Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה המשתמשת בצהוב לוציפר במודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט כדי לקבוע חדירות מעיים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע חדירות paracellular ב enteroids כי מודל מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית.
Abstract
אנטרואידים הם כלי מחקר מתפתח בחקר מחלות מעי דלקתיות כגון דלקת מעי נמקית (NEC). הם גדלים באופן מסורתי בקונפורמציה הבזולטרלית-החוצה (BO), שבה פני השטח האפיקליים של תא האפיתל פונים לומן הפנימי. במודל זה, הגישה למשטח הזוהר של אנטרוידים לצורך טיפול וניסויים היא מאתגרת, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. כדי לעקוף זאת, נוצר מודל ילודים (AO) לדלקת אנטרוקוליטיס נמקית. מאחר ששינויים בחדירות תאי אפיתל במעיים הם פתוגנומיים עבור NEC, פרוטוקול זה מתאר שימוש בלוציפר צהוב (LY) כסמן של חדירות על-תאית. LY חוצה את מחסום אפיתל המעי דרך כל שלושת המסלולים העל-תאיים העיקריים: נקבוביות, דליפה ובלתי מוגבלות. השימוש ב-LY במודל AO מאפשר מחקר רחב יותר של חדירות ב-NEC. לאחר אישור IRB והסכמת ההורים, נאספו דגימות כירורגיות של רקמת מעיים מילודים פגים אנושיים. תאי גזע מעיים נקטפו באמצעות בידוד קריפטה ושימשו לגידול אנטרואידים. אנטרואידים גודלו לבגרות ולאחר מכן הפכו AO או הושארו בקונפורמציה BO. אלה לא טופלו (בקרה) או טופלו בליפופוליסכריד (LPS) והיו נתונים לתנאים היפוקסיים להשראת NEC במבחנה . LY שימש להערכת חדירות. צביעה אימונופלואורסצנטית של החלבון האפיקלי זונולה occludens-1 והחלבון הבזולטרלי β-קטנין אישרה את קונפורמציית AO. גם אנטרואידים מסוג AO וגם BO שטופלו ב-LPS ובהיפוקסיה הדגימו חדירות על-תאית מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. גם אנטרואידים של AO וגם של BO הראו ספיגה מוגברת של LY לתוך לומן של האנטרואידים שטופלו בהשוואה לבקרים. השימוש ב-LY במודל אנטרואידי AO מאפשר לחקור את כל שלושת המסלולים העיקריים של חדירות על-תאית. זה גם מאפשר לחקור אינטראקציות פונדקאי-פתוגן וכיצד זה עשוי להשפיע על חדירות בהשוואה למודל אנטרואיד BO.
Introduction
אנטרואידים הם מבנים תלת-ממדיים (3D) שמקורם בתאי גזע אנושיים מוגבלים באיברים 1,2. הם מורכבים לחלוטין משושלת אפיתל ומכילים את כל סוגי תאי אפיתל המעי המובחנים2. אנטרואידים גם שומרים על קוטביות תאית המורכבת ממשטח לומינלי אפיקלי היוצר תא פנימי ומשטח בזולטרלי הפונה למדיה הסובבת. אנטרואידים הם מודל ייחודי בכך שהם משמרים את המאפיינים של המארח שממנו הם נוצרו3. לפיכך, אנטרוידים שנוצרו מתינוקות אנושיים פגים מייצגים מודל שימושי לחקר מחלות המשפיעות בעיקר על אוכלוסייה זו, כגון דלקת אנטרוקוליטיס נמקית (NEC).
המודל האנטרואידי המסורתי גדל בקונפורמציה בזולטרלית-החוצה (BO), שבה האנטרואיד עטוף בכיפה של מטריצת קרום מרתף (BMM). BMM משרה את האנטרואיד לשמור על מבנה תלת-ממדי עם המשטח הבזולטרלי מבחוץ. אנטרוידים BO הם מודל מתאים ל-NEC המגשר על הפער בין קווי תאים אנושיים ראשוניים דו-ממדיים (דו-ממדיים) לבין מודלים של חיות in vivo 2,4. NEC מושרה באנטרוואידים על ידי הצבת פתוגנים כגון LPS או חיידקים בתקשורת המקיפה את האנטרואידים, ולאחר מכן חשיפה לתנאים היפוקסיים 2,3. האתגר עם מודל ה-NEC האנטרואידי BO הוא שהוא אינו מאפשר מחקר יעיל של אינטראקציות פונדקאי-פתוגן, המתרחשות על פני השטח האפיקליים in vivo. שינויים בחדירות המעיים נובעים מאינטראקציות אלה בין המארח לפתוגן. כדי להבין טוב יותר כיצד חדירות משפיעה על הבסיס הפתופיזיולוגי של המחלה, יש ליצור מודל הכולל טיפול במשטח האפי.
