Summary
Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.
Abstract
A mononucleose infecciosa (MI) é uma síndrome aguda associada principalmente à infecção primária pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os principais sintomas clínicos incluem febre irregular, linfadenopatia e linfócitos significativamente aumentados no sangue periférico. O mecanismo patogênico da MI ainda não está claro; não existe um método de tratamento eficaz para o efeito, estando disponíveis principalmente terapias sintomáticas. A principal questão na imunobiologia do EBV é por que apenas um pequeno subconjunto de indivíduos infectados apresenta sintomas clínicos graves e até desenvolve malignidades associadas ao EBV, enquanto a maioria dos indivíduos é assintomática por toda a vida com o vírus.
As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. As células natural killer (NK) são linfócitos inatos citotóxicos que são importantes para matar as células infectadas pelo EBV. A proporção de células T CD4+ diminui, enquanto a de células T CD8+ se expande dramaticamente durante a infecção aguda por EBV, e a persistência de células T CD8+ é importante para o controle vitalício da MI. Essas células imunes desempenham papéis importantes na MI, e suas funções precisam ser identificadas separadamente. Para este propósito, os monócitos são separados primeiro das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos IM usando microesferas CD14, uma coluna e um separador magnético.
Os PBMCs restantes são corados com peridinina-clorofila-proteína (PerCP)/Cianina 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/Cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e APC anti-CD16 para classificar células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK usando um citômetro de fluxo. Além disso, o sequenciamento do transcriptoma de cinco subpopulações foi realizado para explorar suas funções e mecanismos patogênicos na MI.
Introduction
O vírus Epstein-Barr (EBV), um γ-herpesvírus também conhecido como vírus do herpes humano tipo 4, é onipresente na população humana e estabelece infecção latente ao longo da vida em mais de 90% da população adulta1. A maioria das infecções primárias por EBV ocorre durante a infância e adolescência, com uma fração de pacientes manifestando mononucleose infecciosa (IM)2, mostrando imunopatologia característica, incluindo uma resposta imune ativada com células T CD8+ no sangue e uma proliferação transitória de células B infectadas por EBV na orofaringe3. O curso da MI pode durar de 2 a 6 semanas e a maioria dos pacientes se recupera bem4. No entanto, alguns indivíduos desenvolvem sintomas persistentes ou recorrentes semelhantes aos MI com alta morbidade e mortalidade, que é classificada como infecção crônica ativa por EBV (CAEBV)5. Além disso, o EBV é um importante vírus oncogênico, que está intimamente relacionado a uma variedade de malignidades, incluindo malignidades epitelióides e linfoides, como carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH) e linfoma de células T/NK6. Embora o EBV tenha sido estudado por mais de 50 anos, sua patogênese e o mecanismo pelo qual induz a proliferação de linfócitos não foram totalmente elucidados.
Diversos estudos têm investigado as assinaturas moleculares para a imunopatologia da infecção por EBV por sequenciamento de transcriptoma. Zhong et al. analisaram o perfil do transcriptoma completo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de crianças chinesas com MI ou CAEBV para descobrir que a expansão das células T CD8 + foi predominantemente encontrada no grupo IM7, sugerindo que as células T CD8 + podem desempenhar um papel importante na MI. Da mesma forma, outro estudo encontrou menores proporções de células T e CD19+ citotóxicas específicas para EBV e maiores porcentagens de células T CD8+ em pacientes com MI causada por infecção primária por EBV do que em pacientes com IM causada tanto pela reativação do EBV quanto por outros agentes8. As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. Al Tabaa et al. encontraram que as células B eram policlonalmente ativadas e diferenciadas em plasmoblastos (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmócitos (CD19+, CD27+ e CD20−, e CD138+) durante o IM9. Além disso, Zhong et al. descobriram que os marcadores de monócitos CD14 e CD64 foram regulados positivamente no CAEBV, sugerindo que os monócitos podem desempenhar um papel importante na resposta imune celular do CAEBV através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose hiperativa7. Alka et al. caracterizaram o transcriptoma de células NK CD56 dim CD16+ classificadas por MACS de quatro pacientes de IM ou HL e descobriram que as células NK de IM e HL tinham imunidade inata e genes de sinalização de quimiocinas desregulados, o que poderia ser responsável pela hiporresponsividade das células NK10. Além disso, Greenough et al. analisaram a expressão gênica de células T CD8+ classificadas de 10 PBMCs de indivíduos com MI. Relataram que uma grande proporção de células T CD8+ na MI eram específicas do vírus, ativadas, dividindo-se e preparadas para exercer atividades efetoras11. Tanto as respostas específicas do EBV mediadas por células T quanto as respostas inespecíficas mediadas por células NK desempenham papéis essenciais durante a infecção primária por EBV. No entanto, esses estudos investigaram apenas os resultados do transcriptoma da mistura diversificada de células imunes ou apenas uma certa subpopulação de linfócitos, o que não é suficiente para a comparação abrangente das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença.
