Summary
Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.
Abstract
Gli enteroidi sono uno strumento di ricerca emergente nello studio delle malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante (NEC). Sono tradizionalmente coltivati nella conformazione basolaterale-out (BO), dove la superficie apicale della cellula epiteliale è rivolta verso il lume interno. In questo modello, l'accesso alla superficie luminale degli enteroidi per il trattamento e la sperimentazione è impegnativo, il che limita la capacità di studiare le interazioni ospite-patogeno. Per aggirare questo, è stato creato un modello apical-out (AO) neonatale per l'enterocolite necrotizzante. Poiché i cambiamenti di permeabilità delle cellule epiteliali intestinali sono patognomonici per NEC, questo protocollo delinea l'uso del giallo lucifero (LY) come marker di permeabilità paracellulare. LY attraversa la barriera epiteliale intestinale attraverso tutte e tre le principali vie paracellulari: poro, perdita e senza restrizioni. L'utilizzo di LY in un modello AO consente uno studio più ampio della permeabilità in NEC. Dopo l'approvazione dell'IRB e il consenso dei genitori, sono stati raccolti campioni chirurgici di tessuto intestinale da neonati pretermine umani. Le cellule staminali intestinali sono state raccolte tramite isolamento della cripta e utilizzate per far crescere enteroidi. Gli enteroidi sono stati coltivati fino alla maturità e poi trasformati AO o lasciati in conformazione BO. Questi non sono stati trattati (controllo) o sono stati trattati con lipopolisaccaride (LPS) e sottoposti a condizioni ipossiche per l'induzione di NEC in vitro . LY è stato utilizzato per valutare la permeabilità. La colorazione immunofluorescente della proteina apicale zonula occludens-1 e della proteina basolaterale β-catenina ha confermato la conformazione AO. Sia gli enteroidi AO che BO trattati con LPS e ipossia hanno dimostrato un aumento significativo della permeabilità paracellulare rispetto ai controlli. Entrambi gli enteroidi AO e BO hanno mostrato un maggiore assorbimento di LY nel lume degli enteroidi trattati rispetto ai controlli. L'utilizzo di LY in un modello enteroide AO consente lo studio di tutte e tre le principali vie di permeabilità paracellulare. Consente inoltre lo studio delle interazioni ospite-patogeno e di come ciò possa influenzare la permeabilità rispetto al modello enteroide BO.
Introduction
Gli enteroidi sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali intestinali umane limitate all'organo 1,2. Sono costituiti interamente da linee epiteliali e contengono tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali differenziate2. Gli enteroidi mantengono anche la polarità cellulare costituita da una superficie luminale apicale che forma un compartimento interno e una superficie basolaterale rivolta verso il mezzo circostante. Gli enteroidi sono un modello unico in quanto preservano le caratteristiche dell'ospite da cui sono stati generati3. Pertanto, gli enteroidi generati da neonati umani prematuri rappresentano un modello utile per studiare le malattie che colpiscono principalmente questa popolazione, come l'enterocolite necrotizzante (NEC).
Il modello enteroide tradizionale viene coltivato in una conformazione basolaterale-out (BO), dove l'enteroide è racchiuso in una cupola di matrice di membrana basale (BMM). BMM induce l'enteroide a mantenere una struttura 3D con la superficie basolaterale all'esterno. Gli enteroidi BO sono un modello adatto per NEC che colma il divario tra le linee cellulari umane primarie bidimensionali (2D) e i modelli animali in vivo 2,4. NEC è indotta negli enteroidi inserendo agenti patogeni come LPS o batteri nei mezzi che circondano gli enteroidi, seguita dall'esposizione a condizioni ipossiche 2,3. La sfida con il modello NEC enteroide BO è che non consente lo studio efficace delle interazioni ospite-patogeno, che si verificano sulla superficie apicale in vivo. I cambiamenti nella permeabilità intestinale sono dovuti a queste interazioni ospite-patogeno. Per comprendere meglio come la permeabilità influisce sulle basi fisiopatologiche della malattia, è necessario creare un modello che preveda il trattamento della superficie apicale.
