Summary
يحدد البروتوكول الحالي طريقة تستخدم لوسيفر الأصفر في نموذج معوي قمي لتحديد نفاذية الأمعاء. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نفاذية الخلايا في المعوية التي تمثل أمراض الأمعاء الالتهابية مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر.
Abstract
Enteroids هي أداة بحثية ناشئة في دراسة أمراض الأمعاء الالتهابية مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC). تزرع تقليديا في التشكل القاعدي (BO) ، حيث يواجه السطح القمي للخلية الظهارية التجويف الداخلي. في هذا النموذج ، يعد الوصول إلى السطح اللمعي للمعوية للعلاج والتجريب أمرا صعبا ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. للتحايل على هذا ، تم إنشاء نموذج قمي حديثي الولادة (AO) لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر. نظرا لأن تغيرات نفاذية الخلايا الظهارية المعوية هي مرضية ل NEC ، فإن هذا البروتوكول يحدد استخدام الأصفر لوسيفر (LY) كعلامة على نفاذية الخلايا شبه الخلوية. يجتاز LY الحاجز الظهاري المعوي عبر جميع المسارات الرئيسية الثلاثة للخلايا: المسام والتسرب وغير المقيد. يسمح استخدام LY في نموذج AO بإجراء دراسة أوسع للنفاذية في NEC. بعد موافقة IRB وموافقة الوالدين ، تم جمع عينات جراحية من الأنسجة المعوية من حديثي الولادة الخدج من البشر. تم حصاد الخلايا الجذعية المعوية عن طريق عزل القبو واستخدامها لزراعة المعوية. نمت المعوية حتى النضج ثم حولت AO أو تركت في شكل BO. هذه إما لم تعالج (السيطرة) أو عولجت مع عديد السكاريد الشحمي (LPS) وتعرضت لظروف نقص الأكسجين لتحريض في المختبر NEC. تم استخدام LY لتقييم النفاذية. أكد تلطيخ الفلورسنت المناعي للبروتين القمي zonula occludens-1 والبروتين القاعدي β-catenin تشكيل AO. أظهر كل من المعويات AO و BO المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة زيادة ملحوظة في نفاذية الخلايا مقارنة بالضوابط. أظهر كل من المعويات AO و BO زيادة في امتصاص LY في تجويف المعويات المعالجة مقارنة بالضوابط. يسمح استخدام LY في نموذج AO المعوي بالتحقيق في جميع المسارات الرئيسية الثلاثة للنفاذية شبه الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح بالتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على النفاذية مقارنة بنموذج BO المعوي.
Introduction
Enteroids هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من الخلايا الجذعية المعوية البشرية المقيدة بالأعضاء 1,2. وهي تتكون بالكامل من سلالة ظهارية وتحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة2. تحافظ المعوية أيضا على قطبية خلوية تتكون من سطح لمعي قمي يشكل حجرة داخلية وسطحا قاعديا يواجه الوسائط المحيطة. Enteroids هي نموذج فريد من نوعه من حيث أنها تحافظ على خصائص المضيف الذي تم إنشاؤها منه3. وبالتالي ، فإن المعوية المتولدة من الأطفال الخدج تمثل نموذجا مفيدا للتحقيق في الأمراض التي تؤثر في المقام الأول على هذه الفئة من السكان ، مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC).
يزرع نموذج المعوي التقليدي في شكل قاعدي (BO) ، حيث يتم تغليف المعوي في قبة من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM). BMM يحث المعوي للحفاظ على هيكل 3D مع السطح القاعدي في الخارج. BO enteroids هي نموذج مناسب ل NEC الذي يسد الفجوة بين خطوط الخلايا البشرية الأولية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية في الجسم الحي 2,4. يتم تحريض NEC في المعوية عن طريق وضع مسببات الأمراض مثل LPS أو البكتيريا في الوسائط المحيطة ب enteroids ، تليها التعرض لظروف نقص الأكسجين 2,3. يتمثل التحدي في نموذج BO enteroid NEC في أنه لا يسمح بالدراسة الفعالة للتفاعلات بين المضيف والممرض ، والتي تحدث على السطح القمي في الجسم الحي. ترجع التغيرات في نفاذية الأمعاء إلى هذه التفاعلات بين المضيف والممرض. لفهم كيفية تأثير النفاذية على الأساس الفيزيولوجي المرضي للمرض بشكل أفضل ، يجب إنشاء نموذج يتضمن معالجة السطح القمي.