Co et al. היו הראשונים שהדגימו כי ניתן לגרום לאנטרואידים בוגרים של BO ליצור קונפורמציה אפיקל-אאוט (AO) על ידי הסרת כיפות ה-BMM והחייאתן במדיה5. מאמר זה הראה כי אנטרואידים AO שמרו על קוטביות אפיתל נכונה, הכילו את כל סוגי תאי המעי, שמרו על מחסום אפיתל המעיים ואפשרו גישה למשטח האפיקלי5. שימוש באנטרואואידים AO כמודל NEC משיג שכפול פיזיולוגי של תהליך המחלה ומחקר של אינטראקציות פונדקאי-פתוגן.
אחד התורמים העיקריים לפתופיזיולוגיה של NEC הוא חדירות מעיים מוגברת6. מספר מולקולות הוצעו כדרך לבדוק חדירות מעיים במבחנה7. בין אלה, לוציפר צהוב (LY) הוא צבע הידרופילי עם עירור ופליטה פסגות ב 428 ננומטר ו 540 ננומטר, בהתאמה8. כאשר הוא חוצה את כל המסלולים העל-תאיים העיקריים, הוא שימש להערכת חדירות על-תאית ביישומים שונים, כולל מחסומי דם-מוח ואפיתל מעיים 8,9. היישום המסורתי של LY משתמש בתאים הגדלים במונו-שכבות על משטח חדיר למחצה10. LY מוחל על פני השטח האפיקליים וחוצה דרך חלבוני צומת הדוקים פארא-תאיים כדי להתכנס בצד הבזולטרלי. ריכוזי LY גבוהים יותר בתא הבזולטרלי מצביעים על ירידה בחלבוני צומת הדוקים עם פירוק מחסום תאי אפיתל במעיים לאחר מכן וחדירות מוגברת10. זה תואר גם במודלים אנטרואידים של 3D BO שבהם LY נוסף למדיה ואנטרוידים בודדים צולמו לקליטה של LY לתוך לומן11. למרות שזה מאפשר ניתוח איכותי באמצעות הדמיה של קליטת LY, ניתוח כמותי מוגבל. פרוטוקול זה מתווה טכניקה ייחודית המשתמשת ב- LY כדי להעריך חדירות פארא-תאית באמצעות מודל אנטרואיד NEC במבחנה באנטרואידים של AO תוך שמירה על כיוון תלת-ממדי. שיטה זו יכולה לשמש הן לניתוח איכותי והן כמותי של חדירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר הנוכחי בוצע בהתאם לאישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB, #11610, 11611) באוניברסיטת אוקלהומה. נדרשה הסכמת הורים לפני איסוף דגימות כירורגיות אנושיות בהתאם למפרטי IRB. לאחר אישור IRB והסכמת ההורים, רקמת המעי הדק האנושית התקבלה מתינוקות (גיל הריון מתוקן (GA) שנע בין 36-41 שבועות בזמן איסוף הדגימה, כולם עם היסטוריה של לידה מוקדמת ב- GA מוערך של 25-34 שבועות, 2:1 M:F) שעברו ניתוח ל- NEC או כריתת מעיים אחרת, כגון הסרת אוסטומיה או תיקון אטרזיה. אנטרואידים נוצרו מרקמה המתקבלת מהג'ג'ונום או מהאיליאום.
1. תרביות אנטרואידיות אנושיות שמקורן בתינוקות: בידוד קריפטה וציפוי מרקמה שלמה
- הכן מדיה תרבותית, מאגר chelating #1, ו chelating מאגר #2 (טבלה 1) בעקבות הדוח הקודם4. אחסנו מאגרי כלאט בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך 48 שעות.