Co et al. sono stati i primi a dimostrare che gli enteroidi BO maturi possono essere indotti a formare una conformazione apical-out (AO) rimuovendo le cupole BMM e risospendendole in media5. Questo articolo ha dimostrato che gli enteroidi AO mantenevano la corretta polarità epiteliale, contenevano tutti i tipi di cellule intestinali, sostenevano la barriera epiteliale intestinale e consentivano l'accesso alla superficie apicale5. L'utilizzo di enteroidi AO come modello NEC consente di ottenere una riproduzione fisiologica del processo patologico e lo studio delle interazioni ospite-patogeno.
Uno dei principali contributi alla fisiopatologia della NEC è l'aumento della permeabilità intestinale6. Diverse molecole sono state proposte come un modo per testare la permeabilità intestinale in vitro7. Tra questi, il giallo lucifero (LY) è un colorante idrofilo con picchi di eccitazione ed emissione a 428 nm e 540 nm, rispettivamente8. Mentre attraversa tutte le principali vie paracellulari, è stato utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare in varie applicazioni, tra cui le barriere epiteliali emato-encefaliche e intestinali 8,9. L'applicazione tradizionale di LY utilizza cellule coltivate in monostrati su una superficie semipermeabile10. LY viene applicato sulla superficie apicale e attraversa attraverso proteine paracellulari a giunzione stretta per riunirsi sul lato basolaterale. Concentrazioni più elevate di LY nel compartimento basolaterale indicano una diminuzione delle proteine a giunzione stretta con conseguente rottura della barriera cellulare epiteliale intestinale e aumento della permeabilità10. È stato anche descritto in modelli enteroidi BO 3D in cui LY è stato aggiunto al supporto e singoli enteroidi sono stati ripresi per l'assorbimento di LY nel lume11. Sebbene ciò consenta l'analisi qualitativa tramite la visualizzazione dell'assorbimento di LY, l'analisi quantitativa è limitata. Questo protocollo delinea una tecnica unica che utilizza LY per valutare la permeabilità paracellulare utilizzando un modello enteroide NEC in vitro in enteroidi AO mantenendo l'orientamento 3D. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi sia qualitativa che quantitativa della permeabilità.
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Protocol
La presente ricerca è stata eseguita in conformità con l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB, # 11610, 11611) presso l'Università dell'Oklahoma. Il consenso dei genitori era richiesto prima di raccogliere campioni chirurgici umani secondo le specifiche IRB. A seguito dell'approvazione dell'IRB e del consenso dei genitori, il tessuto intestinale tenue umano è stato ottenuto da neonati (età gestazionale corretta (GA) compresa tra 36 e 41 settimane al momento della raccolta del campione, tutti con una storia di parto pretermine a un GA stimato di 25-34 settimane, 2: 1 M: F) sottoposti a intervento chirurgico per NEC o altra resezione intestinale, come la rimozione della stomia o la riparazione dell'atresia. Gli enteroidi sono stati generati da tessuto ottenuto dal digiuno o dall'ileo.
1. Colture enteroidi di derivazione infantile umana: isolamento della cripta e placcatura da tessuto intero
- Preparare terreni di coltura, tampone chelante #1 e tampone chelante #2 (Tabella 1) seguendo il rapporto precedente4. Conservare i tamponi chelanti a 4 °C e utilizzarli entro 48 ore.
- Preparare i terreni minigut umani (Tabella 1). Conservare il brodo a -20 °C e riscaldarlo a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
- Preparare il 50% di mezzi condizionati con L-WRN (CM) (Tabella 1). Conservare il brodo a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
NOTA: La base L-WRN al 100% per i mezzi condizionati è descritta in un protocollo di Miyoshi et al.12. - Generare enteroidi da piccoli campioni di tessuto intestinale ottenuti da campioni chirurgici seguendo il precedente rapporto4. Piastra quattro pozzetti di enteroidi in una piastra a 24 pozzetti da un pezzo di tessuto intestinale da 0,75-2,5 g.
NOTA: Gli enteroidi possono essere generati con successo dal tessuto immagazzinato in 30 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 terreno in un tubo conico da 50 mL a 4 °C per un massimo di 48 ore. - Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 capovolto per 15-20 minuti per consentire la polimerizzazione delle cupole BMM4.
- Aggiungere 500 μL di 50% di L-WRN CM (come descritto al punto 1.3) con 0,5 μL di Y-27632, inibitore di ROCK (RI, vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto. Dopo 2-3 giorni, sostituire con il 50% L-WRN CM senza RI.
