Summary
Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.
Abstract
Les entéroïdes sont un outil de recherche émergent dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante (ECN). Ils sont traditionnellement cultivés dans la conformation basolatérale (BO), où la surface apicale de la cellule épithéliale fait face à la lumière interne. Dans ce modèle, l’accès à la surface luminale des entéroïdes pour le traitement et l’expérimentation est difficile, ce qui limite la capacité d’étudier les interactions hôte-pathogène. Pour contourner ce problème, un modèle néonatal apical-out (OA) pour l’entérocolite nécrosante a été créé. Étant donné que les changements de perméabilité des cellules épithéliales intestinales sont pathognomoniques pour l’ECN, ce protocole décrit l’utilisation du jaune de lucifer (LY) comme marqueur de la perméabilité paracellulaire. LY traverse la barrière épithéliale intestinale par les trois principales voies paracellulaires: pore, fuite et sans restriction. L’utilisation de LY dans un modèle AO permet une étude plus large de la perméabilité dans NEC. À la suite de l’approbation de la CISR et du consentement parental, des échantillons chirurgicaux de tissu intestinal ont été prélevés sur des nouveau-nés prématurés humains. Les cellules souches intestinales ont été récoltées par isolement de crypte et utilisées pour cultiver des entéroïdes. Les entéroïdes ont été cultivés jusqu’à maturité, puis transformés AO ou laissés en conformation BO. Ceux-ci n’ont pas été traités (témoins) ou ont été traités avec du lipopolysaccharide (LPS) et soumis à des conditions hypoxiques pour l’induction d’ECN in vitro . La LY a été utilisée pour évaluer la perméabilité. La coloration immunofluorescente de la protéine apicale zonula occludens-1 et de la protéine basolatérale β-caténine a confirmé la conformation de l’AO. Les entéroïdes AO et BO traités avec du LPS et de l’hypoxie ont démontré une perméabilité paracellulaire significativement accrue par rapport aux témoins. Les entéroïdes OA et BO ont montré une absorption accrue de LY dans la lumière des entéroïdes traités par rapport aux témoins. L’utilisation de la LY dans un modèle entéroïde AO permet d’étudier les trois principales voies de perméabilité paracellulaire. Il permet également d’étudier les interactions hôte-pathogène et comment cela peut affecter la perméabilité par rapport au modèle entéroïde BO.
Introduction
Les entéroïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches intestinales humainesrestreintes aux organes 1,2. Ils sont entièrement constitués de lignée épithéliale et contiennent tous les types de cellules épithéliales intestinales différenciées2. Les entéroïdes maintiennent également la polarité cellulaire composée d’une surface luminale apicale formant un compartiment interne et d’une surface basolatérale faisant face au milieu environnant. Les entéroïdes sont un modèle unique en ce sens qu’ils préservent les caractéristiques de l’hôte à partir duquel ils ont été générés3. Ainsi, les entéroïdes générés à partir de nourrissons humains prématurés représentent un modèle utile pour étudier les maladies qui touchent principalement cette population, telles que l’entérocolite nécrosante (ECN).
Le modèle entéroïde traditionnel est cultivé dans une conformation basolatérale (BO), où l’entéroïde est enfermé dans un dôme de matrice membranaire basale (BMM). BMM induit l’entéroïde à maintenir une structure 3D avec la surface basolatérale à l’extérieur. Les entéroïdes BO sont un modèle approprié pour l’ECN qui comble l’écart entre les lignées cellulaires humaines primaires bidimensionnelles (2D) et les modèles animaux in vivo 2,4. L’ECN est induite chez les entéroïdes en plaçant des agents pathogènes tels que le LPS ou les bactéries dans le milieu entourant les entéroïdes, suivie d’une exposition à des conditions hypoxiques 2,3. Le défi avec le modèle NEC entéroïde BO est qu’il ne permet pas l’étude efficace des interactions hôte-pathogène, qui se produisent à la surface apicale in vivo. Les changements dans la perméabilité intestinale sont dus à ces interactions hôte-pathogène. Pour mieux comprendre comment la perméabilité affecte la base physiopathologique de la maladie, il faut créer un modèle qui implique le traitement de la surface apicale.
