Summary
Настоящий протокол описывает метод, который использует желтый люцифер в апикально-энтероидной модели для определения кишечной проницаемости. Этот метод может быть использован для определения параклеточной проницаемости у энтероидов, которые моделируют воспалительные заболевания кишечника, такие как некротизирующий энтероколит.
Abstract
Энтероиды являются новым исследовательским инструментом в изучении воспалительных заболеваний кишечника, таких как некротизирующий энтероколит (NEC). Они традиционно выращиваются в базолатеральной (BO) конформации, где апикальная поверхность эпителиальной клетки обращена к внутреннему просвету. В этой модели доступ к просветной поверхности энтероидов для лечения и экспериментов является сложной задачей, что ограничивает возможность изучения взаимодействий хозяина и патогена. Чтобы обойти это, была создана неонатальная апикальная модель (AO) для некротизирующего энтероколита. Поскольку изменения проницаемости эпителиальных клеток кишечника являются патогномоничными для NEC, этот протокол описывает использование люциферного желтого (LY) в качестве маркера параклеточной проницаемости. LY пересекает эпителиальный барьер кишечника через все три основных параклеточных пути: поры, утечки и неограниченные. Использование LY в модели AO позволяет более широко изучить проницаемость в NEC. После одобрения IRB и согласия родителей у недоношенных новорожденных человека были взяты хирургические образцы кишечной ткани. Кишечные стволовые клетки были собраны с помощью изоляции крипты и использовались для выращивания энтероидов. Энтероиды выращивали до зрелости, а затем трансформировали АО или оставляли в конформации БО. Их либо не лечили (контроль), либо лечили липополисахаридом (ЛПС) и подвергали гипоксическим состояниям для индукции НЭК in vitro . LY использовался для оценки проницаемости. Иммунофлуоресцентное окрашивание апикального белка zonula occludens-1 и базолатерального белка β-катенина подтвердило конформацию АО. Энтероиды AO и BO, получавшие ЛПС и гипоксию, продемонстрировали значительно повышенную параклеточную проницаемость по сравнению с контрольной группой. Энтероиды AO и BO показали повышенное поглощение LY в просвет обработанных энтероидов по сравнению с контрольной группой. Использование LY в энтероидной модели AO позволяет исследовать все три основных пути параклеточной проницаемости. Это также позволяет исследовать взаимодействия хозяин-патоген и то, как это может повлиять на проницаемость по сравнению с энтероидной моделью BO.
Introduction
Энтероиды представляют собой трехмерные (3D) структуры, полученные из ограниченных органами стволовых клеток кишечника человека 1,2. Они полностью состоят из эпителиальной линии и содержат все дифференцированные типы эпителиальных клеток кишечника2. Энтероиды также поддерживают клеточную полярность, состоящую из апикальной просветной поверхности, образующей внутренний компартмент и базолатеральную поверхность, обращенную к окружающим средам. Энтероиды являются уникальной моделью в том смысле, что они сохраняют характеристики хозяина, из которого они были получены3. Таким образом, энтероиды, полученные от недоношенных человеческих детей, представляют собой модель, которая полезна для исследования заболеваний, которые в первую очередь влияют на эту популяцию, таких как некротизирующий энтероколит (NEC).
Традиционная энтероидная модель выращивается в базолатеральной (BO) конформации, где энтероид заключен в купол базальной мембранной матрицы (BMM). BMM побуждает энтероид поддерживать 3D-структуру с базолатеральной поверхностью снаружи. Энтероиды BO являются подходящей моделью для NEC, которая преодолевает разрыв между двумерными (2D) первичными клеточными линиями человека и in vivo животными моделями 2,4. NEC индуцируется у энтероидов путем размещения патогенов, таких как ЛПС или бактерии, в средах, окружающих энтероиды, с последующим воздействием гипоксических состояний 2,3. Проблема с энтероидной моделью BO NEC заключается в том, что она не позволяет эффективно изучать взаимодействия хозяин-патоген, которые происходят на апикальной поверхности in vivo. Изменения в кишечной проницаемости обусловлены этими взаимодействиями хозяина и патогена. Чтобы лучше понять, как проницаемость влияет на патофизиологическую основу заболевания, необходимо создать модель, которая включает в себя обработку апикальной поверхности.