2. Generazione di enteroidi AO
- Coltiva enteroidi incorporati in BMM per 7-10 giorni con il 50% di L-WRN CM4.
- Rimuovere il supporto e aggiungere 500 μL di soluzione di recupero cellulare (CRS, vedere Tabella dei materiali) in un pozzetto. Raschiare la cupola, pipettare su e giù più volte, quindi aggiungere la soluzione CRS / enteroide / BMM al pozzetto successivo.
- Raschiare la cupola, pipettare su e giù più volte e posizionare la soluzione in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 500 μL di CRS al secondo pozzetto, pipettare su e giù, quindi aggiungerlo al primo pozzetto. Trasferire questa soluzione nella stessa provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Ripetere il passaggio 2.3, raggruppando due pozzetti in un tubo di microcentrifuga fino a quando tutto il contenuto del pozzetto è in CRS.
NOTA: Più di due pozzetti possono essere raggruppati in un tubo conico più grande da 15 mL se si generano grandi volumi di enteroidi AO. Mantenere un rapporto CRS per pozzo di 500 μL è importante per garantire la completa solubilizzazione del BMM. - Porre le provette della microcentrifuga (fase 2.3) con soluzione CRS/enteroide/BMM aggregata su un rotatore per 1 ora a 4 °C per solubilizzare il BMM.
- Centrifugare la soluzione a 200 x g per 3 minuti a 4°C, quindi rimuovere il surnatante con una micropipetta, lasciando il pellet.
- Risospendere il pellet enteroide in 1 mL di 50% L-WRN CM (come preparato al punto 1.3) per provetta da microcentrifuga. Pipettare delicatamente 500 μL della soluzione enteroide/media risospesa in ciascun pozzetto delle piastre di coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco (vedere Tabella dei materiali).
- Incubare a 37 °C con 5% di CO2 per 3 giorni prima della sperimentazione.
3. Verifica della conformazione enteroide di AO mediante colorazione immunofluorescente a montaggio intero
- Dopo l'incubazione degli enteroidi in sospensione di mezzo per 3 giorni, pipettare la sospensione enteroide/media da un pozzetto in una provetta per microcentrifuga.
- Centrifugare la sospensione enteroide/media a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante con una micropipetta.
- Risospendere gli enteroidi in 20 μL di BMM. Pipettare 10 μL di sospensione enteroide su un vetrino da microscopio e stenderlo in uno strato sottile di circa 1 cm per 1 cm quadrato. Ripetere con i restanti 10 μL di sospensione enteroide su una parte separata dello stesso vetrino in modo che ci siano due strisci di sospensione enteroide / BMM.
- Lasciare che gli strisci enteroidi / BMM si solidifichino a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
- Lavorando nella cappa aspirante, posizionare il vetrino in un barattolo colorante e riempire con paraformaldeide al 4% fino a coprire lo striscio enteroide / BMM (~ 30 ml per un vetrino se si utilizza un barattolo di colorazione di vetro con capacità di 10 vetrini). Lasciare 30 minuti (a temperatura ambiente) per la fissazione.
ATTENZIONE: la paraformaldeide al 4% è pericolosa e può causare danni agli occhi / irritazione, irritazione della pelle e cancro. Lavorare sempre sotto una cappa aspirante quando lo si utilizza. Indossare guanti protettivi e dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione. Smaltirlo in un contenitore approvato per lo smaltimento dei rifiuti. - Gettare il 4% di paraformaldeide in un contenitore per rifiuti appropriato. Aggiungere 30 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al barattolo colorante o fino a quando PBS copre gli strisci enteroidi / BMM. Lasciare riposare per 3 minuti a RT, quindi scartare il PBS nella bottiglia di scarto della paraformaldeide. Ripetere questo passaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.
- Riempire un nuovo barattolo di colorazione con 30 ml di Triton X-100 allo 0,5% diluito in PBS. Posizionare il vetrino con strisci enteroidi / BMM nella soluzione Triton e lasciarlo permeabilizzare per 20 minuti a RT.
- Scartare il Triton X-100 allo 0,5% diluito in PBS. Aggiungere 30 ml di PBS al barattolo colorante e lasciare riposare per 3 minuti. Scartare il PBS decantando.