Co et al. كانوا أول من أثبت أن المعويات BO الناضجة يمكن تحريضها لتشكيل شكل قمي (AO) عن طريق إزالة قباب BMM وإعادة تعليقها في الوسائط5. أظهرت هذه المقالة أن المعوية AO حافظت على قطبية ظهارية صحيحة ، واحتوت على جميع أنواع الخلايا المعوية ، ودعمت الحاجز الظهاري المعوي ، وسمحت بالوصول إلى السطح القمي5. استخدام المعوية AO كنموذج NEC يحقق التكاثر الفسيولوجي لعملية المرض ودراسة التفاعلات بين المضيف والممرض.
أحد المساهمين الرئيسيين في الفيزيولوجيا المرضية ل NEC هو زيادة نفاذية الأمعاء6. تم اقتراح العديد من الجزيئات كطريقة لاختبار نفاذية الأمعاء في المختبر7. من بين هؤلاء ، لوسيفر الأصفر (LY) هو صبغة محبة للماء مع قمم الإثارة والانبعاث عند 428 نانومتر و 540 نانومتر ، على التوالي8. أثناء عبوره عبر جميع المسارات الرئيسية عبر الخلايا ، فقد تم استخدامه لتقييم نفاذية الخلايا في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك الحواجز الظهارية الدموية الدماغية والمعوية 8,9. يستخدم التطبيق التقليدي ل LY الخلايا المزروعة في طبقات أحادية على سطح شبه نافذ10. يتم تطبيق LY على السطح القمي ويعبر من خلال بروتينات الوصلة الضيقة شبه الخلوية للتجمع على الجانب القاعدي. تشير تركيزات LY الأعلى في المقصورة القاعدية إلى انخفاض بروتينات الوصلات الضيقة مع انهيار حاجز الخلايا الظهارية المعوية اللاحقة وزيادة النفاذية10. كما تم وصفه في نماذج 3D BO enteroid حيث تمت إضافة LY إلى الوسائط وتم تصوير المعويات الفردية لامتصاص LY في التجويف11. على الرغم من أن هذا يسمح بالتحليل النوعي من خلال تصور امتصاص LY ، إلا أن التحليل الكمي محدود. يحدد هذا البروتوكول تقنية فريدة تستخدم LY لتقييم نفاذية الخلايا باستخدام نموذج معوي NEC في المختبر في المعوية AO مع الحفاظ على اتجاه 3D. يمكن استخدام هذه الطريقة لكل من التحليل النوعي والكمي للنفاذية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء البحث الحالي وفقا لموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB ، # 11610 ، 11611) في جامعة أوكلاهوما. كانت موافقة الوالدين مطلوبة قبل جمع العينات الجراحية البشرية وفقا لمواصفات IRB. بعد موافقة IRB وموافقة الوالدين ، تم الحصول على الأنسجة المعوية الدقيقة البشرية من الرضع (عمر الحمل المصحح (GA) يتراوح من 36-41 أسبوعا في وقت جمع العينات ، وجميعهم لديهم تاريخ من الولادة المبكرة في GA يقدر ب 25-34 أسبوعا ، 2: 1 M: F) يخضعون لعملية جراحية ل NEC أو استئصال معوي آخر ، مثل إزالة الفغر أو إصلاح الرتق. تم إنشاء المعوية من الأنسجة التي تم الحصول عليها إما من الصائم أو الدقاق.
1. الثقافات المعوية البشرية المشتقة من الرضع: عزل القبو والطلاء من الأنسجة الكاملة
- قم بإعداد وسائط الاستزراع ، والمخزن المؤقت المخلب # 1 ، والمخزن المؤقت المخلب # 2 (الجدول 1) بعد التقرير السابق4. قم بتخزين مخازن مخلبية في درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون 48 ساعة.