Co et al. ont été les premiers à démontrer que les entéroïdes BO matures peuvent être induits à former une conformation apicale-out (AO) en retirant les dômes BMM et en les remettant en suspension dans le milieu5. Cet article a démontré que les entéroïdes AO maintenaient une polarité épithéliale correcte, contenaient tous les types de cellules intestinales, maintenaient la barrière épithéliale intestinale et permettaient l’accès à la surface apicale5. L’utilisation des entéroïdes AO comme modèle NEC permet une reproduction physiologique du processus pathologique et l’étude des interactions hôte-pathogène.
L’un des principaux contributeurs à la physiopathologie de l’ECN est l’augmentation de la perméabilité intestinale6. Plusieurs molécules ont été proposées comme moyen de tester la perméabilité intestinale in vitro7. Parmi ceux-ci, le jaune de lucifer (LY) est un colorant hydrophile avec des pics d’excitation et d’émission à 428 nm et 540 nm, respectivement8. Comme il traverse toutes les principales voies paracellulaires, il a été utilisé pour évaluer la perméabilité paracellulaire dans diverses applications, y compris les barrières hémato-encéphalique et intestinale 8,9. L’application traditionnelle de LY utilise des cellules cultivées en monocouches sur une surface semi-perméable10. LY est appliqué sur la surface apicale et traverse les protéines de jonction serrée paracellulaire pour se rassembler sur le côté basolatéral. Des concentrations plus élevées de LY dans le compartiment basolatéral indiquent une diminution des protéines de jonction serrée avec une dégradation subséquente de la barrière cellulaire épithéliale intestinale et une perméabilité accrue10. Il a également été décrit dans des modèles entéroïdes BO 3D où la LY a été ajoutée au milieu et les entéroïdes individuels ont été imagés pour l’absorption de LY dans la lumière11. Bien que cela permette une analyse qualitative via la visualisation de l’absorption des LEI, l’analyse quantitative est limitée. Ce protocole décrit une technique unique qui utilise la LY pour évaluer la perméabilité paracellulaire à l’aide d’un modèle entéroïde NEC in vitro chez les entéroïdes AO tout en maintenant l’orientation 3D. Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse qualitative et quantitative de la perméabilité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La présente recherche a été réalisée conformément à l’approbation du Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) à l’Université de l’Oklahoma. Le consentement des parents était requis avant de prélever des échantillons chirurgicaux humains, conformément aux spécifications de la CISR. Après l’approbation de la CISR et le consentement des parents, du tissu intestinal grêle humain a été obtenu chez des nourrissons (âge gestationnel corrigé (AG) allant de 36 à 41 semaines au moment du prélèvement de l’échantillon, tous ayant des antécédents de naissance prématurée à un AG estimé de 25 à 34 semaines, 2:1 M:F) subissant une intervention chirurgicale pour une ECN ou une autre résection intestinale, comme un retrait de stomie ou une réparation de l’atrésie. Les entéroïdes ont été générés à partir de tissus obtenus à partir du jéjunum ou de l’iléon.
1. Cultures entéroïdes humaines d’origine infantile : isolement de la crypte et placage à partir de tissus entiers
- Préparer les milieux de culture, le tampon chélatant #1 et le tampon chélatant #2 (tableau 1) à la suite du rapport précédent4. Conserver les tampons chélatants à 4 °C et les utiliser dans les 48 heures.
- Préparer des milieux miniintestinaux humains (tableau 1). Conservez le bouillon à −20 °C et au chaud au bain-marie à 37 °C avant utilisation.
