנגיף, הופעלו, התחלקו והתכוננו להפעיל פעילויות השפעה11. הן תגובות בתיווך תאי T, ספציפיות ל-EBV, והן תגובות לא ספציפיות בתיווך תאי NK, ממלאות תפקידים חיוניים במהלך זיהום EBV ראשוני. עם זאת, מחקרים אלה חקרו רק את תוצאות השעתוק של תערובת מגוונת של תאי חיסון או רק תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים, שאינה מספיקה להשוואה מקיפה של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון אצל ילדים עם IM באותו מצב מחלה.
מאמר זה מתאר שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של PBMCs (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר תאים מגנטיים ומסומנים פלואורסצנטיים באמצעות מפריד מגנטי ו- FACS או לנתח אותם על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להפיק RNA מהתאים המטוהרים לצורך ריצוף תעתיק. שיטה זו תאפשר אפיון וביטוי גנים של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי האימונופתולוגיה של זיהום EBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות דם התקבלו מחולים עם IM (n = 3), נשאים בריאים של EBV (n = 3) וילדים לא נגועים ב- EBV (n = 3). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, אוניברסיטת קפיטל מדיקל, וכל המחקרים אושרו אתית. אישור אתי הושג על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: [2021]-E-056-Y). הסכמה מדעת של המטופלים ויתרה מכיוון שהמחקר השתמש רק בדגימות הנותרות לבדיקה קלינית. כל הנתונים הוסרו באופן מלא והפכו לאנונימיים כדי להגן על פרטיות המטופלים.
1. בידוד של PBMCs מדם היקפי
- לאסוף דם היקפי טרי (2 מ"ל) מחולים עם IM לתוך צינורות K3EDTA על ידי venipuncture סטנדרטי.
הערה: התהליך צריך להיות מהיר כדי לשמור על כדאיות התא. - יש לדלל את הדם ההיקפי לנפח כפול באמצעות תמיסת מלח עם מאגרי פוספט (PBS) ולהניח אותו על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים אנושי (צפיפות: 1.077 ± 0.001 גרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
הערה: יחס הנפח של דם, PBS ומדיום הפרדה היה 1:1:1. הוסיפו את הדם באיטיות למדיום ההפרדה, וצנטריפוגה מיד כדי למנוע מהדם לשקוע במדיום ההפרדה. - צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את השכבה האמצעית (PBMCs מועשרים) לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל.
הערה: לאחר צנטריפוגה, בתחתית הצינור נמצאים אריתרוציטים, השכבה האמצעית היא מדיום ההפרדה, השכבה העליונה היא פלזמה, ובין שכבת הפלזמה לשכבת נוזל ההפרדה היו PBMCs (כולל לימפוציטים ומונוציטים). - לשטוף את PBMCs עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר; השליכו את הסופר-נטנט בזהירות.
- חזור על הכביסה והצנטריפוגה (שלב 1.4) 2 x. השהה את ה- PBMCs עם 1 מ"ל של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי מבוסס טריפאן כחול.
2. בידוד של CD14 + מונוציטים מ- PBMCs באמצעות CD14 microads
- הכינו תמיסת חיץ המכילה 0.5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-2 mM EDTA ב-PBS (pH 7.2). שמור על המאגר קר (2−8 מעלות צלזיוס).
הערה: הסר את המאגר לפני השימוש כבועות אוויר שעלולות לחסום את העמודה. שמור על התאים קרים כדי למנוע סגירה של הנוגדנים על פני התא ותיוג תאים לא ספציפיים. - צנטריפוגה PBMCs ב 300 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט. השהה את התאים עם 80 μL של המאגר. הוסף 20 μL של מיקרובי CD14 לתלויית התא.
הערה: אם יש ≤107 PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >107 PBMCs, הגדל באופן יחסי את כל אמצעי האחסון של הריאגנטים ואת הנפח הכולל. - מערבבים היטב את מיקרובי CD14 ואת התאים בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ודוגרים במשך 15 דקות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-PBMCs עם 1 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט לחלוטין. השהה את התאים עם 500 μL של המאגר.