- تحضير وسائط الأمعاء المصغرة البشرية (الجدول 1). يخزن المرق في درجة حرارة -20 درجة مئوية ويسخن في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- قم بإعداد 50٪ وسائط مكيفة L-WRN (CM) (الجدول 1). تخزين المخزون في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
ملاحظة: تم وصف قاعدة L-WRN بنسبة 100٪ للوسائط المكيفة في بروتوكول بواسطة Miyoshi et al.12. - توليد المعوية من عينات الأنسجة المعوية الدقيقة التي تم الحصول عليها من العينات الجراحية بعد التقرير السابق4. لوحة أربعة آبار من enteroids في لوحة 24 بئر من 0.75-2.5 غرام قطعة من الأنسجة المعوية.
ملاحظة: يمكن توليد المعوية بنجاح من الأنسجة المخزنة في 30 مل معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط في أنبوب مخروطي 50 مل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. - ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 رأسا على عقب لمدة 15-20 دقيقة للسماح بلمرة قباب BMM4.
- أضف 500 ميكرولتر من 50٪ L-WRN CM (كما هو موضح في الخطوة 1.3) مع 0.5 ميكرولتر من Y-27632 ، مثبط الصخور (RI ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر. بعد 2-3 أيام ، استبدل ب 50٪ L-WRN CM بدون RI.
2. جيل من المعوية AO
- تنمو المعوية جزءا لا يتجزأ من BMM لمدة 7-10 أيام مع 50 ٪ L-WRN CM4.
- قم بإزالة الوسائط وإضافة 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا (CRS ، انظر جدول المواد) إلى بئر واحد. اكشط القبة ، ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم أضف حل CRS / enteroid / BMM إلى البئر التالي.
- كشط القبة ، ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ووضع الحل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 500 ميكرولتر من CRS إلى البئر الثاني ، ماصة لأعلى ولأسفل ، ثم أضفها إلى البئر الأول. انقل هذا المحلول إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير سعة 1.5 مل.
- كرر الخطوة 2.3 ، قم بتجميع بئرين في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد حتى تصبح جميع محتويات البئر في CRS.
ملاحظة: يمكن تجميع أكثر من بئرين في أنبوب مخروطي واحد أكبر سعة 15 مل في حالة توليد كميات كبيرة من المعوية AO. يعد الحفاظ على نسبة CRS 500 ميكرولتر لكل بئر أمرا مهما لضمان الذوبان الكامل ل BMM. - ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الخطوة 2.3) مع محلول CRS / enteroid / BMM المجمع على دوار لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية لإذابة BMM.
- قم بالطرد المركزي للمحلول عند 200 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة ، تاركا الحبيبات خلفك.
- أعد تعليق الحبيبات المعوية في 1 مل من 50٪ L-WRN CM (كما هو موضح في الخطوة 1.3) لكل أنبوب طرد مركزي دقيق. ماصة برفق 500 ميكرولتر من محلول enteroid / الوسائط المعاد تعليقه في كل بئر من ألواح زراعة الأنسجة ذات 24 بئرا ذات التعلق المنخفض للغاية (انظر جدول المواد).
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 أيام قبل التجربة.
3. التحقق من تشكيل AO المعوي عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل
- بعد حضانة المعويين في تعليق الوسائط لمدة 3 أيام ، ماصة التعليق المعوي / الوسائط من بئر واحد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.
- جهاز طرد مركزي للتعليق المعوي / الوسائط عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طافت مع micropipette.
- إعادة تعليق enteroids في 20 ميكرولتر من BMM. ماصة 10 ميكرولتر من التعليق المعوي على شريحة المجهر ونشرها في طبقة رقيقة حوالي 1 سم في 1 سم مربع. كرر مع 10 ميكرولتر المتبقية من التعليق المعوي على جزء منفصل من نفس الشريحة بحيث يكون هناك مسحتان من التعليق المعوي / BMM.
- اترك مسحات الأمعاء / BMM تتصلب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
- العمل في غطاء الدخان ، ضع الشريحة في جرة تلطيخ واملأها ب 4٪ بارافورمالدهيد حتى تغطي مسحة المعوي / BMM (~ 30 مل لشريحة واحدة في حالة استخدام جرة تلطيخ زجاجية بسعة 10 شرائح). اترك 30 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) حتى يتم التثبيت.