- Pulire delicatamente il vetrino attorno agli strisci enteroidi / BMM, facendo attenzione a non interromperli. Utilizzando una penna barriera idrofobica (penna barriera PAP, vedere Tabella dei materiali), disegnare un cerchio attorno a ciascuno degli strisci enteroidi / BMM. Fare un siero al 20%, specifico per l'animale in cui è stato allevato l'anticorpo secondario (vedi Tabella dei materiali).
- Appoggiare il vetrino del microscopio sul banco da laboratorio. Bloccare il vetrino per 1 ora a 4 °C pipettando 100 μL di siero specifico al 20% dal punto 3.9 su ciascuno degli strisci enteroidi/BMM circondati dalla penna barriera idrofobica.
- Preparare una soluzione da 100 μL con diluizioni 1:100 e 1:200 di anticorpi primari β-catenina e ZO-1, rispettivamente, diluiti in PBS.
NOTA: Ogni anticorpo primario deve provenire da un animale diverso per garantire che abbiano canali immunofluorescenti distinti quando vengono sottoposti a ripresa. Il presente studio utilizza un anticorpo β-catenina di topo e un anticorpo ZO-1 di coniglio (vedi Tabella dei materiali). - Picchiettare il vetrino sul bancone per rimuovere il siero al 20% e asciugare delicatamente, facendo attenzione a non interrompere gli strisci enteroidi / BMM. Pipettare 100 μL di soluzione anticorpale primaria di β-catenina/ZO-1 su uno degli strisci enteroid/BMM. Pipettare 100 μL di PBS senza anticorpi primari sull'altro striscio enteroide/BMM come controllo negativo.
- Foderare il fondo di un contenitore di plastica con un tovagliolo di carta bagnato per creare un contenitore umidificato. Posizionare il vetrino nel contenitore, facendo attenzione a non interrompere le soluzioni che coprono gli strisci enteroidi / BMM. Posizionare il coperchio sul contenitore per sigillare e conservare in piano a 4 °C per una notte.
NOTA: non lasciare asciugare il vetrino. Assicurarsi che il contenitore sia chiuso per evitare l'essiccazione. - Una volta pronto per procedere, toccare il vetrino sul contatore per rimuovere gli anticorpi primari e il PBS dagli strisci enteroidi / BMM.
- Eseguire una fase di lavaggio posizionando il vetrino in un barattolo colorante e riempiendo con 30 ml di PBS o fino a quando PBS copre gli strisci enteroidi / BMM. Lasciare riposare per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PBS e ripetere questo passaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.
- Preparare 200 μL di anticorpi secondari per due diversi canali immunofluorescenti, con ogni anticorpo con una diluizione 1:1000 in PBS (vedere Tabella dei materiali). Tenere la soluzione al riparo dalla luce.
- Pipettare 100 μL di soluzione anticorpale secondaria su ciascuno degli strisci enteroidi/BMM. Mettilo al buio e lascialo riposare per 1 ora a RT.
- Tocca la diapositiva sul contatore per rimuovere gli anticorpi secondari. Ripetere i passaggi di lavaggio descritti al punto 3.15, assicurandosi che tutti i lavaggi vengano eseguiti al buio.
- Aggiungere una goccia di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (Fluoroshield con DAPI, vedere la tabella dei materiali) mezzo di montaggio a ciascuno degli strisci enteroidi / BMM e applicare un vetrino di copertura per garantire che entrambi gli strisci siano adeguatamente coperti. Evitare di intrappolare le bolle sotto il coprifoglio. Tenere il vetrino al buio fino al momento della visualizzazione al microscopio.
NOTA: l'imaging immediato delle diapositive produce i risultati ottimali; tuttavia, i vetrini possono essere conservati in un contenitore umidificato a 4 °C e ripresi fino a 1 settimana dopo l'aggiunta di DAPI.
4. Induzione di NEC sperimentali
- Assicurarsi che gli enteroidi AO siano stati in sospensione per almeno 72 ore prima dell'uso.
- Pipettare delicatamente tutta la sospensione enteroide / media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga.
NOTA: più pozzetti possono essere raggruppati in un tubo conico da 15 ml se viene trattato un grande volume di pozzetti. Per questo protocollo si raccomanda un minimo di tre pozzetti per gruppo di trattamento. - Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 10 μL di 5 mg/ml di lipopolisaccaride (LPS, vedere Tabella dei materiali) a 500 μL di 50% di LWRN CM per pozzetto (concentrazione finale 100 μg/mL LPS).