- הכן את מדיית המיניגוט האנושית (טבלה 1). יש לאחסן את המלאי בטמפרטורה של 20°C- ולחמם אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
- הכן 50% מדיה מותנית L-WRN (CM) (טבלה 1). יש לאחסן את המלאי בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
הערה: בסיס L-WRN 100% עבור המדיה המותנית מתואר בפרוטוקול על ידי Miyoshi et al.12. - צור אנטרוידים מדגימות רקמת המעי הדק שהתקבלו מדגימות כירורגיות בעקבות הדו"ח הקודם4. צלחת ארבע בארות של אנטרואידים בצלחת 24 בארות מתוך 0.75-2.5 גרם חתיכת רקמת מעיים.
הערה: ניתן להפיק בהצלחה אנטרואידים מרקמה המאוחסנת במדיום 30 מ"ל מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בצינור חרוטי של 50 מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות. - מניחים את צלחת 24 הבאר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 הפוך למשך 15-20 דקות כדי לאפשר פילמור של כיפות BMM4.
- הוסף 500 μL של 50% L-WRN CM (כמתואר בשלב 1.3) עם 0.5 μL של Y-27632, מעכב ROCK (RI, ראה טבלת חומרים) לכל באר. לאחר 2-3 ימים, יש להחליף ב-50% L-WRN CM ללא RI.
2. דור של אנטרואידים AO
- לגדל אנטרואידים מוטבעים BMM במשך 7-10 ימים עם 50% L-WRNCM 4.
- הסר את המדיה והוסף 500 μL של פתרון שחזור תאים (CRS, ראה טבלת חומרים) לבאר אחת. מגרדים את הכיפה, מקטרים למעלה ולמטה מספר פעמים, ואז מוסיפים את תמיסת ה-CRS/enteroid/BMM לבאר הבאה.
- מגרדים את הכיפה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים, ומניחים את התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 500 μL של CRS לבאר השנייה, פיפטה למעלה ולמטה, ולאחר מכן להוסיף אותו לבאר הראשונה. העבר פתרון זה לאותו צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- חזור על שלב 2.3, איגום שתי בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד עד שכל תכולת הבאר תהיה ב- CRS.
הערה: ניתן לאגד יותר משתי בארות לצינור חרוטי אחד גדול יותר של 15 מ"ל אם מייצרים כמויות גדולות של אנטרואידי AO. שמירה על יחס CRS של 500 μL לבאר חשובה כדי להבטיח בדידות מלאה של BMM. - הניחו את צינורות המיקרוצנטריפוגה (שלב 2.3) עם תמיסת CRS/enteroid/BMM משולבת על מסובב למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לבודד את ה-BMM.
- צנטריפוגה של התמיסה ב 200 x גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר supernatant עם micropipette, משאיר את הכדור מאחור.
- יש להשעות את הכדור האנטרואידי ב-1 מ"ל של 50% L-WRN CM (כפי שהוכן בשלב 1.3) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. פיפטה עדינה של 500 μL של התמיסה האנטרואידית/מדיה התלויה מחדש לתוך כל באר של לוחות תרבית רקמה בעלי חיבור נמוך במיוחד של 24 בארות (ראו טבלת חומרים).
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 במשך 3 ימים לפני הניסוי.
3. אימות של קונפורמציה אנטרואידית AO באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה
- לאחר דגירה של האנטרוידים בהשעיית מדיה במשך 3 ימים, העמידו את מתלה האנטרואיד/מדיה מבאר אחת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה מתלה enteroid / מדיה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסירו את הסופר-נטנט בעזרת מיקרו-פיפט.
- להשעות את האנטרואידים ב 20 μL של BMM. מפזרים 10 μL של תרחיף אנטרואידי על מגלשת מיקרוסקופ ומורחים אותו בשכבה דקה כ-1 ס"מ על 1 ס"מ מרובע. חזור עם 10 μL הנותרים של מתלה אנטרואיד על חלק נפרד של אותה שקופית, כך שיהיו שתי מריחות של מתלה enteroid / BMM.
- אפשרו למריחות האנטרואיד/BMM להתמצק בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
- עובדים במכסה האדים, מניחים את המגלשה בצנצנת מכתיעה וממלאים ב-4% פרפורמלדהיד עד שהיא מכסה את מריחת האנטרואיד/BMM (~30 מ"ל לשקופית אחת אם משתמשים בצנצנת צביעה מזכוכית עם קיבולת של 10 שקופיות). יש להמתין 30 דקות (בטמפרטורת החדר) לקיבוע.