تنبيه: 4٪ بارافورمالدهيد خطير وقد يتسبب في تلف / تهيج العين وتهيج الجلد والسرطان. اعمل دائما تحت غطاء الدخان عند استخدامه. ارتداء قفازات واقية ومعدات الحماية الشخصية عند التعامل معها. تخلص منها في حاوية معتمدة للتخلص من النفايات. - تخلص من 4٪ بارافورمالدهيد في حاوية نفايات مناسبة. أضف 30 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى جرة التلوين أو حتى يغطي PBS مسحات المعوي / BMM. اتركه لمدة 3 دقائق في RT ، ثم تخلص من PBS في زجاجة نفايات بارافورمالدهايد. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
- املأ جرة تلطيخ جديدة ب 30 مل من 0.5٪ Triton X-100 المخفف في PBS. ضع الشريحة مع مسحات معوية / BMM في محلول Triton واتركها تتخلل لمدة 20 دقيقة عند RT.
- تخلص من 0.5٪ Triton X-100 المخفف في PBS. أضف 30 مل من PBS إلى جرة التلوين واتركها لمدة 3 دقائق. تجاهل PBS عن طريق الصب.
- امسح الشريحة برفق حول اللطاخات المعوية / BMM ، مع الحرص على عدم تعطيلها. باستخدام قلم حاجز كاره للماء (قلم PAP الحاجز ، انظر جدول المواد) ، ارسم دائرة حول كل من مسحات المعوي / BMM. اصنع مصلا بنسبة 20٪ ، خاصا بالحيوان الذي نشأ فيه الجسم المضاد الثانوي (انظر جدول المواد).
- ضع شريحة المجهر بشكل مسطح على مقعد المختبر. اسد الشريحة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية عن طريق سحب 100 ميكرولتر من مصل 20٪ محدد من الخطوة 3.9 على كل من اللطاخات المعوية / BMM المحاطة بقلم الحاجز الكارهة للماء.
- تحضير محلول 100 ميكرولتر مع 1: 100 و 1: 200 التخفيفات من الأجسام المضادة الأولية β-catenin و ZO-1 ، على التوالي ، مخففة في PBS.
ملاحظة: يجب أن يكون كل جسم مضاد أولي من مختلف للتأكد من أنه سيكون له قنوات مناعية مميزة عند تصويره. تستخدم الدراسة الحالية جسما مضادا للفأر β-catenin وجسما مضادا للأرنب ZO-1 (انظر جدول المواد). - اضغط على الشريحة الموجودة على المنضدة لإزالة المصل بنسبة 20٪ وامسحه برفق حتى يجف ، مع الحرص على عدم تعطيل مسحات المعوي / BMM. ماصة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية β-catenin / ZO-1 على أحد مسحات المعوي / BMM. ماصة 100 ميكرولتر من PBS بدون جسم مضاد أولي على مسحة المعوية / BMM الأخرى كعنصر تحكم سلبي.
- قم بتبطين الجزء السفلي من الحاوية البلاستيكية بمنشفة ورقية مبللة لإنشاء حاوية مرطبة. ضع الشريحة في الحاوية ، مع الحرص على عدم تعطيل المحاليل التي تغطي مسحات المعوي / BMM. ضع الغطاء على الحاوية لإغلاقها ، وقم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
ملاحظة: لا تدع الشريحة تجف. تأكد من إغلاق الحاوية لتجنب الجفاف. - بمجرد الاستعداد للمتابعة ، انقر فوق الشريحة الموجودة على المنضدة لإزالة الأجسام المضادة الأولية و PBS من مسحات المعوي / BMM.
- قم بتنفيذ خطوة غسيل عن طريق وضع الشريحة في جرة تلطيخ وملء 30 مل من PBS أو حتى يغطي PBS مسحات المعوي / BMM. اتركه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من PBS وكرر هذه الخطوة مرتين أخريين لما مجموعه ثلاث غسلات.
- قم بإعداد 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لقناتين مختلفتين من الفلورسنت المناعي ، مع كل جسم مضاد له تخفيف 1: 1000 في PBS (انظر جدول المواد). احفظ المحلول بعيدا عن الضوء.
- ماصة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل من مسحات المعوي / BMM. ضعه في الظلام واتركه لمدة 1 ساعة في RT.
- اضغط على الشريحة الموجودة على المنضدة لإزالة الأجسام المضادة الثانوية. كرر خطوات الغسيل الموضحة في الخطوة 3.15 ، مع التأكد من إجراء جميع عمليات الغسيل في الظلام.