Este artigo descreve um método que combina contas imunomagnéticas e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de PBMCs (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas usando um separador magnético e FACS ou analisadas por citometria de fluxo. O RNA pode ser extraído das células purificadas para sequenciamento do transcriptoma. Este método permitirá a caracterização e expressão gênica de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão da imunopatologia da infecção por EBV.
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Protocol
Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com MI (n = 3), portadores saudáveis de EBV (n = 3) e crianças não infectadas por EBV (n = 3). Os voluntários foram recrutados do Hospital Infantil de Pequim, da Universidade Médica da Capital, e todos os estudos foram aprovados eticamente. A aprovação ética foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: [2021]-E-056-Y). O consentimento informado dos pacientes foi dispensado, pois o estudo utilizou apenas as amostras restantes para testes clínicos. Todos os dados foram totalmente desidentificados e anonimizados para proteger a privacidade do paciente.
1. Isolamento de PBMCs do sangue periférico
- Coletar sangue periférico fresco (2 mL) de pacientes com MI em tubos de EDTA K3por punção venosa padrão.
NOTA: O processo precisa ser rápido para manter a viabilidade celular. - Diluir o sangue periférico em volume duplo com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e colocá-lo em camadas sobre o meio de separação de linfócitos humanos (densidade: 1,077 ± 0,001 g/mL) em um tubo de centrífuga de 15 mL.
NOTA: A razão de volume de sangue, PBS e meio de separação foi de 1:1:1. Adicione o sangue lentamente ao meio de separação e centrifugar imediatamente para evitar que o sangue se deposite no meio de separação. - Centrífuga a 800 × g durante 20 min à temperatura ambiente. Transfira a camada intermediária (PBMCs enriquecidos) para outro tubo de centrífuga de 15 mL.
NOTA: Após a centrifugação, na parte inferior do tubo estão os eritrócitos, a camada intermediária é o meio de separação, a camada superior é o plasma, e entre a camada plasmática e a camada líquida de separação estavam os PBMCs (incluindo linfócitos e monócitos). - Lavar os PBMCs com 10 mL de PBS e centrifugar a 800 × g por 20 min à temperatura ambiente; descarte o sobrenadante com cuidado.
- Repetir a lavagem e centrifugação (passo 1.4) 2 x. Ressuscite os PBMCs com 1 mL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e conte as células com um contador automatizado à base de azul de tripano.
2. Isolamento de monócitos CD14+ de PBMCs usando microesferas CD14
- Preparar uma solução tampão contendo 0,5% de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de EDTA em PBS (pH 7,2). Mantenha o tampão frio (2−8 °C).
NOTA: Desgaseifique o buffer antes de usar como bolhas de ar pode bloquear a coluna. Mantenha as células frias para evitar o tamponamento dos anticorpos na superfície celular e a marcação celular inespecífica. - Centrifugar os PBMCs a 300 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante com cuidado. Ressuspenda as células com 80 μL do tampão. Adicione 20 μL de microesferas CD14 à suspensão celular.
NOTA: Se houver ≤107 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >107 PBMCs, aumente proporcionalmente todos os volumes de reagentes e o volume total. - Misture bem as microesferas CD14 e as células no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incube por 15 min em geladeira a 4 °C. Lavar os PBMCs com 1 mL de tampão e centrífuga a 300 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte completamente o sobrenadante. Ressuspenda as células com 500 μL do tampão.