אזהרה: 4% פרפורמלדהיד מסוכנים ועלולים לגרום לנזק/גירוי בעיניים, גירוי בעור וסרטן. יש לעבוד תמיד תחת מכסה אדים בעת השימוש בו. יש ללבוש כפפות מגן וציוד מגן אישי בעת הטיפול בו. יש להשליך אותו במיכל מאושר לסילוק פסולת. - יש להשליך 4% פרפורמלדהיד במיכל פסולת מתאים. יש להוסיף 30 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS) לצנצנת המכתימה או עד ש-PBS יכסה את מריחות האנטרואיד/BMM. תן לזה לשבת במשך 3 דקות ב- RT, ולאחר מכן להשליך את PBS בבקבוק פסולת paraformaldehyde. חזור על שלב זה פעמיים נוספות לקבלת שלוש כביסות בסך הכל.
- מלאו צנצנת צביעה חדשה ב-30 מ"ל של 0.5% טריטון X-100 מדולל ב-PBS. הניחו את השקופית עם מריחות אנטרואיד/BMM בתמיסת טריטון ותנו לה לחלחל למשך 20 דקות ב-RT.
- השליכו את ה-0.5% טריטון X-100 המדולל ב-PBS. הוסיפו 30 מ"ל של PBS לצנצנת המכתימה ותנו לה לשבת במשך 3 דקות. בטל את ה- PBS על-ידי decanting.
- נגבו בעדינות את המגלשה סביב מריחות האנטרואיד/BMM, היזהרו שלא להפריע להן. באמצעות עט מחסום הידרופובי (עט PAP מחסום, ראו טבלת חומרים), ציירו עיגול סביב כל אחד מהמריחות האנטרואידיות/BMM. הכינו סרום של 20%, ספציפי לבעל החיים שבו הועלה הנוגדן המשני (ראו טבלת חומרים).
- הניחו את שקופית המיקרוסקופ שטוחה על ספסל המעבדה. חסום את השקופית למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס על-ידי הזרמת 100 μL של סרום ספציפי של 20% משלב 3.9 על כל אחד מהמריחות האנטרואידיות/BMM המוקפות בעט המחסום ההידרופובי.
- הכינו תמיסה של 100 μL עם דילולים של 1:100 ו-1:200 של נוגדנים ראשוניים β-קטנין ו-ZO-1, בהתאמה, מדוללים ב-PBS.
הערה: כל נוגדן ראשוני חייב להיות מבעל חיים אחר כדי להבטיח שיהיו לו תעלות אימונופלואורסצנטיות נפרדות כאשר הוא מצולם. המחקר הנוכחי משתמש בנוגדן β-קטנין של עכבר ובנוגדן ZO-1 של ארנב (ראו טבלת חומרים). - הקש על השקופית שעל השיש כדי להסיר את 20% הסרום ולנגב בעדינות יבשה, נזהר שלא לשבש את מריחות האנטרואיד / BMM. פיפטה 100 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית β-קטנין/ZO-1 על אחת ממריחות האנטרואיד/BMM. פיפטה 100 μL של PBS ללא נוגדן ראשוני על מריחת אנטרואיד/BMM אחרת כבקרה שלילית.
- מרפדים את תחתית מיכל הפלסטיק במגבת נייר רטובה ליצירת מיכל לחות. הניחו את המגלשה במיכל, היזהרו שלא לשבש תמיסות המכסות את מריחות האנטרואיד/BMM. מניחים את המכסה על המיכל לאיטום, ומאחסנים שטוח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
הערה: אין לאפשר לשקופית להתייבש. ודא כי המיכל סגור כדי למנוע ייבוש. - ברגע שאתה מוכן להמשיך, הקש על השקופית על הדלפק כדי להסיר נוגדנים ראשוניים ו- PBS מהמריחות האנטרואידיות / BMM.
- בצעו שלב שטיפה על ידי הנחת השקופית בצנצנת מכתימה ומילוי ב-30 מ"ל PBS או עד ש-PBS יכסה את מריחות האנטרואיד/BMM. תן לזה לשבת במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את ה-PBS וחזרו על שלב זה פעמיים נוספות ובסך הכל שלוש כביסות.
- הכינו 200 μL של נוגדנים משניים עבור שני ערוצים אימונופלואורסצנטיים שונים, כאשר לכל נוגדן יש דילול של 1:1000 ב-PBS (ראו טבלת חומרים). הרחק את התמיסה מאור.
- פיפטה 100 μL של תמיסת נוגדנים משנית על כל אחד מהמריחות האנטרואידיות/BMM. הניחו אותו בחושך ותנו לו לשבת שעה אחת ב-RT.