- أضف قطرة من 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (Fluoroshield مع DAPI ، انظر جدول المواد) وسيط تركيب لكل من مسحات المعوي / BMM وقم بتطبيق غطاء لضمان تغطية كلتا اللطاختين بشكل كاف. تجنب حبس الفقاعات تحت غطاء الغطاء. احتفظ بالشريحة في الظلام حتى تصبح جاهزة للعرض تحت المجهر.
ملاحظة: التصوير الفوري للشرائح يعطي أفضل النتائج. ومع ذلك ، يمكن تخزين الشرائح بشكل مسطح في حاوية مرطبة عند 4 درجات مئوية وتصويرها لمدة تصل إلى 1 أسبوع بعد إضافة DAPI.
4. تحريض NEC التجريبية
- تأكد من تعليق المعويات AO لمدة 72 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- ماصة برفق كل تعليق المعوي / الوسائط من كل بئر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ملاحظة: يمكن تجميع آبار متعددة في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل إذا تمت معالجة حجم كبير من الآبار. يوصى بما لا يقل عن ثلاثة آبار لكل مجموعة معالجة لهذا البروتوكول. - جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند RT وإزالة المادة الطافية.
- أضف 10 ميكرولتر من 5 ملغم / مل من عديد السكاريد الدهني (LPS ، انظر جدول المواد) إلى 500 ميكرولتر من 50٪ LWRN CM لكل بئر (التركيز النهائي 100 ميكروغرام / مل LPS).
- أعد تعليق المعويات AO المعينة كمجموعة علاج في 50٪ LWRN + LPS و 500 ميكرولتر من التعليق إلى لوحة ربط منخفضة للغاية من 24 بئرا. أعد تعليق المعويات AO المعينة كعناصر تحكم غير معالجة في 500 ميكرولتر من 50٪ LWRN CM لكل بئر. حصة 500 ميكرولتر من هذا التعليق إلى لوحة تثبيت منفصلة منخفضة للغاية من 24 بئرا.
- تحفيز نقص الأكسجة في المعوية AO المعالجة ب LPS عبر غرفة حاضنة معيارية (MIC) مع 1٪ O 2 و 5٪ CO 2 و 94٪ N 2 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). علاج enteroids مع نقص الأكسجة و LPS لمدة 24 ساعة.
- ضع الثقافات غير المعالجة و LPS + المعالجة بنقص الأكسجة ، لا تزال في غرفة MIC ، في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
5. قياس نفاذية الخلايا باستخدام LY
- ماصة برفق التعليق المعوي / الوسائط من كل بئر في أنبوب طرد مركزي دقيق. DPBS دافئ و 50٪ LRWN CM في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- جهاز طرد مركزي للتعليق المعوي / الوسائط عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند RT.
- قم بإزالة الوسائط. اغسل المعويات ب 500 ميكرولتر DPBS دافئ.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة.
- كرر الخطوات 5.3-5.4 مرة أخرى ليصبح المجموع مرتين.
- بعد الغسيل ، أضف 450 ميكرولتر من 50٪ LWRN CM الدافئ (كما هو موضح في الخطوة 1.3).
- أضف 50 ميكرولتر من 2.5 مجم / مل LY (التركيز النهائي هو 0.25 ميكروغرام / ميكرولتر ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر وحرك برفق للخلط. ضع في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة.
- ماصة برفق التعليق المعوي / الوسائط من كل بئر في أنبوب طرد مركزي دقيق.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، ثم قم بإزالة المادة الطافية ، تاركا الحبيبات المعوية وراءها.
- اغسل المعويين ب 500 ميكرولتر DPBS دافئ.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، ثم قم بإزالة المادة الطافية تاركة الحبيبات المعوية خلفها.
- كرر الخطوات 5.10-5.11 ثلاث مرات أخرى ليصبح المجموع أربع غسلات.
- أعد تعليق كل حبيبات ب 1000 ميكرولتر من DPBS البارد وماصة بقوة لأعلى ولأسفل لفصل المعويات.