Co et al. были первыми, кто продемонстрировал, что зрелые энтероиды BO могут быть индуцированы для формирования апикальной (AO) конформации путем удаления куполов BMM и повторного использования их в среде5. Эта статья продемонстрировала, что энтероиды АО поддерживали правильную эпителиальную полярность, содержали все типы клеток кишечника, поддерживали кишечный эпителиальный барьер и обеспечивали доступ к апикальной поверхности5. Использование энтероидов АО в качестве модели НЭК обеспечивает физиологическое воспроизведение процесса заболевания и изучение взаимодействий хозяин-патоген.
Одним из основных факторов, влияющих на патофизиологию НЭК, является повышенная кишечная проницаемость6. Несколько молекул были предложены в качестве способа проверки кишечной проницаемости in vitro7. Среди них люцифер желтый (LY) представляет собой гидрофильный краситель с пиками возбуждения и излучения при 428 нм и 540 нм соответственно8. Поскольку он пересекает все основные параклеточные пути, он был использован для оценки параклеточной проницаемости в различных приложениях, включая гематоэнцефалические и кишечные эпителиальные барьеры 8,9. Традиционное применение LY использует клетки, выращенные в монослоях на полупроницаемой поверхности10. LY наносится на поверхность апикального сустава и пересекает параклеточные плотные соединительные белки, чтобы собраться на базолатеральной стороне. Более высокие концентрации LY в базолатеральном компартменте указывают на снижение плотного соединения белков с последующим разрушением барьера эпителиальных клеток кишечника и повышением проницаемости10. Он также был описан в энтероидных моделях 3D BO, где LY был добавлен в среду, а отдельные энтероиды были изображены для поглощения LY в просвет11. Хотя это позволяет проводить качественный анализ с помощью визуализации поглощения LY, количественный анализ ограничен. Этот протокол описывает уникальную технику, которая использует LY для оценки параклеточной проницаемости с использованием энтероидной модели IN vitro NEC в энтероидах AO при сохранении 3D-ориентации. Этот метод может быть использован как для качественного, так и для количественного анализа проницаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящее исследование было выполнено в соответствии с одобрением Совета по институциональному обзору (IRB, #11610, 11611) в Университете Оклахомы. Перед сбором человеческих хирургических образцов требовалось согласие родителей в соответствии со спецификациями IRB. После одобрения IRB и согласия родителей ткань тонкой кишки человека была получена от младенцев (скорректированный гестационный возраст (GA) в диапазоне от 36-41 недели на момент отбора проб, все с историей преждевременных родов при предполагаемой ГА 25-34 недели, 2: 1 M: F), перенесших операцию по NEC или другую резекцию кишечника, такую как удаление остомии или восстановление атрезии. Энтероиды были получены из ткани, полученной либо из тощей кишки, либо из подвздошной кишки.
1. Энтероидные культуры, полученные от младенцев человека: выделение крипты и покрытие из целой ткани
- Подготовьте питательные среды, хелатирующий буфер No 1 и хелатирующий буфер No 2 (таблица 1) в соответствии с предыдущим отчетом4. Храните хелатирующие буферы при 4 °C и используйте их в течение 48 ч.
- Подготовьте человеческую минигутовую среду (табл. 1). Храните запасы при температуре −20 °C и нагревайте на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием.
- Готовят 50% кондиционированную среду L-WRN (CM) (таблица 1). Хранить на складе при температуре 4 °C до 1 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100% L-WRN база для кондиционированных сред описана в протоколе Miyoshi et al.12. - Генерировать энтероиды из образцов тканей тонкой кишки, полученных из хирургических образцов после предыдущего отчета4. Пластинчат четыре лунки энтероидов в 24-луночную пластину из 0,75-2,5 г куска кишечной ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Энтероиды могут быть успешно получены из ткани, хранящейся в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 объемом 30 мл в конической трубке объемом 50 мл при 4 °C в течение 48 ч. - Поместите 24-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 вверх ногами в течение 15-20 мин, чтобы обеспечить полимеризацию куполов BMM4.
- Добавьте 500 мкл 50% L-WRN CM (как описано на этапе 1.3) с 0,5 мкл Y-27632, ингибитора ROCK (RI, см. Таблицу материалов) к каждой скважине. Через 2-3 дня заменить на 50% L-WRN CM без RI.