הערה: אם יש ≤108 PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >108 PBMCs, הגדל באופן יחסי את נפח המאגר. - הפרדה מגנטית עם עמודות:
- שים את העמודה על מפריד חרוז מגנטי, ולשטוף את העמוד עם 3 מ"ל של מאגר. הוסף את השעיית התא (משלב 2.3) לעמודה.
- אסוף את התאים ללא תווית העוברים דרך העמודה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ושטוף את העמוד עם 3 מ"ל של חיץ. לשטוף את העמוד עם 3 x 3 מ"ל של חיץ. לאסוף את סך הקולחים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- מקם את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר לעמודה. דחפו את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי לשטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- צנטריפוגה של התאים המסומנים מגנטית ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש להשעות את התאים ב-500 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לשימוש בריצוף תעתיק עוקב.
3. הפרדת אוכלוסיות לימפוציטים מ-PBMCs על ידי צביעת נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי ו-FACS
- צנטריפוגה של תאים ללא תווית (שלב 2.4.2) ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. השהה את התאים ב-100 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- הוסף 2 μL מכל נוגדן מסומן (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) ל-100 μL של תרחיף התא (הנפחים ומידע הפלואורופור המצומד של נוגדנים מוצגים בטבלה 1), דגירה על קרח למשך 30 דקות, והגנה מפני אור.
- לשטוף את התאים 2 x על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את התאים ב-500 μL של PBS בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מערבבים את תרחיף התאים בעדינות לפני רכישת נתונים על ציטומטר מיון תאי זרימה.
4. הגדרת פרמטר ציטומטריה של זרימה
- קח 100 μL של מתלה התא (ראה סעיף 1) בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לפי הצורך, והגדר דגימת בקרה שלילית, דגימת צביעה בודדת CD3, דגימת צביעה בודדת CD4, דגימת צביעה יחידה של CD8, דגימת צביעה בודדת של CD19 ודגימת צביעה של CD56/CD16.
- הוסף 2 μL של הנוגדן הפלואורסצנטי המתאים לכל 100 μL של תרחיף התא והמערבולת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם ולשאוף את supernatant. החזירו את הכדורים עם 500 μL של PBS ומערבולת.
- הזמינו את זרם המיון ועיכבו את הטיפות באמצעות חרוזי הפלואורסצנט באופן הבא:
- פתח את מערכת מיון התאים, הפעל את תוכנית ההפעלה, התקן את הזרבובית בגודל 85 מיקרומטר ופתח את זרם המיון. הגדר את מתח המיון ל-4,500 וולט, ואת ה-Freq ל-47.
- התאם את הפרמטרים בעיקר על ידי התאמת נקודת השבירה של טיפות הזרימה הראשית והשהיית הטיפות בהתאם להוראות היצרן12. הגדר את מיקום נקודת העצירה הראשון של droplet (Drop1) ל- 275, ואת ה- Gap ל- 8 בחלון Breakoff. הפעל את מצב המיון האוטומטי Sweet Spot כדי לאפשר לציטומטריה לקבוע באופן אוטומטי את ערך משרעת הטיפות כדי לייצב את הזרם.
- התאם את השהיית הטיפות ל-30.31 בחלון Side Stream על ידי טעינת החרוזים הפלואורסצנטיים, כדי להבטיח שהחרוזים ישיגו סטיית זרימה צדדית של >99% במצב כוונון ראשוני או עדין.
- עיין באסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 1 לביצוע gating באופן הבא:
- באמצעות תרשים נקודה של אזור פיזור קדמי (FSC-A)/אזור פיזור צדדי (SSC-A), ציירו את שער המצולע (P1) כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה .
- באמצעות תרשים נקודה בגובה FSC-A/FSC (FSC-H), ציירו את שער המצולע (P2) כדי לזהות את התאים הבודדים ולא לכלול כפילים (איור 1A).
- באמצעות תרשים נקודה מסוג CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, ציירו את השער המלבני (P3) כדי לבחור תאי CD3+ T ותאי CD19+ B (איור 1A,B).