- Risospendere gli enteroidi AO designati come gruppo di trattamento in 50% LWRN + LPS e aliquota 500 μL di sospensione su una piastra di attacco ultra-bassa a 24 pozzetti. Risospendere gli enteroidi AO designati come controlli non trattati in 500 μL di 50% di LWRN CM per pozzetto. Aliquot 500 μL di questa sospensione su una piastra di attacco ultrabassa separata a 24 pozzetti.
- Indurre ipossia negli enteroidi AO trattati con LPS tramite una camera di incubazione modulare (MIC) con 1% O 2, 5% CO 2 e 94% N 2 secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Trattare gli enteroidi con ipossia e LPS per 24 ore.
- Posizionare le colture non trattate e trattate con LPS + ipossia, ancora nella camera MIC, in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
5. Misura della permeabilità paracellulare utilizzando LY
- Pipettare delicatamente la sospensione enteroide/media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga. DPBS caldo e 50% LRWN CM in bagnomaria a 37 °C.
- Centrifugare la sospensione enteroide/media a 300 x g per 3 minuti a RT.
- Rimuovere il supporto. Lavare gli enteroidi con DPBS caldo da 500 μL.
- Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante con una micropipetta.
- Ripetere i passaggi 5.3-5.4 ancora una volta per un totale di due volte.
- Dopo il lavaggio, aggiungere 450 μL di LWRN CM caldo al 50% (come preparato al punto 1.3).
- Aggiungere 50 μL di 2,5 mg/mL LY (la concentrazione finale è 0,25 μg/μL, vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e ruotare delicatamente per mescolare. Collocare in un incubatore a 37 °C, 5% CO 2 per2 ore.
- Pipettare delicatamente la sospensione enteroide/media da ciascun pozzetto in un tubo di microcentrifuga.
- Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT, quindi rimuovere il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet enteroide.
- Lavare gli enteroidi con 500 μL di DPBS caldo.
- Centrifugare a 300 x g per 3 minuti a RT, quindi rimuovere il surnatante lasciando dietro di sé il pellet enteroide.
- Ripetere i passaggi 5.10-5.11 altre tre volte per un totale di quattro lavaggi.
- Risospendere ogni pellet con 1.000 μL di DPBS freddo e pipettare vigorosamente su e giù per dissociare gli enteroidi.
- Preparare gli standard per la curva standard LY diluita in DPBS (100 ng/mL; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).
- Pipettare 150 μL di ciascun campione per pozzetto in triplice copia su una piastra da 96 pozzetti.
- Misurare la fluorescenza ad un picco di eccitazione di 428 nm e un picco di emissione di 536 nm su un lettore di piastre in grado di leggere la fluorescenza (vedi Tabella dei materiali). Utilizzando un software statistico (vedi Tabella dei materiali), calcolare le concentrazioni interpolando la curva standard e utilizzando una curva a quattro parametri.
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Representative Results
Conformazione AO
Gli enteroidi sospesi in mezzi LWRN al 50% per 72 ore assumono una conformazione AO (Figura 1). Ciò è stato confermato tramite colorazione immunofluorescente utilizzando supporti interi enteroidi della proteina apicale, zonula occludens-1 (ZO-1), e della proteina basolaterale, β-catenina (Figura 1). Gli enteroidi AO mostrano ZO-1 (verde) sulla superficie apicale esterna dell'enteroide, mentre la β-catenina (rossa) si trova sulla superficie interna basolaterale (Figura 1A). Gli enteroidi BO dimostrano l'inverso con β-catenina (rosso) sulla superficie esterna e ZO-1 (verde) sulla superficie luminale interna (Figura 1B). Questi risultati mostrano l'inversione di polarità prevista per confermare che gli enteroidi sono AO prima della sperimentazione.