2. Генерация энтероидов АО
- Выращивайте энтероиды, встроенные в BMM в течение 7-10 дней с 50% L-WRN CM4.
- Извлеките носитель и добавьте 500 мкл раствора для восстановления клеток (CRS, см. Таблицу материалов) в одну лунку. Соскоблите купол, пипетку вверх и вниз несколько раз, затем добавьте раствор CRS / энтероид / BMM в следующую лунку.
- Соскоблите купол, пипетку вверх и вниз несколько раз и поместите раствор в микроцентрифужную трубку. Добавьте 500 мкл CRS во вторую лунку, пипетку вверх и вниз, затем добавьте ее в первую лунку. Переложите этот раствор в ту же микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Повторите шаг 2.3, объединив две скважины в одну микроцентрифужную трубку до тех пор, пока все содержимое скважины не окажется в CRS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более двух скважин могут быть объединены в одну большую коническую трубу объемом 15 мл, если генерируются большие объемы энтероидов АО. Поддержание соотношения CRS 500 мкл на скважину важно для обеспечения полной солюбилизации BMM. - Поместите микроцентрифужные трубки (стадия 2.3) с объединенным раствором CRS/энтероид/BMM на ротатор в течение 1 ч при 4 °C для солюбилизации BMM.
- Центрифугируют раствор при 200 х г в течение 3 мин при 4°С, затем удаляют супернатант с помощью микропипетки, оставляя гранулу позади.
- Повторно суспендируют энтероидную гранулу в 1 мл 50% L-WRN CM (как приготовлено на стадии 1.3) на микроцентрифужную трубку. Аккуратно пипетку 500 мкл повторно суспендированного раствора энтероидов/сред в каждую лунку ультранизкого прикрепления 24-луночных тканевых культуральных пластин (см. Таблицу материалов).
- Инкубировать при 37 °C с 5% CO2 в течение 3 дней до эксперимента.
3. Проверка конформации энтероидов АО с помощью полноразмерного иммунофлуоресцентного окрашивания
- После инкубации энтероидов в суспензии среды в течение 3 дней пипетку энтероидной/средовой суспензии из одной лунки в микроцентрифужную трубку.
- Центрифугировать энтероидную/среду суспензией при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
- Повторное суспендирование энтероидов в 20 мкл BMM. Пипетка 10 мкл энтероидной суспензии на предметное стекло микроскопа и выкладывает ее тонким слоем примерно 1 см на 1 см квадрата. Повторить с оставшимися 10 мкл энтероидной суспензии на отдельной части того же слайда так, чтобы остались два мазка энтероидной/BMM суспензии.
- Дайте энтероидным/BMM мазкам затвердеть при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин.
- Работая в вытяжном шкафу, поместите слайд в красильную банку и заполните 4% параформальдегидом, пока он не покроет мазок энтероида / BMM (~ 30 мл на один слайд, если используется стеклянная витражная банка с емкостью 10 слайдов). Дайте 30 мин (при комнатной температуре) для фиксации.
ВНИМАНИЕ: 4% параформальдегид опасен и может вызвать повреждение глаз / раздражение, раздражение кожи и рак. Всегда работайте под вытяжным кожухом при его использовании. Надевайте защитные перчатки и средства индивидуальной защиты при обращении с ним. Утилизируйте его в утвержденный контейнер для удаления отходов. - Выбросьте 4% параформальдегида в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте 30 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в банку для окрашивания или до тех пор, пока PBS не покроет мазки энтероидов / BMM. Дайте ему постоять в течение 3 минут на RT, а затем выбросьте PBS в бутылку для отходов параформальдегида. Повторите этот шаг еще два раза, чтобы выполнить в общей сложности три стирки.
- Наполните новую банку окрашивания 30 мл 0,5% Triton X-100, разбавленного в PBS. Поместите слайд с энтероидными/BMM мазками в раствор Тритона и дайте ему проникнуть в течение 20 мин при RT.
- Откажитесь от 0,5% Triton X-100, разбавленного в PBS. Добавьте 30 мл PBS в банку для окрашивания и дайте ей постоять в течение 3 минут. Отбросьте PBS путем декантирования.