- באמצעות תרשים נקודה CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, צייר שער מלבני כדי לבחור תאי T CD4+ ותאי T CD8+ (תאים עם פלואורסצנציה גבוהה עבור סמנים אלה, בהתאמה).
- באמצעות מתווה נקודה מסוג CD56/CD16 APC-A/SSC-A, ציירו שער מלבני כדי לבחור תאי CD56+/CD16+ NK (איור 1C).
- התאם פרמטרים אינסטרומנטליים באמצעות דגימת הבקרה השלילית:
- התקן את צינור הבקרה השלילית על יציאת הטעינה ולחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה. בחר את הגדרות הציטומטר בתוכנה.
- בחלון המפקח, לחץ על הכרטיסייה פרמטרים והתאם את המתחים של FSC, SSC וצבעים פלואורסצנטיים שונים; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- התאם את הפיצוי באמצעות הדגימות המוכתמות13.
- טען את הצינורות המוכתמים הבודדים על הציטומטריה ברצף ובחר הגדרות ציטומטר בתוכנה. לחץ על הכרטיסייה פיצוי כדי להתאים את הפיצוי.
הערה: ההתייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה מוצגת בטבלה 2.
- טען את הצינורות המוכתמים הבודדים על הציטומטריה ברצף ובחר הגדרות ציטומטר בתוכנה. לחץ על הכרטיסייה פיצוי כדי להתאים את הפיצוי.
5. מיון ואיסוף נתונים באמצעות ציטומטריה של זרימה
- מערבבים את תרחיף התאים (PBMCs מופרדים על פי סעיפים 1-3) לזמן קצר כדי להשעות את התאים לפני טעינת הצינור לתוך הציטומטר. שמור את הצינורות הנותרים על קרח.
- הוסף 200 μL של FBS לארבעה צינורות זרימת איסוף כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לדופן הצינור והנח אותם בתא איסוף הציטומטר.
- אסוף תאי CD3+CD4+ T, תאי CD3+CD8+ T, תאי CD3−CD19+ B ותאי CD3− CD56+/CD16+ NK בנפרד מהדגימה של מטופל עם IM בארבעת צינורות הזרימה (איור 2A).
- צנטריפוגה של התאים המופרדים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של מגיב בידוד RNA לתאים לריצוף שעתוק.
- הפרד את תת-האוכלוסיות של תאי מערכת החיסון של דגימות מנשאי EBV בריאים ומילדים שאינם נגועים ב-EBV בהתאם לשלבים שלעיל (איור 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התייחסות לאסטרטגיית הגטינג
אסטרטגיית המיון המשמשת למיון ארבע תת-אוכלוסיות הלימפוציטים מוצגת באיור 1. בקצרה, לימפוציטים נבחרים (P1) על תרשים נקודה המציג את הגרנולוסיות (SSC-A) לעומת הגודל (FSC-A). לאחר מכן, תאים בודדים נבחרים (P2) בהתוויית נקודה המציגה את הגודל (FSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-H), בעוד שתאים כפולים אינם נכללים. תאי CD3+ T (P3) ותאי CD19+ B (איור 1B) נבחרים בנפרד בתרשים נקודה המציג את CD3 PerCP-Cy5.5-A לעומת CD19 FITC-A. תאי CD8+ T ותאי CD4+ T נבחרים בנפרד בתרשים נקודה המציג CD8 PE-A לעומת CD4 APC-Cy7-A מ-P3. תאי CD16+/CD56+ NK נבחרים במתווה נקודה המציג את CD56/CD16 APC-A לעומת SSC-A מ-P4 (איור 1C).