- הקש על השקופית שעל הדלפק כדי להסיר נוגדנים משניים. חזור על שלבי הכביסה המפורטים בשלב 3.15, וודא שכל השטיפות מבוצעות בחושך.
- הוסיפו טיפה של 4′,6-diamidino-2-phenylindole (פלואורושילד עם DAPI, ראו טבלת חומרים) מדיום הרכבה לכל אחד מהמריחות האנטרואידיות/BMM ומרחו כיסוי כדי להבטיח ששתי המריחות מכוסות כראוי. הימנעו מלכידת בועות מתחת לכיסוי. שמור את השקופית בחושך עד שתהיה מוכנה לצפייה מתחת למיקרוסקופ.
הערה: הדמיה מיידית של השקופיות מניבה את התוצאות האופטימליות ביותר; עם זאת, ניתן לאחסן שקופיות שטוחות במיכל לח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהצטלם עד שבוע לאחר הוספת DAPI.
4. אינדוקציה של NEC ניסיוני
- ודא כי אנטרואידי AO היו בהשעיה במשך 72 שעות לפחות לפני השימוש.
- העבירו בעדינות את כל מתלי האנטרואיד/מדיה מכל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
הערה: ניתן לאגד בארות מרובות לצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל אם מטפלים בכמות גדולה של בארות. מינימום של שלוש בארות לכל קבוצת טיפול מומלץ עבור פרוטוקול זה. - צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- הוסף 10 μL של 5 מ"ג/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS, ראה טבלת חומרים) ל-500 μL של 50% LWRN CM לכל באר (ריכוז סופי 100 מיקרוגרם / מ"ל LPS).
- השהה אנטרואידים AO המיועדים כקבוצת הטיפול ב- 50% LWRN + LPS ו- aliquot 500 μL של השעיה לצלחת חיבור נמוכה במיוחד של 24 בארות. השהה אנטרואידים של AO המוגדרים כבקרות לא מטופלות ב- 500 μL של 50% LWRN CM לכל באר. Aliquot 500 μL של מתלה זה לצלחת חיבור נפרדת 24 היטב נמוך במיוחד.
- השרה היפוקסיה באנטרואידי AO שטופלו ב-LPS באמצעות תא אינקובטור מודולרי (MIC) עם 1% O 2, 5% CO 2 ו-94% N 2 בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לטפל אנטרואידים עם היפוקסיה ו LPS במשך 24 שעות.
- מניחים את התרביות הלא מטופלות ו- LPS + היפוקסיה, עדיין בתא ה- MIC, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
5. מדידת חדירות פרא-תאית באמצעות LY
- העבירו בעדינות את מתלי האנטרואיד/מדיה מכל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. DPBS חם ו-50% LRWN CM באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה של מתלה אנטרואיד/מדיה ב-300 x גרם למשך 3 דקות ב-RT.
- הסר את המדיה. לשטוף את האנטרואידים עם חם 500 μL DPBS.
- צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 3 דקות ב-RT. הסירו את הסופר-נטנט בעזרת מיקרו-פיפט.
- חזור על שלבים 5.3-5.4 פעם נוספת בסך הכל פעמיים.
- לאחר הכביסה, יש להוסיף 450 מיקרוגרם של 50% LWRN CM חם (כפי שהוכן בשלב 1.3).
- יש להוסיף 50 מיקרוגרם של 2.5 מ"ג/מ"ל LY (הריכוז הסופי הוא 0.25 מיקרוגרם/מיקרול, ראו טבלת חומרים) לכל באר ולערבב בעדינות. מניחים בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך שעתיים.
- העבירו בעדינות את מתלי האנטרואיד/מדיה מכל באר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר את supernatant, משאיר את כדור enteroid מאחור.
- לשטוף את האנטרואידים עם 500 μL חם DPBS.
- צנטריפוגה ב 300 x g במשך 3 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר את supernatant משאיר את כדור enteroid מאחור.
- חזור על שלבים 5.10-5.11 שלוש פעמים נוספות בסך הכל ארבע כביסות.
- יש להשעות כל כדור עם 1,000 μL של DPBS קר ולבצע פיפטה נמרצת למעלה ולמטה כדי לנתק את האנטרואידים.