- Аккуратно протрите слайд вокруг энтероидных / BMM мазков, стараясь не нарушить их. Используя гидрофобную барьерную ручку (барьерная ручка PAP, см. Таблица материалов), нарисуйте круг вокруг каждого из энтероидных / BMM мазков. Делают 20% сыворотку, специфичную для животного, у которого было выращено вторичное антитело (см. Таблицу материалов).
- Положите слайд микроскопа на лабораторный стенд. Блокируйте слайд в течение 1 ч при 4 °C путем пипетирования 100 мкл определенной 20% сыворотки со стадии 3,9 на каждый из энтероидных/BMM мазков, окольцованных гидрофобной барьерной ручкой.
- Готовят раствор 100 мкл с 1:100 и 1:200 разведениями первичных антител β-катенина и ZO-1 соответственно, разведенных в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое первичное антитело должно быть от другого животного, чтобы гарантировать, что они будут иметь различные иммунофлуоресцентные каналы при изображении. В настоящем исследовании используется мышиное β-катениновое антитело и кроличье антитело ZO-1 (см. Таблицу материалов). - Нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить 20% сыворотку и аккуратно протрите насухо, стараясь не нарушить мазки энтероидов / BMM. Пипетка 100 мкл раствора первичного антитела β-катенин/ЗО-1 на один из мазков энтероидов/ВММ. Пипетка 100 мкл PBS без первичного антитела на другой энтероидный/BMM мазок в качестве отрицательного контроля.
- Выровняйте дно пластикового контейнера влажным бумажным полотенцем, чтобы создать увлажненный контейнер. Поместите слайд в контейнер, стараясь не нарушить растворы, покрывающие энтероидные / BMM мазки. Поместите крышку на контейнер для герметизации и храните при температуре 4 °C на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания горки. Убедитесь, что контейнер закрыт, чтобы избежать высыхания. - Как только все будет готово к продолжению, нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить первичные антитела и PBS из мазков энтероидов / BMM.
- Выполните этап промывки, поместив слайд в банку для окрашивания и заполнив 30 мл PBS или до тех пор, пока PBS не покроет мазки энтероидов / BMM. Дайте постоять 3 мин при комнатной температуре. Отбросьте PBS и повторите этот шаг еще дважды, в общей сложности три промывки.
- Приготовьте 200 мкл вторичных антител для двух различных иммунофлуоресцентных каналов, причем каждое антитело имеет разведение 1:1000 в PBS (см. Таблицу материалов). Храните раствор вдали от света.
- Пипетка 100 мкл раствора вторичного антитела на каждый из мазков энтероида/BMM. Поместите его в темноту и дайте постоять в течение 1 часа в RT.
- Нажмите на слайд на счетчике, чтобы удалить вторичные антитела. Повторите шаги стирки, описанные в шаге 3.15, гарантируя, что все стирки выполняются в темноте.
- Добавьте каплю 4',6-диамидино-2-фенилиндола (фторошилд с DAPI, см. Таблицу материалов) монтажной среды к каждому из мазков энтероидов/BMM и нанесите крышку, чтобы убедиться, что оба мазка адекватно покрыты. Избегайте улавливания пузырьков под крышкой. Держите слайд в темноте до готовности к просмотру под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленная визуализация слайдов дает наиболее оптимальные результаты; однако слайды могут храниться в увлажненном контейнере при 4 °C и отображаться в течение 1 недели после добавления DAPI.
4. Индукция экспериментальной НЭК
- Убедитесь, что энтероиды АО находились в суспензии не менее 72 ч перед использованием.
- Аккуратно выложите всю энтероидную/среду-суспензию из каждой лунки в микроцентрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько скважин могут быть объединены в одну коническую трубу объемом 15 мл, если обработан большой объем скважин. Для этого протокола рекомендуется минимум три скважины на группу лечения. - Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ и удаляют супернатант.
- Добавьте 10 мкл 5 мг/мл липополисахарида (ЛПС, см. Таблицу материалов) к 500 мкл 50% ЛВРН СМ на скважину (конечная концентрация 100 мкг/мл ЛПС).
- Энтероиды ресуспенд АО назначают в качестве группы лечения в 50% LWRN + LPS и аликвоте 500 мкл суспензии на 24-луночную сверхнизкую пластину крепления. Энтероиды resuspend AO, обозначенные как необработанные контрольные в 500 мкл 50% LWRN CM на лунку. Aliquot 500 мкл этой суспензии на отдельную 24-луночную сверхнизкую крепежную пластину.