- Préparer 50 % de milieux conditionnés en L-WRN (CM) (Tableau 1). Conservez le bouillon à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
NOTE: La base 100% L-WRN pour les milieux conditionnés est décrite dans un protocole par Miyoshi et al.12. - Générer des entéroïdes à partir d’échantillons de tissus intestinaux grêles obtenus à partir d’échantillons chirurgicaux suite au rapport précédent4. Plaquer quatre puits d’entéroïdes dans une plaque de 24 puits à partir d’un morceau de tissu intestinal de 0,75 à 2,5 g.
REMARQUE : Les entéroïdes peuvent être générés avec succès à partir de tissus stockés dans un milieu de 30 ml du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dans un tube conique de 50 ml à 4 °C pendant 48 h maximum. - Placez la plaque de 24 puits dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 à l’envers pendant 15-20 minutes pour permettre la polymérisation des dômes BMM4.
- Ajouter 500 μL de L-WRN cm à 50 % (tel que décrit à l’étape 1.3) avec 0,5 μL d’Y-27632, inhibiteur de ROCK (IR, voir le tableau des matériaux) à chaque puits. Après 2-3 jours, remplacer par 50% L-WRN CM sans RI.
2. Génération d’entéroïdes AO
- Cultiver des entéroïdes incorporés dans BMM pendant 7-10 jours avec 50% L-WRNCM 4.
- Retirez le média et ajoutez 500 μL de solution de récupération cellulaire (CRS, voir Tableau des matériaux) dans un puits. Grattez le dôme, pipette de haut en bas plusieurs fois, puis ajoutez la solution CRS/entéroïde/BMM au puits suivant.
- Grattez le dôme, pipette de haut en bas plusieurs fois et placez la solution dans un tube à microcentrifugeuse. Ajouter 500 μL de CRS au deuxième puits, pipeter de haut en bas, puis l’ajouter au premier puits. Transférer cette solution dans le même tube microcentrifuge de 1,5 mL.
- Répétez l’étape 2.3, en regroupant deux puits dans un tube microcentrifuge jusqu’à ce que tout le contenu du puits soit dans CRS.
REMARQUE : Plus de deux puits peuvent être regroupés dans un tube conique plus grand de 15 mL s’ils génèrent de grands volumes d’entéroïdes d’AO. Le maintien d’un ratio de SRC par puits de 500 μL est important pour assurer une solubilisation complète de la BMM. - Placer les tubes microcentrifugés (étape 2.3) avec une solution poolée CRS/entéroïde/BMM sur un rotateur pendant 1 h à 4 °C pour solubiliser le BMM.
- Centrifuger la solution à 200 x g pendant 3 min à 4°C, puis retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette en laissant la pastille derrière.
- Resuspendre la pastille entéroïde dans 1 mL de L-WRN cm à 50 % (tel que préparé à l’étape 1.3) par tube de microcentrifugeuse. Pipeter doucement 500 μL de la solution entéroïde/milieu en suspension dans chaque puits des plaques de culture tissulaire à 24 puits à très faible fixation (voir le tableau des matériaux).
- Incuber à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 jours avant l’expérimentation.
3. Vérification de la conformation entéroïde de l’OA par coloration immunofluorescente sur support entier
- Après l’incubation des entéroïdes en suspension de milieu pendant 3 jours, pipeter la suspension entéroïde/média d’un puits dans un tube à microcentrifugeuse.
- Centrifuger la suspension entéroïde/milieu à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une micropipette.
- Resuspendre les entéroïdes dans 20 μL de BMM. Pipeter 10 μL de suspension entéroïde sur une lame de microscope et l’étaler en une fine couche d’environ 1 cm sur 1 cm carré. Répéter avec les 10 μL restants de suspension entéroïde sur une partie séparée de la même lame de sorte qu’il y ait deux frottis de suspension entéroïde/BMM.
- Laisser les frottis entéroïdes/BMM se solidifier à température ambiante (TR) pendant 15 min.