- إعداد معايير لمنحنى LY القياسي المخفف في DPBS (100 نانوغرام/مل؛ 50 نانوغرام/مل؛ 25 نانوغرام/مل؛ 12.5 نانوغرام/مل؛ 6.25 نانوغرام/مل؛ 3.13 نانوغرام/مل؛ 1.57 نانوغرام/مل؛ 0 نانوغرام/مل).
- ماصة 150 ميكرولتر من كل عينة لكل بئر في ثلاث نسخ على لوحة 96 بئر.
- قم بقياس التألق عند ذروة إثارة تبلغ 428 نانومتر وذروة انبعاث تبلغ 536 نانومتر على قارئ لوحة قادر على قراءة التألق (انظر جدول المواد). باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد) ، احسب التركيزات عن طريق استيفاء المنحنى القياسي واستخدام منحنى رباعي المعلمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشكيل AO
تفترض المعوية المعلقة في وسائط LWRN بنسبة 50٪ لمدة 72 ساعة وجود شكل AO (الشكل 1). تم تأكيد ذلك عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام حوامل كاملة معوية من البروتين القمي ، zonula occludens-1 (ZO-1) ، والبروتين القاعدي ، β-catenin (الشكل 1). تظهر AO enteroids ZO-1 (أخضر) على السطح الخارجي القمي للمعوي ، بينما β-catenin (أحمر) على السطح القاعدي الداخلي (الشكل 1A). توضح المعوية BO المعكوس مع β-catenin (أحمر) على السطح الخارجي و ZO-1 (أخضر) على السطح الداخلي اللمعي (الشكل 1B). تظهر هذه النتائج انعكاس القطبية المتوقع لتأكيد أن المعويات هي AO قبل التجريب.
نتائج فحص LY
من المتوقع زيادة النفاذية ، كما يتضح من زيادة امتصاص صبغة LY في التجويف المعوي ، في NEC6. أظهرت المعوية BO المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة زيادة ملحوظة في النفاذية مقارنة بالضوابط غير المعالجة باستخدام التقنية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل 2A ، ** p = 0.005). هذا يتفق مع الأدبيات التي وصفت زيادة النفاذية في نماذج BO المعوية من NEC 4,13. وبالمثل ، أظهرت المعوية AO المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة أيضا زيادة كبيرة في النفاذية مقارنة بالضوابط غير المعالجة ، كما هو متوقع في نموذج NEC (الشكل 3A ، * p = 0.02). أظهرت المعوية AO المعالجة زيادة في امتصاص LY في تجويف المعويات المعالجة (الشكل 3C) مقارنة بالضوابط غير المعالجة (الشكل 3B). هذا مشابه لما يظهر في BO enteroids ، حيث يتم تصور LY في تجويف الأمعاء (الشكل 2B). تؤدي زيادة امتصاص صبغة LY في تجويف المعوي إلى زيادة التألق في المعويات المعالجة ، مما يسمح بالتحليل الكمي عبر قارئ الصفائح الدقيقة باستخدام المعويات AO من آبار مختلفة (الشكل 3 أ). هذا يدل على أن هذه التقنية ، باستخدام LY ، يمكن استخدامها لتقييم النفاذية في المعوية 3D. يمكن تحليل النتائج باستخدام برنامج إحصائي قادر على استيفاء منحنى قياسي لتحديد تركيزات LY لمجموعات العلاج. يمكن استخدام اختبار t للطالب ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 ، لتحديد الأهمية بين المجموعات.