- Индуцировать гипоксию в энтероидах АО, обработанных ЛПС , через модульную камеру инкубатора (MIC) с 1% O2, 5% CO2 и 94%N2 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Лечить энтероиды при гипоксии и ЛПС в течение 24 ч.
- Поместите необработанные и обработанные ЛПС + гипоксией культуры, все еще в камеру MIC, в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
5. Измерение параклеточной проницаемости с использованием LY
- Аккуратно выложите суспензию энтероида/среды из каждой лунки в микроцентрифужную трубку. Теплый DPBS и 50% LRWN CM на водяной бане 37 °C.
- Центрифугировать энтероидную/среду суспензией при 300 х г в течение 3 мин при РТ.
- Удалите носитель. Промыть энтероиды теплым 500 мкл DPBS.
- Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при RT. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
- Повторите шаги 5.3-5.4 еще раз, в общей сложности два раза.
- После промывки добавьте 450 мкл теплого 50% LWRN CM (как подготовлено на этапе 1.3).
- Добавьте 50 мкл 2,5 мг/мл LY (конечная концентрация 0,25 мкг/мкл, см. Таблицу материалов) к каждой лунке и осторожно закрутите для смешивания. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 2 ч.
- Аккуратно выложите суспензию энтероида/среды из каждой лунки в микроцентрифужную трубку.
- Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ, затем удаляют супернатант, оставляя энтероидную гранулу позади.
- Промыть энтероиды 500 мкл теплым DPBS.
- Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при РТ, затем удаляют супернатант, оставляя энтероидную гранулу позади.
- Повторите шаги 5.10-5.11 еще три раза, чтобы выполнить в общей сложности четыре стирки.
- Повторно суспендируйте каждую гранулу с 1000 мкл холодного DPBS и энергично пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать энтероиды.
- Подготовьте стандарты для стандартной кривой LY, разбавленной в DPBS (100 нг/мл; 50 нг/мл; 25 нг/мл; 12,5 нг/мл; 6,25 нг/мл; 3,13 нг/мл; 1,57 нг/мл; 0 нг/мл).
- Пипетка 150 мкл каждого образца на скважину в трех экземплярах на 96-луночной пластине.
- Измерьте флуоресценцию при пике возбуждения 428 нм и пике излучения 536 нм на пластинчатом считывателе, способном считывать флуоресценцию (см. Таблицу материалов). Используя статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов), рассчитайте концентрации путем интерполяции стандартной кривой и использования четырехпараметрической кривой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конформация АО
Энтероиды, суспендированные в 50% среде LWRN в течение 72 ч, предполагают конформацию AO (рисунок 1). Это было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием с использованием энтероидных целых маунтов апикального белка, zonula occludens-1 (ZO-1) и базолатерального белка, β-катенина (рисунок 1). Энтероиды AO показывают ZO-1 (зеленый) на наружной, апикальной поверхности энтероида, в то время как β-катенин (красный) находится на внутренней, базолатеральной поверхности (рисунок 1A). Энтероиды BO демонстрируют обратную сторону с β-катенином (красный) на внешней поверхности и ZO-1 (зеленый) на внутренней, просветной поверхности (рисунок 1B). Эти результаты показывают ожидаемое изменение полярности, чтобы подтвердить, что энтероиды являются АО до экспериментов.