NOTA: Se houver ≤108 PBMCs, use o volume indicado acima. Se houver >108 PBMCs, aumente proporcionalmente o volume do buffer. - Separação magnética com colunas:
- Coloque a coluna no separador magnético do talão e lave a coluna com 3 mL de tampão. Adicione a suspensão da célula (da etapa 2.3) à coluna.
- Recolher as células não marcadas que passam através da coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml e lavar a coluna com 3 ml de tampão. Lave a coluna com 3 x 3 mL de tampão. Coletar o efluente total no tubo de centrífuga de 15 mL.
- Coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão à coluna. Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar imediatamente as células marcadas magneticamente para o tubo de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para uso no sequenciamento subsequente do transcriptoma.
3. Separação de populações de linfócitos de PBMCs por coloração de anticorpos marcados fluorescentemente e FACS
- Centrifugar as células não marcadas (passo 2.4.2) a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 100 μL de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 2 μL de cada anticorpo marcado (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) aos 100 μL de suspensão celular (os volumes e as informações conjugadas de fluoróforo dos anticorpos são mostrados na Tabela 1), incubar no gelo por 30 minutos e proteger da luz.
- Lavar as células 2 x adicionando 1 mL de PBS e centrifugando a 300 × g por 5 min à temperatura ambiente. Ressuspender as células em 500 μL de PBS no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Vórtice a suspensão celular suavemente antes de adquirir dados em um citômetro classificador de células de fluxo.
4. Ajuste dos parâmetros da citometria de fluxo
- Recolher 100 μL da suspensão celular (ver secção 1) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, conforme necessário, e configurar uma amostra de controlo negativo, uma amostra de coloração única de CD3, uma amostra de coloração única de CD4, uma amostra de coloração única de CD8, uma amostra de coloração única de CD19 e uma amostra de coloração de CD56/CD16.
- Adicionar 2 μL do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente por 100 μL da suspensão celular e do vórtice. Incube no gelo por 30 minutos no escuro. Centrifugar durante 5 min a 300 × g e aspirar o sobrenadante. Ressuscite os pellets com 500 μL de PBS e vórtice.
- Comissione o fluxo de classificação e atrase as gotículas usando as esferas fluorescentes da seguinte forma:
- Abra o sistema de classificação de células, execute o programa de inicialização, instale o bocal de 85 μm e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4.500 V e a frequência para 47.
- Ajuste os parâmetros principalmente ajustando o ponto de interrupção da gota de fluxo principal e o atraso da gota de acordo com as instruções do fabricante12. Configure a primeira posição do ponto de interrupção do droplet (Drop1) para 275 e a Gap para 8 na janela Breakoff . Ative o modo de classificação automática Sweet Spot para permitir que a citometria determine automaticamente o valor da amplitude das gotículas para estabilizar o fluxo.
- Ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela Side Stream carregando as esferas fluorescentes, garantindo que as contas atinjam uma deflexão de fluxo lateral de >99% no modo inicial ou de ajuste fino.
- Consulte a estratégia de gating mostrada na Figura 1 para executar o gating da seguinte maneira:
- Usando um gráfico de pontos de área de dispersão para frente (FSC-A)/área de dispersão lateral (SSC-A), desenhe a porta do polígono (P1) para identificar a população de linfócitos intacta .
- Usando um gráfico de pontos FSC-A/FSC-height (FSC-H), desenhe a porta do polígono (P2) para identificar as células simples e excluir os duplos (Figura 1A).
- Usando um gráfico de pontos CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, desenhe a porta retangular (P3) para selecionar células T CD3+ e células B CD19+ (Figura 1A,B).
- Usando um gráfico de pontos CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células T CD4+ e células T CD8+ (células com alta fluorescência para esses marcadores, respectivamente).
- Usando um gráfico de pontos CD56/CD16 APC-A/SSC-A, desenhe uma porta retangular para selecionar células NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).
- Ajuste os parâmetros instrumentais usando a amostra de controle negativo:
- Instale o tubo de controle negativo na porta de carregamento e clique em Carregar no Painel de Aquisição. Selecione as Configurações do citômetro no software.
- Na janela Inspetor, clique na guia Parâmetros e ajuste as tensões de FSC, SSC e diferentes corantes fluorescentes; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cianina 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cianina 5.5: 663.