الشكل 1: التحقق من تشكيل AO. (أ) معوي قمي (AO) يظهر قطبية عكسية مقارنة ب (B) معوي قاعدي (BO) يظهر قطبية تقليدية عند تكبير 20x ، شريط مقياس مضبوط على 100 ميكرومتر. DAPI ، أزرق ؛ بيتا كاتينين (بروتين قاعدي) ، أحمر ؛ Zonula occludens-1 (بروتين قمي) ، أخضر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: زيادة النفاذية في نموذج BO المعوي بعد تحريض NEC في المختبر كما تم قياسه بواسطة اختبار LY. (أ) زادت LPS و enteroids القاعدية المعالجة بنقص الأكسجة بشكل كبير من النفاذية مقارنة بالضوابط غير المعالجة باستخدام مقايسة لوسيفر الصفراء ؛ تظهر أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط ؛ ** ع = 0.005. (ب) صورة لمعوية قاعدية مع لوسيفر أصفر مرئي في التجويف بعد معالجة الوسائط بصبغة لوسيفر الصفراء عند تكبير 10x ، شريط مقياس 300 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: زيادة النفاذية في نموذج AO المعوي بعد تحريض NEC في المختبر كما تم قياسه بواسطة اختبار LY. (أ) زادت LPS و enteroids القمي المعالجة بنقص الأكسجة بشكل كبير من النفاذية مقارنة بالضوابط غير المعالجة باستخدام مقايسة لوسيفر الصفراء ؛ تظهر أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط ؛ *ع = 0.02. (ب) صورة تمثيلية للعنصر المعوي القمي غير المعالج (AO) عند 10x ؛ يتم ضبط شريط المقياس على 100 ميكرومتر. (C) يتم تصور صورة تمثيلية ل LPS و AO enteroid المعالج بنقص الأكسجة مع LY في التجويف عند 10x ؛ تم ضبط شريط المقياس على 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: تركيب الحلول والمخازن المؤقتة والوسائط المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نفاذية الأمعاء معقدة وتعكس وظيفة الحاجز الظهاري. يتكون الحاجز المعوي من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تتوسط النقل عبر الخلايا وشبه الخلوية14. تعتمد نفاذية الخلايا على بروتينات الوصلات الضيقة التي تغلق المسافة بين الخلايا الظهارية14. داخل هذا النقل عبر الخلوي ، هناك ثلاثة مسارات متميزة يمكن للجزيئات من خلالها العبور: المسام ، والتسرب ، وغيرالمقيد 15. يسمح مسار المسام بنفاذية الأيونات الصغيرة المشحونة ، بينما يسمح مسار التسرب بجزيئات أكبر غير مشحونة عبر15. يعكس المسار الثالث غير المقيد النفاذية الثانوية للتلف الظهاري أو الموت16. على الرغم من استخدام العديد من الجزيئات لتقييم نفاذية الخلايا ، إلا أن نوع الجزيء وحجمه يؤثران على مسار النفاذية الذي سيتم فحصه.
كجزيء صغير محب للماء ، يمكن ل LY عبور جميع المسارات الثلاثة شبه الخلوية ، مما يجعله أداة مثالية لدراسة نفاذية الخلايا شبه الخلوية. في المقابل ، يمكن ل 4 كيلو دالتون FITC-dextran ، وهو جزيء سكر يستخدم كعلامة على نفاذية الخلايا ، اجتياز التسرب والمسارات غير المقيدة فقط. يقتصر أكبر ، 70 كيلو دالتون FITC-dextran على المسار غير المقيد فقط. هناك طريقة أخرى لتحديد نفاذية الخلايا عن طريق قياسات المقاومة عبر الظهارة (TEER) ، والتي تقيس المقاومة الكهربائية عبر الطبقات الأحادية. تقيس هذه الطريقة فقط مسار المسام17. وبالتالي ، يوفر LY نظرة ثاقبة أكبر للنفاذية الكلية للخلايا من خلال استهداف جميع المسارات الثلاثة. يستفيد هذا البروتوكول من هذا باستخدام LY لدراسة نفاذية الخلايا الباراخلوية.
تم اختيار نموذج الأمعاء في هذا البروتوكول لأنه يحاكي عن كثب الظروف في الجسم الحي عن طريق إنشاء أمعاء مصغرة 3D للدراسة. ومع ذلك ، فإن التحدي مع نموذج BO المعوي التقليدي هو كيفية الوصول إلى السطح القمي لدراسة تفاعلات المضيف والممرض والتغيرات اللاحقة في النفاذية. يتغلب نموذج AO enteroid على هذا التحدي عن طريق عكس القطبية حيث يكون السطح القمي على اتصال بالوسائط المحيطة. تم وصف عدة طرق بديلة للوصول إلى السطح القمي للمعوية. وتشمل هذه أنظمة رقائق الأمعاء ، والحقن المجهري ، والتجزئة ، ونمو المعوية في الطبقات الأحادية18,19. سمح التقدم في أنظمة رقائق الأمعاء بزراعة الخلايا العضوية والخلايا البطانية معا في سياق الأوعية الدموية والتمعج لتقليد البيئة المعوية18. يتضمن الحقن المجهري الحقن في تجويف BO المعوي عن طريق استخدام معدات متخصصة مثل مناور دقيق وحاقن دقيق19. يستخدم التجزئة تفكك المعوية إلى خلايا مفردة يتم تحضينها بعد ذلك في الوسائط مع العامل الممرض قبل إصلاح بنية 3D19. كما تم وصف تحول المعوية إلى طبقات أحادية 2D مع المعالجة اللاحقة للسطح القمي19. يعالج نموذج AO enteroid بعض الصعوبات التي تواجهها هذه النماذج من خلال توفير طريقة بسيطة وفعالة لكشف السطح القمي دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن أو المساس بالسلامة الهيكلية للمعوي.