Результаты анализа LY
Повышенная проницаемость, демонстрируемая повышенным поглощением красителя LY в энтероидном просвете, ожидается в NEC6. Энтероиды БО, обработанные ЛПС и гипоксией, показали значительно повышенную проницаемость по сравнению с необработанным контролем с использованием метода, описанного в этом протоколе (Рисунок 2A, **p = 0,005). Это согласуется с литературой, которая описала повышенную проницаемость в энтероидных моделях BO NEC 4,13. Аналогичным образом, энтероиды АО, обработанные ЛПС и гипоксией, также продемонстрировали значительно повышенную проницаемость по сравнению с необработанным контролем, как и ожидалось в модели NEC (рисунок 3A, *p = 0,02). Обработанные энтероиды AO показали повышенное поглощение LY в просвете обработанных энтероидов (рисунок 3C) по сравнению с необработанным контролем (рисунок 3B). Это похоже на то, что наблюдается у энтероидов BO, где LY визуализируется в энтероидном просвете (рисунок 2B). Повышенное поглощение красителя LY в просвете энтероида приводит к увеличению флуоресценции в обработанных энтероидах, что позволяет проводить количественный анализ с помощью считывателя микропластин с использованием энтероидов AO из разных скважин (рисунок 3A). Это демонстрирует, что этот метод, использующий LY, может быть использован для оценки проницаемости в 3D-энтероидах. Исходы могут быть проанализированы с использованием статистического программного обеспечения, способного интерполировать стандартную кривую для определения концентраций LY в группах лечения. T-тест студента, как показано на рисунках 2 и 3, может быть использован для определения значимости между группами.
Рисунок 1: Проверка конформации АО. (А) Апикально-выходной (АО) энтероид, показывающий обратную полярность по сравнению с (В) базолатеральным выходом (БО) энтероидом, показывающим традиционную полярность при 20-кратном увеличении, шкала установлена на 100 мкм. DAPI, синий; бета-катенин (базолатеральный белок), красный; zonula occludens-1 (апикальный белок), зеленый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Повышенная проницаемость в энтероидной модели БО после индукции NEC in vitro , измеренная анализом LY. (A) ЛПС и обработанные гипоксией базолатеральные энтероиды имеют значительно повышенную проницаемость по сравнению с необработанным контролем с использованием желтого анализа люцифера; полосы ошибок показывают стандартную погрешность среднего значения; **p = 0,005. (B) Изображение базолатеральных энтероидов с люциферным желтым цветом, визуализированное в просвете после обработки среды люциферным желтым красителем при 10-кратном увеличении, шкала 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Повышенная проницаемость в энтероидной модели АО после индукции NEC in vitro , измеренная анализом LY. (A) ЭНТЕРОИДЫ, обработанные ЛПС и гипоксией, значительно повысили проницаемость по сравнению с необработанными контрольными группами с использованием желтого анализа люцифера; полосы ошибок показывают стандартную погрешность среднего значения; *p = 0,02. (B) Репрезентативное изображение необработанного энтероида контрольного апикального выхода (AO) в 10x; шкала установлена на 100 мкм. (C) Репрезентативное изображение энтероида АО, обработанного ЛПС и гипоксией, с LY визуализируется в просвете в 10x; шкала установлена на 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав растворов, буферов и сред, используемых в настоящем исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кишечная проницаемость сложна и отражает функцию эпителиального барьера. Кишечный барьер содержит один слой эпителиальных клеток, который опосредует трансклеточный и параклеточный транспорт14. Параклеточная проницаемость зависит от плотного соединения белков, которые запечатывают пространство между эпителиальными клетками14. В этом параклеточном транспорте есть три различных пути, по которым молекулы могут пересекаться: поры, утечка и неограниченные15. Поровой путь обеспечивает проницаемость для небольших заряженных ионов, в то время как путь утечки позволяет более крупным, незаряженным молекулам через15. Третий, неограниченный путь отражает проницаемость, вторичную по отношению к повреждению эпителия или смерти16. Хотя многие молекулы используются для оценки параклеточной проницаемости, тип и размер молекулы влияют на то, какой путь проницаемости будет исследован.
Как небольшая гидрофильная молекула, LY может пересекать все три параклеточных пути, что делает его оптимальным инструментом для изучения параклеточной проницаемости. Напротив, 4 кДа FITC-декстран, молекула сахара, используемая в качестве маркера параклеточной проницаемости, может проходить только утечку и неограниченные пути. Более крупный FITC-декстран мощностью 70 кДа ограничен только неограниченным путем. Другим методом определения параклеточной проницаемости являются измерения трансэпителиального сопротивления (TEER), которые измеряют электрическое сопротивление между монослоями. Этот метод измеряет только поровой путь17. Таким образом, LY обеспечивает более глубокое понимание общей параклеточной проницаемости, нацеливаясь на все три пути. Этот протокол извлекает выгоду из этого, используя LY для изучения параклеточной проницаемости.