- Ajustar a compensação usando as amostras de coloração única13.
- Carregue os tubos de coloração única na citometria sequencialmente e selecione Configurações do citômetro no software. Clique na guia Compensação para ajustar a compensação.
NOTA: A referência de compensação da citometria de fluxo é mostrada na Tabela 2.
- Carregue os tubos de coloração única na citometria sequencialmente e selecione Configurações do citômetro no software. Clique na guia Compensação para ajustar a compensação.
5. Classificação e coleta de dados de células via citometria de fluxo
- Vórtice da suspensão celular (PBMCs separados de acordo com as seções 1–3) brevemente para ressuspender as células antes de carregar o tubo no citômetro. Mantenha os tubos restantes no gelo.
- Adicione 200 μL de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta para evitar a aderência das células classificadas à parede do tubo e coloque-as na câmara de coleta do citômetro.
- Coletar células T CD3+CD4+, células T CD3+CD8+, células B CD3−CD19+ e células NK CD3− CD56+/CD16+ separadamente da amostra de um paciente com MI nos quatro tubos de fluxo (Figura 2A).
- Centrifugar as células separadas a 300 × g durante 5 min e remover o sobrenadante. Adicione 200 μL de reagente de isolamento de RNA às células para sequenciamento do transcriptoma.
- Separe as subpopulações de células imunes das amostras de portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV de acordo com as etapas acima (Figura 2B, C).
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Representative Results
Referência da estratégia de confinamento
A estratégia de gating utilizada para classificar as quatro subpopulações de linfócitos é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os linfócitos são selecionados (P1) em um gráfico de pontos mostrando a granulosidade (SSC-A) versus o tamanho (FSC-A). Em seguida, as células simples são selecionadas (P2) em um gráfico de pontos mostrando o tamanho (FSC-A) versus dispersão para frente (FSC-H), enquanto as células duplas são excluídas. As células T CD3+ (P3) e as células B CD19+ (Figura 1B) são selecionadas separadamente em um gráfico de pontos mostrando o CD3 PerCP-Cy5.5-A versus CD19 FITC-A. As células T CD8+ e as células T CD4+ são selecionadas separadamente em um gráfico de pontos mostrando CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A de P3. As células NK CD16+/CD56+ são selecionadas em um gráfico de pontos mostrando o APC-A CD56/CD16 versus SSC-A de P4 (Figura 1C).
Os resultados representativos de quatro subpopulações celulares classificadas das amostras de pacientes com MI pelo método descrito são mostrados na Figura 2A. Também realizamos a triagem celular em amostras de portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas com EBV como grupos controle para confirmar a viabilidade deste experimento. Os resultados representativos das subpopulações celulares separadas da amostra de um portador de EBV saudável são mostrados na Figura 2B. O resultado representativo das subpopulações celulares classificadas da amostra de crianças não infectadas por EBV é mostrado na Figura 2C. Como mostra a Figura 2, P1 foi fechado para identificar linfócitos e as células duplas foram excluídas por meio de P2; P3 foi fechado para selecionar células T CD3+ e P5 foi fechado para selecionar células B CD19+; As células T CD3+ CD8+ (P6) e CD3+ CD4+ T (P7) foram selecionadas separadamente de P3; As células NK CD16+/CD56+ (P8) foram selecionadas a partir de P4. Cada uma dessas subpopulações pode ser classificada individualmente e coletada para experimentos a jusante. Este sistema foi utilizado para analisar a expressão gênica através da extração de RNA e sequenciamento de transcriptoma.
Conforme relatado na Tabela 3, observou-se um aumento nas células T CD3+ CD8+ em pacientes com MI em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 e 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % de células T CD3+ CD8+ por linfócitos totais); Proporções diminuídas de células T CD3+ CD4+ e células B CD19+ foram observadas em pacientes com MI em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 e 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % de células T CD3+ CD4+ por linfócitos totais; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 e 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % de células B CD19+ por linfócitos totais). Proporções diminuídas de células NK CD16+/CD56+ foram observadas em pacientes com MI em comparação com crianças não infectadas por EBV (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % de células NK CD16+/CD56+ por linfócitos totais). Esses resultados validaram a efetividade desse protocolo de triagem e demonstraram que as proporções de subconjuntos de linfócitos são diferentes em pacientes com crianças não infectadas por MI e EBV.