- En travaillant dans la hotte, placer la lame dans un pot de coloration et remplir de 4% de paraformaldéhyde jusqu’à ce qu’elle recouvre le frottis entéroïde/BMM (~30 mL pour une lame si vous utilisez un pot de coloration en verre d’une capacité de 10 lames). Laisser agir 30 minutes (à température ambiante) pour que la fixation ait lieu.
ATTENTION : Le paraformaldéhyde à 4 % est dangereux et peut causer des lésions ou irritations oculaires, une irritation de la peau et le cancer. Travaillez toujours sous une hotte lorsque vous l’utilisez. Portez des gants de protection et de l’équipement de protection individuelle lorsque vous le manipulez. Jetez-le dans un conteneur d’élimination des déchets approuvé. - Jeter 4 % de paraformaldéhyde dans un contenant à déchets approprié. Ajouter 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le pot de coloration ou jusqu’à ce que le PBS recouvre les frottis entéroïdes/BMM. Laisser reposer pendant 3 minutes à TA, puis jeter le PBS dans le flacon de déchets de paraformaldéhyde. Répétez cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages.
- Remplissez un nouveau pot de coloration avec 30 ml de Triton X-100 à 0,5% dilué dans du PBS. Placer la lame avec les frottis entéroïdes/BMM dans la solution Triton et laisser perméabiliser pendant 20 min à TA.
- Jetez le Triton X-100 à 0,5% dilué dans du PBS. Ajouter 30 ml de PBS dans le pot de coloration et laisser reposer pendant 3 minutes. Jetez le PBS en le décantant.
- Essuyez délicatement la lame autour des frottis entéroïdes/BMM, en prenant soin de ne pas les perturber. À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe (stylo PAP barrière, voir le tableau des matériaux), tracez un cercle autour de chacun des frottis entéroïdes/BMM. Faire un sérum à 20%, spécifique à l’animal chez lequel l’anticorps secondaire a été élevé (voir Tableau des matériaux).
- Posez la lame du microscope à plat sur la paillasse du laboratoire. Bloquer la lame pendant 1 h à 4 °C en pipetant 100 μL de sérum spécifique à 20 % de l’étape 3.9 sur chacun des frottis entéroïdes/BMM entourés par le stylo barrière hydrophobe.
- Préparer une solution de 100 μL avec des dilutions de 1:100 et 1:200 d’anticorps primaires β-caténine et ZO-1, respectivement, dilués dans du PBS.
REMARQUE : Chaque anticorps primaire doit provenir d’un animal différent pour s’assurer qu’il aura des canaux immunofluorescents distincts lorsqu’il sera photographié. La présente étude utilise un anticorps β-caténine de souris et un anticorps ZO-1 de lapin (voir le tableau des matériaux). - Appuyez sur la lame sur le comptoir pour retirer le sérum à 20% et essuyez doucement, en prenant soin de ne pas perturber les frottis entéroïdes / BMM. Pipeter 100 μL de solution d’anticorps primaires β-caténine/ZO-1 sur l’un des frottis entéroïdes/BMM. Pipeter 100 μL de PBS sans anticorps primaire sur l’autre frottis entéroïde/BMM comme témoin négatif.
- Tapisser le fond d’un contenant en plastique avec une serviette en papier humide pour créer un contenant humidifié. Placez la lame dans le récipient, en veillant à ne pas perturber les solutions recouvrant les frottis entéroïdes/BMM. Placez le couvercle sur le récipient pour le sceller et conservez à plat à 4 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Ne laissez pas la lame sécher. Assurez-vous que le contenant est fermé pour éviter la dessiccation. - Une fois prêt à continuer, appuyez sur la lame sur le comptoir pour retirer les anticorps primaires et le PBS des frottis entéroïdes / BMM.
- Effectuez une étape de lavage en plaçant la lame dans un bocal à colorer et en la remplissant de 30 ml de PBS ou jusqu’à ce que le PBS recouvre les frottis entéroïdes / BMM. Laisser reposer pendant 3 min à température ambiante. Jetez le PBS et répétez cette étape deux fois de plus pour un total de trois lavages.