على الرغم من أن استخدام LY في نموذج AO يسمح بإجراء دراسة واسعة للنفاذية شبه الخلوية الثانوية للتفاعلات بين المضيف والممرض ، إلا أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع المعوية BO وكذلك FITC-dextran بدلا من LY. يلزم إجراء تغييرين رئيسيين على هذا البروتوكول لتعديله لاستخدامه في BO enteroids. أولا ، يمكن الحفاظ على المعوية BO في قباب BMM لجميع خطوات الغسيل قبل وبعد إضافة LY. من المهم استخدام المحاليل التي تم تسخينها إلى 37 درجة مئوية لخطوات الغسيل هذه لمنع ذوبان قبة BMM. ثانيا ، يجب تعطيل قبة BMM باستخدام DPBS البارد وكشط البئر بطرف ماصة بعد اكتمال جميع خطوات الغسيل من أجل السماح بإعادة التعليق الكامل للمعويات المنفصلة و LY. إذا تم استبدال FITC-dextran ب LY ، فمن المستحسن استخدام جزيء 4 كيلو دالتون أثناء عبوره عبر اثنين من المسارات الثلاثة شبه الخلوية.
تشمل الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول ضمان غسلات كافية لإزالة أي أثر LY من المحلول خارج المعوي. من المهم أيضا غسل المعوية برفق لتجنب التفكك والإطلاق المحتمل ل LY من التجويف إلى المحلول المحيط حتى تصبح جاهزة للقياس الكمي باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. استخدام المحاليل الدافئة أثناء خطوات الغسيل يقلل أيضا من الضغط على المعوية. إذا تم استخدام المحاليل الباردة ، فقد تخضع الأمعاء لموت الخلايا المبرمج ، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقة.
تشمل قيود هذه الطريقة عدم القدرة على نشر المعوية AO وأوقات زراعة أطول بسبب 72 ساعة إضافية مطلوبة لعكس القطبية. هناك أيضا انخفاض بنسبة 2٪ -5٪ في عدد AO enteroid المعالج مقارنة بالضوابط. على الرغم من أن هذا لا يكاد يذكر بشكل عام ، إلا أنه قد يؤدي إلى التقليل من شأن النتائج. تتشابه قيود استخدام LY مع جزيئات النفاذية الأخرى ، مثل 4 كيلو دالتون FITC-dextran ، حيث يمكن أن تعبر الكميات النزرة الحاجز الظهاري المعوي عبر النقل الخلوي20. على الرغم من أن هذا المبلغ لا يكاد يذكر ، إلا أنه قد يؤثر على النتائج. بناء على هذه النتائج ، يوفر تطبيق LY على وسائط AO enteroids طريقة أنيقة وبسيطة نسبيا لتحليل نفاذية الأمعاء شبه الخلوية كميا ونوعيا في نموذج 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ المؤلفون عن أي مصلحة ملكية أو تجارية في أي منتج مذكور أو مفهوم تمت مناقشته في هذه المقالة.
Acknowledgments
نود أن نشكر آشلي نيلسون من المركز الطبي بجامعة روتشستر على مساعدتها الفعالة في نموذجنا المعوي. نود أيضا أن نشكر قسم جراحة الأطفال في جامعة أوكلاهوما على دعمهم لهذا المشروع. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة [NIH Grant R03 DK117216-01A1] ، ومركز أوكلاهوما لأبحاث الخلايا الجذعية للبالغين ، ومنحة مؤسسة الصحة المشيخية # 20180587 الممنوحة لقسم الجراحة في مركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