Figura 1: Estratégia geral de bloqueio usada para classificar subpopulações de células imunes de PBMCs. (A) O filtro PerCP-Cy5.5 foi usado para separar células T CD3 +. As células T CD8+ e as células T CD4+ foram selecionadas separadamente em um gráfico de pontos mostrando CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A de P3. (B) O filtro FITC foi utilizado para identificar as células B CD19+. (C) O filtro APC foi utilizado para separar as células NK CD16+/CD56+ de P4. Abreviaturas: PBMCs= células mononucleares do sangue periférico; FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-H = altura de dispersão para a frente; PerCP = proteína peridinina-cronofila; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos de quatro subpopulações celulares isoladas com sucesso pelo método descrito. (A) Figuras representativas de classificação celular da amostra de sangue periférico do paciente com MI. (B) Valores representativos de triagem celular da amostra de sangue periférico de portador de EBV saudável. (C) Valores representativos de triagem celular da amostra de sangue periférico de crianças não infectadas por EBV. P1, porta dot plot para identificar linfócitos; P2, porta de gráfico de pontos para selecionar células únicas; P3, porta de gráfico de pontos para selecionar células T CD3+; P4, porta dot plot para identificar linfócitos CD3- CD19-; P5, porta de plotagem de pontos para selecionar células B CD19+; P6, porta de plotagem de pontos para selecionar células T CD3+ CD8+ de P3; P7, porta de plotagem de pontos para selecionar células T CD3+ CD4+ de P3; P8, porta de plotagem de pontos para selecionar células NK CD16+/CD56+ de P4. Abreviaturas: EBV = vírus Epstein-Barr; IM = mononucleose infecciosa; FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-A = área de dispersão lateral; FSC-H = altura de dispersão para a frente; PerCP = proteína peridinina-cronofila; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo de anticorpos | Fluoróforo conjugado | Dosagem | Clone | Isotipo |
| CD3 | PerCP/Cianine5,5 | 2 μL | SK7 | Mouse IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cianina7 | 2 μL | SK3 | Mouse IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 | Mouse IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Mouse IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5,1H11 | Mouse IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Mouse IgG1, κ |
Tabela 1: Anticorpos utilizados para citometria de fluxo. Abreviaturas: PerCP = peridinina-cronofila-proteína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Referência de compensação da citometria de fluxo (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5,5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5,5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabela 2: Referência de compensação da citometria de fluxo. Abreviaturas: PerCP = peridinina-cronofila-proteína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina; FITC = isotiocianato de fluoresceína.
| Proporção de linfócitos de diferentes subpopulações no total de linfócitos classificados (%) | |||
| subpopulação de linfócitos | IM | portadores saudáveis de EBV | Crianças não infectadas por EBV |
| Células T CD3+ | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| Células T CD3+ CD8+ | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| Células T CD3+ CD4+ | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| Células NK CD16+/CD56+ | 7,5 ± 0,5 | 2,2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ células B | 1,4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabela 3: Proporção de linfócitos classificados de diferentes grupos. Abreviaturas: EBV = vírus Epstein-Barr; IM = mononucleose infecciosa; NK = assassino natural.
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Discussion
Este protocolo representa uma maneira eficiente de classificar as subpopulações de células imunes do sangue periférico. Neste estudo, amostras de sangue venoso de pacientes com MI, portadores de EBV saudáveis e crianças não infectadas por EBV foram selecionadas como objetivo da pesquisa. Este trabalho utilizando o sangue periférico de pacientes com MI concentra-se principalmente em analisar e determinar as proporções de diferentes subconjuntos celulares através da citometria de fluxo multicolorida. O sequenciamento do transcriptoma é usado principalmente para a detecção e análise de uma determinada subpopulação de linfócitos que foi insuficiente para as comparações abrangentes e específicas das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença. Portanto, separar vários tipos de células do sangue periférico e realizar o sequenciamento do transcriptoma para comparar as diferenças nos genes de expressão e funções dessas células imunes poderia fornecer dados significativos para o estudo da patogênese da MI.