- Préparer 200 μL d’anticorps secondaires pour deux canaux immunofluorescents différents, chaque anticorps ayant une dilution de 1:1000 dans du PBS (voir le tableau des matériaux). Gardez la solution à l’abri de la lumière.
- Pipeter 100 μL de solution d’anticorps secondaires sur chacun des frottis entéroïdes/BMM. Placez-le dans l’obscurité et laissez-le reposer pendant 1 h à RT.
- Appuyez sur la lame sur le compteur pour retirer les anticorps secondaires. Répétez les étapes de lavage décrites à l’étape 3.15, en vous assurant que tous les lavages sont effectués dans l’obscurité.
- Ajouter une goutte de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (Fluoroshield avec DAPI, voir le tableau des matières) sur chacun des frottis entéroïdes/BMM et appliquer une lame de couverture pour s’assurer que les deux frottis sont adéquatement couverts. Évitez de coincer des bulles sous la lame. Gardez la lame dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elle soit prête à être vue au microscope.
REMARQUE: L’imagerie immédiate des lames donne les résultats les plus optimaux; cependant, les lames peuvent être stockées à plat dans un récipient humidifié à 4 °C et imagées jusqu’à 1 semaine après l’ajout de DAPI.
4. Induction de l’ECN expérimentale
- S’assurer que les entéroïdes OA ont été en suspension pendant au moins 72 heures avant utilisation.
- Pipeter doucement toute la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube à microcentrifugation.
REMARQUE : Plusieurs puits peuvent être regroupés dans un tube conique de 15 mL si un grand volume de puits est traité. Un minimum de trois puits par groupe de traitement est recommandé pour ce protocole. - Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA et retirer le surnageant.
- Ajouter 10 μL de 5 mg/mL de lipopolysaccharide (LPS, voir le tableau des matières) à 500 μL de 50 % de LWRN CM par puits (concentration finale de 100 μg/mL de LPS).
- Resuspendre les entéroïdes AO désignés comme groupe de traitement dans 50% LWRN + LPS et aliquote 500 μL de suspension sur une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Resuspendre les entéroïdes AO désignés comme témoins non traités dans 500 μL de 50 % de REL CM par puits. Aliquote 500 μL de cette suspension à une plaque de fixation séparée à très basse température de 24 puits.
- Induire l’hypoxie chez les entéroïdes AO traités au LPS via une chambre d’incubateur modulaire (CMI) contenant 1 % d’O2, 5 % de CO2 et 94 % deN2 selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Traiter les entéroïdes avec hypoxie et LPS pendant 24 h.
- Placer les cultures non traitées et LPS + hypoxie, toujours dans la chambre MIC, dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 pendant 24 h.
5. Mesure de la perméabilité paracellulaire à l’aide de LY
- Pipeter doucement la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube microcentrifugé. Réchauffer DPBS et 50% LRWN CM dans un bain-marie à 37 °C.
- Centrifuger la suspension entéroïde/milieu à 300 x g pendant 3 min à TA.
- Retirez le support. Lavez les entéroïdes avec du DPBS chaud de 500 μL.
- Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA. Retirer le surnageant à l’aide d’une micropipette.
- Répétez les étapes 5.3 à 5.4 une fois de plus pour un total de deux fois.
- Après le lavage, ajouter 450 μL de LWRN CM chaud à 50 % (tel que préparé à l’étape 1.3).
- Ajouter 50 μL de LY à 2,5 mg/mL (concentration finale de 0,25 μg/μL, voir le tableau des matières) à chaque puits et agiter doucement pour mélanger. Placer dans un incubateur à 37 °C, 5% CO 2 pendant2 h.
- Pipeter doucement la suspension entéroïde/média de chaque puits dans un tube microcentrifugé.
- Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA, puis retirer le surnageant en laissant la pastille entéroïde derrière.