- הכן תקנים לעקומה הסטנדרטית של LY המדוללת ב-DPBS (100 נ"ג/מ"ל; 50 נ"ג/מ"ל; 25 נ"ג/מ"ל; 12.5 נ"ג/מ"ל; 6.25 נ"ג/מ"ל; 3.13 נ"ג/מ"ל; 1.57 נ"ג/מ"ל; 0 נ"ג/מ"ל).
- פיפטה 150 μL של כל דגימה לכל באר משולשת על צלחת 96 באר.
- מדוד את הפלואורסצנציה בשיא עירור של 428 ננומטר ואת שיא הפליטה של 536 ננומטר על קורא צלחות המסוגל לקרוא פלואורסצנטיות (ראו טבלת חומרים). באמצעות תוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים), חשב את הריכוזים על ידי אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית ושימוש בעקומה בת ארבעה פרמטרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קונפורמציה של AO
אנטרואידים המושהים ב-50% מדיית LWRN למשך 72 שעות מניחים קונפורמציה של AO (איור 1). זה אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית תוך שימוש ברכיבים שלמים אנטרואידיים של החלבון האפיקלי, זונולה occludens-1 (ZO-1), וחלבון בזולטרלי, β-קטנין (איור 1). אנטרואידים של AO מראים ZO-1 (בירוק) על המשטח החיצוני והאפיקלי של האנטרואיד, בעוד ש-β-קטנין (אדום) נמצא על המשטח הפנימי והבזולטרלי (איור 1A). אנטרואידי BO מדגימים את ההופכי עם β-קטנין (אדום) על המשטח החיצוני ו-ZO-1 (ירוק) על המשטח הפנימי והזוהר (איור 1B). תוצאות אלה מראות את היפוך הקוטביות הצפוי כדי לאשר שהאנטרוידים הם AO לפני הניסוי.
תוצאות בדיקת LY
חדירות מוגברת, המודגמת על ידי ספיגה מוגברת של צבע LY לתוך לומן enteroid, צפוי NEC6. אנטרואידי BO שטופלו ב-LPS ובהיפוקסיה הראו חדירות מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לבקרות שלא טופלו באמצעות הטכניקה המתוארת בפרוטוקול זה (איור 2A, **p = 0.005). זה מסכים עם הספרות שתיארה חדירות מוגברת במודלים אנטרואידים BO של NEC 4,13. באופן דומה, אנטרואידים AO שטופלו ב-LPS ובהיפוקסיה הדגימו גם הם חדירות מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לבקרות שלא טופלו, כצפוי במודל NEC (איור 3A, *p = 0.02). אנטרואידים של AO שטופלו הראו ספיגה מוגברת של LY בלומן של אנטרוידים מטופלים (איור 3C) בהשוואה לבקרות שלא טופלו (איור 3B). זה דומה למה שרואים באנטרואידים של BO, שם LY מדמיינים לומן אנטרואידי (איור 2B). ספיגה מוגברת של צבע LY בלומן של האנטרואיד גורמת לפלואורסצנטיות מוגברת באנטרוידים מטופלים, מה שמאפשר ניתוח כמותי באמצעות קורא מיקרו-פלטות המשתמש באנטרואידי AO מבארות שונות (איור 3A). זה מדגים כי טכניקה זו, באמצעות LY, ניתן להשתמש כדי להעריך חדירות אנטרוידים 3D. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות תוכנה סטטיסטית המסוגלת לבצע אינטרפולציה של עקומה סטנדרטית כדי לקבוע את ריכוזי ה- LY של קבוצות הטיפול. מבחן t של תלמיד, כפי שמוצג באיור 2 ובאיור 3, יכול לשמש כדי לקבוע את המשמעות בין קבוצות.