התוצאות המייצגות של ארבע תת-אוכלוסיות תאים הממוינות מדגימות של מטופלים עם IM בשיטה המתוארת מוצגות באיור 2A. ביצענו גם מיון תאים על דגימות מנשאי EBV בריאים וילדים לא נגועים ב-EBV כקבוצות ביקורת כדי לאשר את היתכנות הניסוי הזה. התוצאות המייצגות של תת-אוכלוסיות תאים המופרדות מדגימה בריאה של נשא EBV מוצגות באיור 2B. התוצאה המייצגת של תת-אוכלוסיות תאים הממוינות מהמדגם של ילדים לא נגועים ב-EBV מוצגת באיור 2C. כפי שניתן לראות באיור 2, P1 היה מגודר כדי לזהות לימפוציטים ותאים כפולים לא נכללו דרך P2; P3 היה מגודר לבחירת תאי CD3+ T ו-P5 היה מגודר לבחירת תאי CD19+ B; CD3+ CD8+ תאי T (P6) ותאי CD3+ CD4+ T (P7) נבחרו בנפרד מ-P3; תאי CD16+/CD56+ NK (P8) נבחרו מתוך P4. כל אחת מתת-האוכלוסיות הללו ניתנת למיון ואיסוף בנפרד לניסויים במורד הזרם. מערכת זו שימשה לניתוח ביטוי גנים באמצעות מיצוי RNA וריצוף תעתיק.
כפי שדווח בטבלה 3, נצפתה עלייה בתאי CD3+ CD8+ T בחולים עם IM בהשוואה הן לנשאי EBV בריאים והן לילדים שאינם נגועים ב- EBV (46.5 ± 4.0 לעומת 27.0 ± 0.1 ו- 46.5 ± 4.0 לעומת 24.7 ± 2.9, % CD3+ CD8+ תאי T לכל סך הלימפוציטים); שיעורים נמוכים יותר של תאי CD3+ CD4+ T ותאי CD19+ B נצפו בחולים עם IM בהשוואה לנשאי EBV בריאים וילדים לא נגועים ב- EBV (13.4 ± 1.5 לעומת 19.3 ± 1.5 ו- 13.4 ± 1.5 לעומת 23.6 ± 3.2, % CD3+ CD4+ תאי T לכל סך הלימפוציטים; 1.4 ± 0.3 לעומת 7.6 ± 0.7 ו-1.4 ± 0.3 לעומת 9.0 ± 1.5, % CD19+ תאי B לכל סך הלימפוציטים). ירידה בשיעורים של תאי CD16+/CD56+ NK נצפתה בחולים עם IM בהשוואה לילדים שאינם נגועים ב-EBV (7.5 ± 0.5 לעומת 10.7 ± 0.4, % CD16+/CD56+ תאי NK לכל סך הלימפוציטים). תוצאות אלה אימתו את היעילות של פרוטוקול מיון זה והראו כי הפרופורציות של תת-קבוצות לימפוציטים שונות בחולים עם ילדים לא נגועים ב- IM ו- EBV.
איור 1: אסטרטגיית גיתור כוללת המשמשת למיון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון מ-PBMCs. (A) מסנן PerCP-Cy5.5 שימש להפרדת תאי CD3+ T. תאי CD8+ T ותאי T מסוג CD4+ נבחרו בנפרד בתרשים נקודה המציג CD8 PE-A לעומת CD4 APC-Cy7-A מ-P3. (B) מסנן FITC שימש לזיהוי תאי CD19+ B. (C) מסנן ה-APC שימש להפרדת תאי CD16+/CD56+ NK מ-P4. קיצורים: PBMCs = תאי דם חד-גרעיניים היקפיים; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור קדימה; PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תוצאות מייצגות של ארבע תת-אוכלוסיות תאים שבודדו בהצלחה בשיטה המתוארת. (A) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של חולה עם IM. (B) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של נשא EBV בריא. (C) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של ילדים לא נגועים ב-EBV. P1, שער העלילה נקודה כדי לזהות לימפוציטים; P2, שער התוויית נקודה לבחירת תאים בודדים; P3, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD3+ T; P4, שער העלילה נקודה לזיהוי CD3- CD19- לימפוציטים; P5, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD19+ B; P6, שער התוויית נקודה לבחירת CD3+ CD8+ תאי T מ-P3; P7, שער התוויית נקודה לבחירת CD3+ CD4+ תאי T מ- P3; P8, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD16+/CD56+ NK מ-P4. קיצורים: EBV = וירוס אפשטיין-בר; IM = מונונוקלאוזיס זיהומיות; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור קדימה; PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מטרת נוגדנים | פלואורופור מצומד | המינון | שיבוט | איזוטיפ |
| תקליטור3 | PerCP/ציאנין5.5 | 2 מיקרון | SK7 | עכבר IgG1, κ |
| תקליטור4 | APC/ציאנין7 | 2 מיקרון | SK3 | עכבר IgG1, κ |
| תקליטור8 | PE | 2 מיקרון | SK1 | עכבר IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 מיקרון | HIB19 | עכבר IgG1, κ |
| CD56 | נגמ"ש | 2 מיקרון | 5.1H11 | עכבר IgG1, κ |
| CD16 | נגמ"ש | 2 מיקרון | 3G8 | עכבר IgG1, κ |
טבלה 1: נוגדנים המשמשים לציטומטריה של זרימה. קיצורים: PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט.
| התייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה (%) | |||||
| PE | נגמ"ש | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| נגמ"ש | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
טבלה 2: התייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה. קיצורים: PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט.
| שיעור הלימפוציטים של תת-אוכלוסיות שונות בסך הכל לימפוציטים ממוינים (%) | |||
| תת-אוכלוסייה של לימפוציטים | הודעות מיידיות | מנשאי EBV בריאים | ילדים לא נגועים ב-EBV |
| תאי T של CD3+ | 80.5 ± 1.8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3+ CD8+ תאי T | 46.5 ± 4.0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3+ CD4+ תאי T | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ תאי NK | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19+ תאי B | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
טבלה 3: שיעור הלימפוציטים הממוינים של קבוצות שונות. קיצורים: EBV = וירוס אפשטיין-בר; IM = מונונוקלאוזיס זיהומיות; NK = רוצח טבעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מייצג דרך יעילה למיין תת-אוכלוסיות של תאי חיסון היקפיים בדם. במחקר זה, דגימות דם ורידי מחולים עם IM, נשאים בריאים של EBV וילדים לא נגועים ב- EBV נבחרו כמטרת המחקר. עבודה זו באמצעות הדם ההיקפי של חולים של IM מתמקדת בעיקר בניתוח וקביעת הפרופורציות של תת-קבוצות תאים שונות באמצעות ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים. ריצוף תעתיק משמש בעיקר לזיהוי וניתוח של תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים שלא הספיקה להשוואות מקיפות וספציפיות של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בילדים עם IM באותו מצב מחלה. לכן, מיון מספר סוגים של תאים מהדם ההיקפי וביצוע ריצוף תעתיק כדי להשוות את ההבדלים בגנים ובתפקודים של תאי חיסון אלה יכולים לספק נתונים משמעותיים לחקר הפתוגנזה של IM.
למיון FACS יש יתרון נוסף של היכולת לעבד תאים חיים ומופרדים לניסויים נוספים במבחנה או in vivo 14. שמירה על כדאיות התא חיונית לניסויים הבאים. ביצענו אופטימיזציה של שלב המיון כדי לשפר את כדאיות התאים בפרוטוקול זה - מניפולציות ניסיוניות בוצעו על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מהירות וזמן צנטריפוגה נכונים הם גם קריטיים לבידוד תאים. התפוקה של תאים ממוינים היא גם האילוץ העיקרי בשיטה זו, והשימוש בצינורות מצופים FBS במהלך המיון יכול להפחית במידה ניכרת את אובדן התאים הנצמדים לצינורות. מתן ההגדרות המתאימות עבור סדרן FACS יכול לשפר את היעילות הכוללת של המיון על ידי הימנעות מחסימת תאים או זיהום צולב בצינור האיסוף. באמצעות אופטימיזציה של שלבים והגדרות ניסיוניים, פרוטוקול זה יכול להיות אקסטרפולציה למיון של תאי חיסון אחרים על ידי החלפת תוויות מגנטיות או פלואורסצנטיות. עם זאת, בשל הספציפיות של דגימות הילדים (נפח איסוף דם נמוך), חקרנו רק את האוכלוסיות העיקריות של תאי מערכת החיסון (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B ותאי NK) מבלי להמשיך למיין תת-אוכלוסיות עקב הגבלת ערוץ מיון הזרימה. מחקר זה הראה כי דגימות דם היקפיות מילדים מדוכאי חיסון ודגימות מ-IM יכולות למיין בהצלחה את חמש קבוצות תאי החיסון הללו; עם זאת, דגימות הדם של חולים עם ממאירויות המטולוגיות (למשל, לוקמיה, לימפומה), הפרעות לימפופרוליפרטיביות (למשל, הפרעות לימפופרוליפרטיביות לאחר השתלה, CAEBV), או תסמונת כשל חיסוני ראשוני / תסמונת חסר חיסוני נרכש עשויות שלא להיות ממוינות בהצלחה על פי פרוטוקול זה.