- Laver les entéroïdes avec 500 μL de DPBS chaud.
- Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à TA, puis retirer le surnageant en laissant la pastille entéroïde derrière.
- Répétez les étapes 5.10-5.11 trois fois de plus pour un total de quatre lavages.
- Remettez chaque pastille en suspension avec 1 000 μL de DPBS froid et pipeter vigoureusement de haut en bas pour dissocier les entéroïdes.
- Préparer des étalons pour la courbe étalon LY diluée dans la DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
- Pipeter 150 μL de chaque échantillon par puits en triple sur une plaque de 96 puits.
- Mesurer la fluorescence à un pic d’excitation de 428 nm et un pic d’émission de 536 nm sur un lecteur de plaque capable de lire la fluorescence (voir le tableau des matériaux). À l’aide d’un logiciel statistique (voir le tableau des matières), calculer les concentrations en interpolant la courbe standard et en utilisant une courbe à quatre paramètres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Conformation AO
Les entéroïdes en suspension dans un milieu LWRN à 50 % pendant 72 h supposent une conformation OA (Figure 1). Cela a été confirmé par coloration immunofluorescente utilisant des montures entières entéroïdes de la protéine apicale, zonula occludens-1 (ZO-1), et de la protéine basolatérale, β-caténine (Figure 1). Les entéroïdes AO montrent ZO-1 (vert) sur la surface apicale externe de l’entéroïde, tandis que la β-caténine (rouge) se trouve sur la surface interne basolatérale (figure 1A). Les entéroïdes BO montrent l’inverse avec la β-caténine (rouge) sur la surface externe et ZO-1 (vert) sur la surface luminale interne (figure 1B). Ces résultats montrent l’inversion de polarité attendue pour confirmer que les entéroïdes sont AO avant l’expérimentation.
Résultats du test LY
Une perméabilité accrue, démontrée par l’absorption accrue du colorant LY dans la lumière entéroïde, est attendue dans NEC6. Les entéroïdes BO traités par LPS et hypoxie ont montré une perméabilité significativement accrue par rapport aux témoins non traités utilisant la technique décrite dans ce protocole (Figure 2A, **p = 0,005). Cela concorde avec la littérature qui a décrit une perméabilité accrue dans les modèles entéroïdes BO de NEC 4,13. De même, les entéroïdes OA traités avec du LPS et de l’hypoxie ont également démontré une perméabilité significativement accrue par rapport aux témoins non traités, comme prévu dans un modèle NEC (Figure 3A, *p = 0,02). Les entéroïdes AO traités ont montré une absorption accrue de LY dans la lumière des entéroïdes traités (figure 3C) par rapport aux témoins non traités (figure 3B). Ceci est similaire à ce qui est observé dans les entéroïdes BO, où la LY est visualisée dans la lumière entéroïde (Figure 2B). L’absorption accrue du colorant LY dans la lumière des entéroïdes entraîne une augmentation de la fluorescence chez les entéroïdes traités, ce qui permet une analyse quantitative via un lecteur de microplaques utilisant des entéroïdes AO provenant de différents puits (Figure 3A). Cela démontre que cette technique, utilisant LY, peut être utilisée pour évaluer la perméabilité chez les entéroïdes 3D. Les résultats peuvent être analysés à l’aide d’un logiciel statistique capable d’interpoler une courbe standard pour déterminer les concentrations de LY des groupes de traitement. Le test t d’un étudiant, comme le montrent les figures 2 et 3, peut être utilisé pour déterminer la signification entre les groupes.
