تحديد نفاذية الأمعاء باستخدام أصفر لوسيفر في نموذج معوي قمي
Summary
يحدد البروتوكول الحالي طريقة تستخدم لوسيفر الأصفر في نموذج معوي قمي لتحديد نفاذية الأمعاء. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نفاذية الخلايا في المعوية التي تمثل أمراض الأمعاء الالتهابية مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر.
Abstract
Enteroids هي أداة بحثية ناشئة في دراسة أمراض الأمعاء الالتهابية مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC). تزرع تقليديا في التشكل القاعدي (BO) ، حيث يواجه السطح القمي للخلية الظهارية التجويف الداخلي. في هذا النموذج ، يعد الوصول إلى السطح اللمعي للمعوية للعلاج والتجريب أمرا صعبا ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض. للتحايل على هذا ، تم إنشاء نموذج قمي حديثي الولادة (AO) لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر. نظرا لأن تغيرات نفاذية الخلايا الظهارية المعوية هي مرضية ل NEC ، فإن هذا البروتوكول يحدد استخدام الأصفر لوسيفر (LY) كعلامة على نفاذية الخلايا شبه الخلوية. يجتاز LY الحاجز الظهاري المعوي عبر جميع المسارات الرئيسية الثلاثة للخلايا: المسام والتسرب وغير المقيد. يسمح استخدام LY في نموذج AO بإجراء دراسة أوسع للنفاذية في NEC. بعد موافقة IRB وموافقة الوالدين ، تم جمع عينات جراحية من الأنسجة المعوية من حديثي الولادة الخدج من البشر. تم حصاد الخلايا الجذعية المعوية عن طريق عزل القبو واستخدامها لزراعة المعوية. نمت المعوية حتى النضج ثم حولت AO أو تركت في شكل BO. هذه إما لم تعالج (السيطرة) أو عولجت مع عديد السكاريد الشحمي (LPS) وتعرضت لظروف نقص الأكسجين لتحريض في المختبر NEC. تم استخدام LY لتقييم النفاذية. أكد تلطيخ الفلورسنت المناعي للبروتين القمي zonula occludens-1 والبروتين القاعدي β-catenin تشكيل AO. أظهر كل من المعويات AO و BO المعالجة ب LPS ونقص الأكسجة زيادة ملحوظة في نفاذية الخلايا مقارنة بالضوابط. أظهر كل من المعويات AO و BO زيادة في امتصاص LY في تجويف المعويات المعالجة مقارنة بالضوابط. يسمح استخدام LY في نموذج AO المعوي بالتحقيق في جميع المسارات الرئيسية الثلاثة للنفاذية شبه الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح بالتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على النفاذية مقارنة بنموذج BO المعوي.
Introduction
Enteroids هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من الخلايا الجذعية المعوية البشرية المقيدة بالأعضاء 1,2. وهي تتكون بالكامل من سلالة ظهارية وتحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية المعوية المتمايزة2. تحافظ المعوية أيضا على قطبية خلوية تتكون من سطح لمعي قمي يشكل حجرة داخلية وسطحا قاعديا يواجه الوسائط المحيطة. Enteroids هي نموذج فريد من نوعه من حيث أنها تحافظ على خصائص المضيف الذي تم إنشاؤها منه3. وبالتالي ، فإن المعوية المتولدة من الأطفال الخدج تمثل نموذجا مفيدا للتحقيق في الأمراض التي تؤثر في المقام الأول على هذه الفئة من السكان ، مثل التهاب الأمعاء والقولون الناخر (NEC).