IM נחשבת למחלה המגבילה את עצמה, ותאי מערכת החיסון כגון תאי γδ T, תאי NKT ותאי NK ממלאים תפקיד משמעותי בתגובה החיסונית האנטי-ויראלית15. תאי CD8+ T ספציפיים ל-EBV מתמיינים במידה רבה לכיוון פנוטיפ 10,16 של אפקטור, ויש התכווצות של זיכרון אפקטים מאוחרים ותאי אפקטים מ-IM להחלמה17. בינתיים, נראה כי תאי NK ב-IM פגומים מבחינה תפקודית, כולל היעדר הפעלת תאים10, אובדן איתות קולטן מפעיל ודה-גרנולציה18. מחקרים מסוימים מצאו כי תאי CD4+ T יכולים לא רק לסייע לתאי CD8+ T להרוג ולחסל תאי B נגועים ב- EBV, אלא גם לעכב את שגשוג תאי B על ידי הפרשת ציטוקינים ואף למלא תפקיד הרג ישיר במהלך זיהום EBV19,20. כפי שהוכח במחקר זה, שיעור מוגבר של תאי CD3+ CD8+ T נצפה בחולים עם IM בהשוואה הן לנשאי EBV בריאים והן לילדים שאינם נגועים ב- EBV. לעומת זאת, ירידה בשיעורים של תאי CD3+ CD4+ T, תאי CD19+ B ותאי CD16+/CD56+ NK נצפתה בחולים עם IM בהשוואה לילדים שאינם נגועים ב-EBV. עם זאת, התפקוד וביטוי הגנים של תת-סוגים שונים אלה של תאי מערכת החיסון באותו מצב מחלה של IM עדיין אינם ברורים. ניתוח נוסף של פרופילי ביטוי הגנים של תת-קבוצות ספציפיות של תאי חיסון ב-IM יכול לסייע בהשגת תובנה לגבי המנגנון הפתוגני של IM.
אנו מספקים אסטרטגיה המשלבת מיון חרוזים אימונומגנטיים ו-FACS כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון ב-PBMCs. מונוציטים מופרדים תחילה באמצעות מיקרובי CD14, ושאר ה-PBMCs מוכתמים בנוגדנים תואמים המסומנים בפלואורסצנטיות כדי למיין תאי CD4+ T, תאי CD8+ T, תאי B ותאי NK באמצעות FACS. בנוסף, השתמשנו בתאים הממוינים האלה להפקת RNA ולריצוף שעתוק כדי לאפיין את התפקוד והביטוי הגנטי של תאי חיסון שונים באימונופתולוגיה של IM. הטוהר והתפוקה של התאים הממוינים הספיקו בדרך כלל לביצוע מחקרי ביטוי גנים (נתונים שלא הוצגו). לכן, ניתן להשתמש בשיטת המיון של תת-אוכלוסיות נפרדות של תאי מערכת החיסון כדי להמשיך ולחקור הפרעות לימפופרוליפרטיביות הקשורות ל- EBV כגון CAEBV, הפרעה לימפופרוליפרטיבית לאחר השתלה כדי לזהות גנים פתוגניים, חלבונים פתוגניים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג'ינג למדעי הטבע (7222059) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L.
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