Энтероидная модель была выбрана в этом протоколе, поскольку она более точно имитирует условия in vivo, создавая 3D-мини-кишечник для изучения. Однако проблема с традиционной энтероидной моделью БО заключается в том, как получить доступ к поверхности апикальной артерии для изучения взаимодействий хозяина и патогена и последующих изменений проницаемости. Энтероидная модель АО преодолевает эту проблему, изменяя полярность, когда апикальная поверхность находится в контакте с окружающей средой. Описано несколько альтернативных способов доступа к апикальной поверхности энтероидов. К ним относятся кишечные чиповые системы, микроинъекция, фрагментация и растущие энтероиды в монослоях18,19. Достижения в области систем кишечного чипа позволили культивировать органоиды и эндотелиальные клетки вместе в контексте васкулярности и перистальтики, чтобы имитировать кишечную среду18. Микроинъекция включает инъекцию в энтероидный просвет БО с использованием специализированного оборудования, такого как микроманипулятор и микроинъектор19. Фрагментация использует диссоциацию энтероидов в отдельные клетки, которые затем инкубируются в среде с патогеном перед реформированием 3D-структуры19. Также описано превращение энтероидов в 2D монослои с последующей обработкой апикальной поверхности19. Энтероидная модель АО решает некоторые трудности этих моделей, предоставляя простой и эффективный способ обнажения апикальной поверхности, не требуя дорогостоящего оборудования или не ставя под угрозу структурную целостность энтероида.
Хотя использование LY в модели AO позволяет широко изучить параклеточную проницаемость, вторичную по отношению к взаимодействиям хозяин-патоген, этот протокол может быть адаптирован для использования с энтероидами BO, а также FITC-декстраном вместо LY. Два ключевых изменения в этом протоколе необходимы, чтобы модифицировать его для использования для энтероидов BO. Во-первых, энтероиды BO могут поддерживаться в куполах BMM на всех этапах промывки до и после добавления LY. Важно использовать растворы, нагретые до 37 ° C для этих этапов промывки, чтобы предотвратить солюбилизацию купола BMM. Во-вторых, купол BMM должен быть разрушен холодным DPBS и соскабливанием колодца с наконечником пипетки после завершения всех этапов промывки, чтобы обеспечить полное повторное суспендирование диссоциированных энтероидов и LY. Если FITC-декстран заменяется LY, рекомендуется использовать молекулу 4 кДа, поскольку она пересекает два из трех параклеточных путей.
Ключевые шаги в этом протоколе включают в себя обеспечение адекватной промывки для удаления любых следов LY из раствора за пределами энтероида. Также важно осторожно промыть энтероиды, чтобы избежать диссоциации и потенциального высвобождения LY из просвета в окружающий раствор до тех пор, пока они не будут готовы к количественному измерению с помощью считывателя микропластин. Использование подогретых растворов во время этапов промывки также снижает нагрузку на энтероиды. Если используются холодные растворы, энтероиды могут подвергаться апоптозу, что приводит к неточным результатам.
Ограничения этого метода включают невозможность распространения энтероидов АО и более длительное время культивирования из-за дополнительных 72 ч, необходимых для обратной полярности. Также наблюдается снижение на 2%-5% количества обработанных энтероидов АО по сравнению с контрольной группой. Хотя это в целом незначительно, это может привести к недооценке результатов. Ограничения использования LY аналогичны другим молекулам проницаемости, таким как 4 кДа FITC-декстран, где следовые количества могут пересекать кишечный эпителиальный барьер через трансцитоз20. Хотя эта сумма незначительна, она может повлиять на результаты. Основываясь на этих выводах, применение LY к средам энтероидов AO обеспечивает элегантный и относительно простой способ количественного и качественного анализа проницаемости параклеточного кишечника в 3D-модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о какой-либо имущественной или коммерческой заинтересованности в каком-либо продукте, упомянутом или концепции, обсуждаемой в этой статье.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Эшли Нельсон из Медицинского центра Университета Рочестера за ее инструментальную помощь с нашей энтероидной моделью. Мы также хотели бы поблагодарить отделение детской хирургии Университета Оклахомы за поддержку этого проекта. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Оклахомским центром исследований стволовых клеток для взрослых и грантом Пресвитерианского фонда здоровья No 20180587 присужден департаменту хирургии в Центре медицинских наук Университета Оклахомы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