Figure 1 : Vérification de la conformation de l’OE. (A) entéroïde de sortie apicale (AO) présentant une polarité inverse par rapport à (B) entéroïde de sortie basolatérale (BO) présentant une polarité traditionnelle à un grossissement de 20x, barre d’échelle réglée à 100 μm. DAPI, bleu; bêta-caténine (protéine basolatérale), rouge; Zonula occludens-1 (protéine apicale), vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Perméabilité accrue dans un modèle entéroïde BO après induction in vitro de NEC mesurée par un test LY. (A) Le LPS et les entéroïdes basolatéraux-out traités par hypoxie ont une perméabilité significativement accrue par rapport aux témoins non traités utilisant le dosage jaune de Lucifer; les barres d’erreur indiquent l’erreur-type de la moyenne; **p = 0,005. (B) Image d’entéroïdes basolatéraux-out avec jaune de lucifer visualisés dans la lumière après traitement du milieu avec colorant jaune de lucifer à grossissement 10x, barre d’échelle de 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Perméabilité accrue dans un modèle entéroïde OA après induction in vitro de NEC, mesurée par un test LY. (A) Le LPS et les entéroïdes apicals traités par hypoxie ont une perméabilité significativement accrue par rapport aux témoins non traités utilisant le test jaune de Lucifer; les barres d’erreur indiquent l’erreur-type de la moyenne; *p = 0,02. (B) Une image représentative de l’entéroïde apical-out (AO) témoin non traité à 10x; La barre d’échelle est réglée sur 100 μm. (C) Une image représentative d’un entéroïde AO traité par LPS et hypoxie avec LY est visualisée dans la lumière à 10x; La barre d’échelle est réglée sur 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Composition des solutions, des tampons et des milieux utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La perméabilité intestinale est complexe et reflète la fonction de barrière épithéliale. La barrière intestinale comprend une seule couche de cellules épithéliales qui intervient dans le transport transcellulaire et paracellulaire14. La perméabilité paracellulaire repose sur des protéines de jonction serrée qui scellent l’espace entre les cellules épithéliales14. Dans ce transport paracellulaire, il existe trois voies distinctes par lesquelles les molécules peuvent se croiser: les pores, les fuites et les15 sans restriction. La voie des pores permet la perméabilité aux petits ions chargés, tandis que la voie de fuite permet des molécules plus grandes et non chargées à travers15. La troisième voie, non restreinte, reflète la perméabilité secondaire à une lésion épithéliale ou à la mort16. Bien que de nombreuses molécules soient utilisées pour évaluer la perméabilité paracellulaire, le type et la taille de la molécule influencent la voie de perméabilité qui sera étudiée.
En tant que petite molécule hydrophile, LY peut traverser les trois voies paracellulaires, ce qui en fait un outil optimal pour étudier la perméabilité paracellulaire. En revanche, 4 kDa FITC-dextran, une molécule de sucre utilisée comme marqueur de perméabilité paracellulaire, ne peut traverser que la fuite et les voies sans restriction. Le FITC-dextrane plus grand, de 70 kDa, est limité à la voie sans restriction. Une autre méthode de détermination de la perméabilité paracellulaire consiste à effectuer des mesures de résistance transépithéliale (TEER), qui mesurent la résistance électrique à travers les monocouches. Cette méthode ne mesure que la voie des pores17. Ainsi, LY fournit un meilleur aperçu de la perméabilité paracellulaire globale en ciblant les trois voies. Ce protocole capitalise sur cela en utilisant LY pour étudier la perméabilité paracellulaire.