يزرع نموذج المعوي التقليدي في شكل قاعدي (BO) ، حيث يتم تغليف المعوي في قبة من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM). BMM يحث المعوي للحفاظ على هيكل 3D مع السطح القاعدي في الخارج. BO enteroids هي نموذج مناسب ل NEC الذي يسد الفجوة بين خطوط الخلايا البشرية الأولية ثنائية الأبعاد (2D) والنماذج الحيوانية في الجسم الحي 2,4. يتم تحريض NEC في المعوية عن طريق وضع مسببات الأمراض مثل LPS أو البكتيريا في الوسائط المحيطة ب enteroids ، تليها التعرض لظروف نقص الأكسجين 2,3. يتمثل التحدي في نموذج BO enteroid NEC في أنه لا يسمح بالدراسة الفعالة للتفاعلات بين المضيف والممرض ، والتي تحدث على السطح القمي في الجسم الحي. ترجع التغيرات في نفاذية الأمعاء إلى هذه التفاعلات بين المضيف والممرض. لفهم كيفية تأثير النفاذية على الأساس الفيزيولوجي المرضي للمرض بشكل أفضل ، يجب إنشاء نموذج يتضمن معالجة السطح القمي.
Co et al. كانوا أول من أثبت أن المعويات BO الناضجة يمكن تحريضها لتشكيل شكل قمي (AO) عن طريق إزالة قباب BMM وإعادة تعليقها في الوسائط5. أظهرت هذه المقالة أن المعوية AO حافظت على قطبية ظهارية صحيحة ، واحتوت على جميع أنواع الخلايا المعوية ، ودعمت الحاجز الظهاري المعوي ، وسمحت بالوصول إلى السطح القمي5. استخدام المعوية AO كنموذج NEC يحقق التكاثر الفسيولوجي لعملية المرض ودراسة التفاعلات بين المضيف والممرض.
أحد المساهمين الرئيسيين في الفيزيولوجيا المرضية ل NEC هو زيادة نفاذية الأمعاء6. تم اقتراح العديد من الجزيئات كطريقة لاختبار نفاذية الأمعاء في المختبر7. من بين هؤلاء ، لوسيفر الأصفر (LY) هو صبغة محبة للماء مع قمم الإثارة والانبعاث عند 428 نانومتر و 540 نانومتر ، على التوالي8. أثناء عبوره عبر جميع المسارات الرئيسية عبر الخلايا ، فقد تم استخدامه لتقييم نفاذية الخلايا في تطبيقات مختلفة ، بما في ذلك الحواجز الظهارية الدموية الدماغية والمعوية 8,9. يستخدم التطبيق التقليدي ل LY الخلايا المزروعة في طبقات أحادية على سطح شبه نافذ10. يتم تطبيق LY على السطح القمي ويعبر من خلال بروتينات الوصلة الضيقة شبه الخلوية للتجمع على الجانب القاعدي. تشير تركيزات LY الأعلى في المقصورة القاعدية إلى انخفاض بروتينات الوصلات الضيقة مع انهيار حاجز الخلايا الظهارية المعوية اللاحقة وزيادة النفاذية10. كما تم وصفه في نماذج 3D BO enteroid حيث تمت إضافة LY إلى الوسائط وتم تصوير المعويات الفردية لامتصاص LY في التجويف11. على الرغم من أن هذا يسمح بالتحليل النوعي من خلال تصور امتصاص LY ، إلا أن التحليل الكمي محدود. يحدد هذا البروتوكول تقنية فريدة تستخدم LY لتقييم نفاذية الخلايا باستخدام نموذج معوي NEC في المختبر في المعوية AO مع الحفاظ على اتجاه 3D. يمكن استخدام هذه الطريقة لكل من التحليل النوعي والكمي للنفاذية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نفاذية الأمعاء معقدة وتعكس وظيفة الحاجز الظهاري. يتكون الحاجز المعوي من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تتوسط النقل عبر الخلايا وشبه الخلوية14. تعتمد نفاذية الخلايا على بروتينات الوصلات الضيقة التي تغلق المسافة بين الخلايا الظهارية14. داخل هذا النقل عبر الخل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر آشلي نيلسون من المركز الطبي بجامعة روتشستر على مساعدتها الفعالة في نموذجنا المعوي. نود أيضا أن نشكر قسم جراحة الأطفال في جامعة أوكلاهوما على دعمهم لهذا المشروع. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة [NIH Grant R03 DK117216-01A1] ، ومركز أوكلاهوما لأبحاث الخلايا الجذعية للبالغين ، ومنحة مؤسسة الصحة المشيخية # 20180587 الممنوحة لقسم الجراحة في مركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