איור 1: אימות של קונפורמציית AO. (A) אנטרואיד אפיקלי-אאוט (AO) מראה קוטביות הפוכה בהשוואה ל-(B) אנטרואיד בזולטרלי החוצה (BO) מראה קוטביות מסורתית בהגדלה של פי 20, סרגל קנה מידה מוגדר ל-100 מיקרומטר. DAPI, כחול; בטא-קטנין (חלבון בזולטרלי), אדום; זונולה occludens-1 (חלבון אפיקלי), ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חדירות מוגברת במודל אנטרואידי BO לאחר אינדוקציה של NEC במבחנה , כפי שנמדד על-ידי בדיקת LY. (A) ל-LPS ולאנטרואידים בזולטריים שטופלו בהיפוקסיה יש חדירות מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לבקרות שלא טופלו באמצעות בדיקה צהובה של לוציפר; קווי שגיאה מציגים את שגיאת התקן של הממוצע; **p = 0.005. (B) תמונה של אנטרוידים בזולטרליים עם צהוב לוציפר שהודגמו בלומן לאחר טיפול במדיה עם צבע צהוב לוציפר בהגדלה של פי 10, סרגל בקנה מידה של 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: חדירות מוגברת במודל אנטרואיד של AO לאחר אינדוקציה של NEC במבחנה , כפי שנמדדה על-ידי בדיקת LY. (A) ל-LPS ולאנטרואידים אפיקליים שטופלו בהיפוקסיה יש חדירות מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לבקרות שלא טופלו באמצעות הבדיקה הצהובה של לוציפר; קווי שגיאה מציגים את שגיאת התקן של הממוצע; *p = 0.02. (B) תמונה מייצגת של אנטרואיד אפיקל-אאוט (AO) לא מטופל ב-10x; סרגל קנה המידה מוגדר ל-100 מיקרומטר. (C) תמונה מייצגת של אנטרואיד AO מטופל ב-LPS ובהיפוקסיה עם LY מוצגת בלומן ב-10x; סרגל קנה המידה מוגדר ל- 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: הרכב התמיסות, המאגרים והמדיה ששימשו במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חדירות המעי מורכבת ומשקפת את תפקוד מחסום האפיתל. מחסום המעי מורכב משכבה אחת של תאי אפיתל המתווכת הובלה טרנס-תאית ופארא-תאית14. חדירות פארא-תאית מסתמכת על חלבוני צומת הדוקים האוטמים את החלל שבין תאי אפיתל14. בתוך ההובלה העל-תאית הזו, ישנם שלושה מסלולים נפרדים שבאמצעותם מולקולות יכולות לחצות: נקבוביות, דליפהו-15 בלתי מוגבלות. מסלול הנקבוביות מאפשר חדירות ליונים טעונים קטנים, בעוד שמסלול הדליפה מאפשר חדירות למולקולות גדולות יותר ולא טעונות על פני15. המסלול השלישי, הבלתי מוגבל, משקף חדירות משנית לנזק אפיתל או למוות16. למרות שמולקולות רבות משמשות להערכת חדירות על-תאית, סוג וגודל המולקולה משפיעים על מסלול החדירות שייחקר.
כמולקולה הידרופילית קטנה, LY יכולה לעבור דרך כל שלושת המסלולים העל-תאיים, מה שהופך אותה לכלי אופטימלי לחקר חדירות על-תאית. לעומת זאת, 4 kDa FITC-dextran, מולקולת סוכר המשמשת כסמן לחדירות על-תאית, יכולה רק לחצות את הדליפה ואת המסלולים הבלתי מוגבלים. ה-FITC-dextran הגדול יותר, 70 kDa, מוגבל רק למסלול הבלתי מוגבל. שיטה נוספת לקביעת חדירות פארא-תאית היא באמצעות מדידות התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TEER), המודדות התנגדות חשמלית על פני חד-שכבתיים. שיטה זו מודדת רק את מסלול הנקבוביות17. לפיכך, LY מספק תובנה רבה יותר לגבי החדירות העל-תאית הכוללת על-ידי התמקדות בכל שלושת המסלולים. פרוטוקול זה מנצל זאת על ידי שימוש ב-LY כדי לחקור חדירות על-תאית.
המודל האנטרואידי נבחר בפרוטוקול זה מכיוון שהוא מחקה באופן הדוק יותר את תנאי ה-in vivo על ידי יצירת מיני-מעי תלת-ממדי למחקר. עם זאת, האתגר במודל האנטרואיד המסורתי של BO הוא כיצד לגשת למשטח האפיקלי כדי לחקור אינטראקציות בין מארח לפתוגן ואת שינויי החדירות שלאחר מכן. המודל האנטרואידי של AO מתגבר על אתגר זה על ידי היפוך הקוטביות שבה המשטח האפיקלי נמצא במגע עם המדיה הסובבת. תוארו מספר שיטות חלופיות לגישה לפני השטח האפיקליים של אנטרואידים. אלה כוללים מערכות שבבי מעיים, מיקרו-הזרקה, פיצול ואנטרואידים גדליםב-monolayers 18,19. ההתקדמות במערכות שבבי המעיים אפשרה להתרבות של אורגנואידים ותאי אנדותל יחד בהקשר של כלי דם ופריסטלטיקה לחקות את סביבת המעיים18. מיקרו הזרקה כוללת את ההזרקה לתוך לומן אנטרואיד BO באמצעות שימוש בציוד מיוחד כגון מיקרומניפולטור ומיקרו-אינז'קטור19. הפיצול משתמש בדיסוציאציה של אנטרואידים לתאים בודדים אשר לאחר מכן מודגרים במדיה עם הפתוגן לפני רפורמה במבנה תלת-ממדי19. הטרנספורמציה של אנטרואידים למונו-שכבות דו-ממדיות עם טיפול מאוחר יותר במשטח האפיקלי תוארה גםהיא 19. מודל AO enteroid נותן מענה לחלק מהקשיים של מודלים אלה על ידי מתן דרך פשוטה ויעילה לחשוף את פני השטח apical ללא צורך בציוד יקר או לפגוע בשלמות המבנית של האנטרואיד.