Le modèle entéroïde a été sélectionné dans ce protocole car il imite plus étroitement les conditions in vivo en créant un mini-intestin 3D à étudier. Cependant, le défi avec le modèle entéroïde BO traditionnel est de savoir comment accéder à la surface apicale pour étudier les interactions hôte-pathogène et les changements de perméabilité subséquents. Le modèle entéroïde AO surmonte ce défi en inversant la polarité où la surface apicale est en contact avec le milieu environnant. Plusieurs méthodes alternatives d’accès à la surface apicale des entéroïdes ont été décrites. Il s’agit notamment des systèmes de puces intestinales, de la micro-injection, de la fragmentation et de la croissance d’entéroïdes dans les monocouches18,19. Les progrès des systèmes de puces intestinales ont permis la culture d’organoïdes et de cellules endothéliales ensemble dans le contexte de la vascularisation et du péristaltisme pour imiter l’environnement intestinal18. La microinjection consiste à injecter dans la lumière entéroïde BO l’aide d’équipements spécialisés tels qu’un micromanipulateur et un microinjecteur19. La fragmentation utilise la dissociation des entéroïdes en cellules uniques qui sont ensuite incubées en milieu avec l’agent pathogène avant de reformer une structure 3D19. La transformation des entéroïdes en monocouches 2D avec traitement ultérieur de la surface apicale a également été décrite19. Le modèle entéroïde AO résout certaines des difficultés de ces modèles en fournissant un moyen simple et efficace d’exposer la surface apicale sans nécessiter d’équipement coûteux ou compromettre l’intégrité structurelle de l’entéroïde.
Bien que l’utilisation de LY dans un modèle AO permette une vaste étude de la perméabilité paracellulaire secondaire aux interactions hôte-pathogène, ce protocole peut être adapté pour être utilisé avec des entéroïdes BO ainsi que FITC-dextran au lieu de LY. Deux changements clés à ce protocole sont nécessaires pour le modifier afin qu’il soit utilisé pour les entéroïdes BO. Tout d’abord, les entéroïdes BO peuvent être maintenus dans des dômes BMM pour toutes les étapes de lavage avant et après l’ajout de LY. Il est important d’utiliser des solutions chauffées à 37 °C pour ces étapes de lavage afin d’éviter la solubilisation du dôme BMM. Deuxièmement, le dôme BMM doit être perturbé avec du DPBS froid et gratter le puits avec une pointe de pipette une fois toutes les étapes de lavage terminées afin de permettre une remise en suspension complète des entéroïdes dissociés et de la LY. Si FITC-dextran est substitué à LY, il est recommandé d’utiliser la molécule de 4 kDa lorsqu’elle traverse deux des trois voies paracellulaires.
Les étapes clés de ce protocole consistent notamment à assurer des lavages adéquats pour éliminer toute trace de LY de la solution à l’extérieur de l’entéroïde. Il est également important de laver doucement les entéroïdes pour éviter la dissociation et la libération potentielle de LY de la lumière dans la solution environnante jusqu’à ce qu’ils soient prêts à quantifier à l’aide d’un lecteur de microplaques. L’utilisation de solutions chauffées pendant les étapes de lavage diminue également le stress sur les entéroïdes. Si des solutions froides sont utilisées, les entéroïdes peuvent subir une apoptose, conduisant à des résultats inexacts.
Les limites de cette méthode comprennent l’incapacité de propager les entéroïdes AO et des temps de culture plus longs en raison des 72 heures supplémentaires nécessaires pour inverser la polarité. Il y a également une diminution de 2 % à 5 % du nombre d’entéroïdes d’OA traités par rapport aux témoins. Bien que cela soit globalement négligeable, cela peut conduire à une sous-estimation des résultats. Les limites de l’utilisation de LY sont similaires à celles d’autres molécules de perméabilité, telles que 4 kDa FITC-dextran, où des traces peuvent traverser la barrière épithéliale intestinale via la transcytose20. Bien que ce montant soit négligeable, il peut affecter les résultats. Sur la base de ces résultats, l’application de LY aux milieux des entéroïdes AO fournit un moyen élégant et relativement simple d’analyser quantitativement et qualitativement la perméabilité intestinale paracellulaire dans un modèle 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne rapportent aucun intérêt exclusif ou commercial dans un produit mentionné ou un concept discuté dans cet article.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Ashley Nelson du centre médical de l’Université de Rochester pour son aide instrumentale avec notre modèle entéroïde. Nous tenons également à remercier la Division de chirurgie pédiatrique de l’Université de l’Oklahoma pour son soutien à ce projet. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], l’Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research et le Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 attribué au département de chirurgie du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