A classificação FACS tem o benefício adicional de ser capaz de processar células vivas e fracionadas para novos experimentos in vitro ou in vivo 14. Manter a viabilidade celular é vital para experimentos subsequentes. Otimizamos a etapa de classificação para melhorar a viabilidade celular neste protocolo - manipulações experimentais foram realizadas no gelo ou em um refrigerador de 4 °C. A velocidade e o tempo adequados de centrifugação também são críticos para o isolamento celular. O rendimento de células classificadas também é a principal restrição neste método, e o uso de tubos revestidos com FBS durante a classificação pode reduzir muito a perda de células que aderem aos tubos. Fornecer as configurações adequadas para o classificador FACS pode melhorar a eficiência geral da classificação, evitando o bloqueio celular ou a contaminação cruzada no tubo de coleta. Através da otimização de etapas e configurações experimentais, este protocolo pode ser extrapolado para a classificação de outras células imunes, substituindo rótulos magnéticos ou fluorescentes. No entanto, devido à especificidade das amostras das crianças (baixo volume de coleta de sangue), investigamos apenas as principais populações de células imunes (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK) sem proceder à classificação de subpopulações devido à restrição do canal de classificação de fluxo. Este estudo demonstrou que amostras de sangue periférico de crianças imunocompetentes e amostras de MI poderiam classificar com sucesso esses cinco grupos de células imunes; no entanto, as amostras de sangue de pacientes com neoplasias hematológicas (por exemplo, leucemia, linfoma), distúrbios linfoproliferativos (por exemplo, distúrbios linfoproliferativos pós-transplante, CAEBV) ou imunodeficiência primária/síndrome da imunodeficiência adquirida podem não ser classificadas com sucesso de acordo com esse protocolo.
A MI é considerada uma doença autolimitada, e células imunes como as células T γδ, as células NKT e as células NK desempenham um papel significativo na resposta imune antiviral15. As células T CD8+ específicas do EBV são amplamente diferenciadas em direção a um fenótipo efetor10,16, e há contração da memória efetora tardia e das células efetoras da MI à convalescença 17. Enquanto isso, as células NK no IM parecem ser funcionalmente defeituosas, incluindo falta de ativação celular10, perda de sinalização do receptor ativador e degranulação18. Alguns estudos descobriram que as células T CD4+ podem não apenas ajudar as células T CD8+ a matar e eliminar as células B infectadas pelo EBV, mas também inibir a proliferação de células B secretando citocinas e até mesmo desempenhar diretamente um papel de morte durante a infecção por EBV19,20. Como mostrado neste estudo, uma proporção aumentada de células T CD3 + CD8 + foi observada em pacientes com MI em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV. Em contraste, proporções diminuídas de células T CD3+ CD4+, células B CD19+ e células NK CD16+/CD56+ foram observadas em pacientes com MI em comparação com crianças não infectadas por EBV. No entanto, a função e a expressão gênica desses diferentes subtipos de células imunes no mesmo estado de doença da MI permanecem obscuras. Uma análise mais aprofundada dos perfis de expressão gênica de subconjuntos específicos de células imunes na MI pode ajudar a obter informações sobre o mecanismo patogênico da MI.
Fornecemos uma estratégia que combina a classificação de esferas imunomagnéticas e o FACS para isolar e analisar subpopulações definidas de células imunes em PBMCs. Os monócitos são separados primeiro usando microesferas CD14, e os PBMCs restantes são corados com anticorpos correspondentes marcados fluorescentemente para classificar células T CD4 +, células T CD8 +, células B e células NK através do FACS. Usamos ainda essas células classificadas para extração de RNA e sequenciamento de transcriptoma para caracterizar a função e a expressão gênica de diferentes células imunes na imunopatologia da MI. A pureza e o rendimento das células classificadas foram geralmente suficientes para a realização de estudos de expressão gênica (dados não mostrados). Portanto, o método de classificação de subpopulações separadas de células imunes pode ser usado para explorar ainda mais os distúrbios linfoproliferativos associados ao EBV, como o CAEBV, o distúrbio linfoproliferativo pós-transplante para detectar genes patogênicos, proteínas patogênicas e potenciais alvos terapêuticos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7222059) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