למרות שהשימוש ב-LY במודל AO מאפשר מחקר רחב של חדירות על-תאית משנית לאינטראקציות בין מארח לפתוגן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם אנטרואידים של BO, כמו גם FITC-dextran במקום LY. שני שינויים מרכזיים בפרוטוקול זה נדרשים כדי לשנות אותו כך שישמש עבור אנטרואידים של BO. ראשית, ניתן לשמור על אנטרואידי BO בכיפות BMM עבור כל שלבי השטיפה לפני ואחרי הוספת LY. חשוב להשתמש בתמיסות המחוממות ל-37 מעלות צלזיוס עבור שלבי שטיפה אלה כדי למנוע סיכה של כיפת ה-BMM. שנית, יש לשבש את כיפת ה- BMM באמצעות DPBS קר ולגרד את הבאר עם קצה פיפטה לאחר השלמת כל שלבי השטיפה על מנת לאפשר חידוש מלא של האנטרוידים המנותקים ו- LY. אם FITC-dextran מוחלף ב-LY, מומלץ להשתמש במולקולת 4 kDa כשהיא חוצה שניים מתוך שלושת המסלולים העל-תאיים.
השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים הבטחת שטיפות נאותות כדי להסיר כל עקבות LY מהתמיסה מחוץ לאנטרואיד. חשוב גם לשטוף בעדינות את האנטרואידים כדי למנוע דיסוציאציה ושחרור פוטנציאלי של LY מהלומן לתמיסה שמסביב עד שיהיה מוכן לכמותית באמצעות קורא microplate. שימוש בתמיסות מחוממות במהלך שלבי הכביסה גם מפחית את הלחץ על האנטרואידים. אם נעשה שימוש בתמיסות קרות, אנטרוידים עלולים לעבור אפופטוזיס, מה שמוביל לתוצאות לא מדויקות.
המגבלות של שיטה זו כוללות את חוסר היכולת להפיץ אנטרואידים של AO וזמני גידול ארוכים יותר בגלל 72 השעות הנוספות הנדרשות כדי להפוך את הקוטביות. יש גם ירידה של 2%-5% במספר ה-AO אנטרואיד המטופל בהשוואה לבקרים. למרות שזה זניח בסך הכל, זה עלול להוביל להערכת חסר של התוצאות. המגבלות של שימוש ב-LY דומות למולקולות חדירות אחרות, כגון 4 kDa FITC-dextran, שבהן כמויות זעירות יכולות לחצות את מחסום אפיתל המעי באמצעות טרנסציטוזה20. למרות סכום זה הוא זניח, זה עשוי להשפיע על התוצאות. בהתבסס על ממצאים אלה, החלת LY על המדיה של אנטרואידים AO מספקת דרך אלגנטית ופשוטה יחסית לנתח באופן כמותי ואיכותי חדירות מעיים פרא-תאיים במודל תלת-ממדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על שום עניין קנייני או מסחרי בשום מוצר או מושג המוזכר במאמר זה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לאשלי נלסון מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר על עזרתה האינסטרומנטלית במודל האנטרואיד שלנו. ברצוננו להודות גם למחלקה לכירורגיית ילדים באוניברסיטת אוקלהומה על תמיכתם בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות [NIH Grant R03 DK117216-01A1], מרכז אוקלהומה לחקר תאי גזע בוגרים, ומענק קרן הבריאות הפרסביטריאנית #20180587 שהוענק למחלקה לכירורגיה במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