Risultati del test LY
Un aumento della permeabilità, dimostrato dall'aumento dell'assorbimento del colorante LY nel lume enteroide, è atteso nel NEC6. Gli enteroidi BO trattati con LPS e ipossia hanno mostrato una permeabilità significativamente aumentata rispetto ai controlli non trattati utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo (Figura 2A, **p = 0,005). Ciò concorda con la letteratura che ha descritto l'aumento della permeabilità nei modelli enteroidi BO di NEC 4,13. Allo stesso modo, anche gli enteroidi AO trattati con LPS e ipossia hanno dimostrato una permeabilità significativamente aumentata rispetto ai controlli non trattati, come previsto in un modello NEC (Figura 3A, *p = 0,02). Gli enteroidi AO trattati hanno mostrato un aumento dell'assorbimento di LY nel lume degli enteroidi trattati (Figura 3C) rispetto ai controlli non trattati (Figura 3B). Questo è simile a quello che si vede negli enteroidi BO, dove LY è visualizzato nel lume enteroide (Figura 2B). L'aumento dell'assorbimento del colorante LY nel lume dell'enteroide si traduce in un aumento della fluorescenza negli enteroidi trattati, consentendo l'analisi quantitativa tramite un lettore di micropiastre che utilizza enteroidi AO da diversi pozzetti (Figura 3A). Ciò dimostra che questa tecnica, utilizzando LY, può essere utilizzata per valutare la permeabilità negli enteroidi 3D. I risultati possono essere analizzati utilizzando un software statistico in grado di interpolare una curva standard per determinare le concentrazioni di LY dei gruppi di trattamento. Il test t di uno studente, come mostrato in Figura 2 e Figura 3, può essere utilizzato per determinare il significato tra i gruppi.
Figura 1: Verifica della conformazione AO. (A) Enteroide apical-out (AO) che mostra polarità inversa rispetto a (B) enteroide basolaterale out (BO) che mostra polarità tradizionale con ingrandimento 20x, barra di scala impostata a 100 μm. DAPI, blu; beta-catenina (proteina basolaterale), rosso; Zonula occludens-1 (proteina apicale), verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Aumento della permeabilità in un modello enteroide BO dopo induzione NEC in vitro misurata mediante un test LY. (A) LPS e enteroidi basolaterali-out trattati con ipossia hanno aumentato significativamente la permeabilità rispetto ai controlli non trattati utilizzando il saggio giallo lucifero; le barre di errore mostrano l'errore standard della media; **p = 0,005. (B) Immagine di enteroidi basolaterali-out con giallo lucifero visualizzato nel lume dopo il trattamento del mezzo con colorante giallo lucifero a ingrandimento 10x, barra scala 300 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Aumento della permeabilità in un modello enteroide AO dopo induzione NEC in vitro misurata mediante un test LY. (A) LPS e enteroidi apicali-out trattati con ipossia hanno aumentato significativamente la permeabilità rispetto ai controlli non trattati che utilizzano il saggio giallo lucifero; le barre di errore mostrano l'errore standard della media; *p = 0,02. (B) Un'immagine rappresentativa dell'enteroide di controllo apical-out (AO) non trattato a 10x; la barra della scala è impostata su 100 μm. (C) Un'immagine rappresentativa di un enteroide AO trattato con LPS e ipossia con LY viene visualizzata nel lume a 10x; La barra della scala è impostata su 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione delle soluzioni, dei tamponi e dei mezzi utilizzati nel presente studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
La permeabilità intestinale è complessa e riflette la funzione della barriera epiteliale. La barriera intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali che media il trasporto transcellulare e paracellulare14. La permeabilità paracellulare si basa su proteine a giunzione stretta che sigillano lo spazio tra le cellule epiteliali14. All'interno di questo trasporto paracellulare, ci sono tre percorsi distinti attraverso i quali le molecole possono attraversarsi: poro, perdita e15 senza restrizioni. Il percorso dei pori consente la permeabilità a piccoli ioni carichi, mentre il percorso di perdita consente molecole più grandi e non cariche attraverso15. Il terzo percorso, senza restrizioni, riflette la permeabilità secondaria al danno epiteliale o alla morte16. Sebbene molte molecole siano utilizzate per valutare la permeabilità paracellulare, il tipo e la dimensione della molecola influenzano quale percorso di permeabilità sarà studiato.
Come piccola molecola idrofila, LY può attraversare tutte e tre le vie paracellulari, rendendolo uno strumento ottimale per studiare la permeabilità paracellulare. Al contrario, 4 kDa FITC-destrano, una molecola di zucchero utilizzata come marker di permeabilità paracellulare, può solo attraversare la perdita e percorsi senza restrizioni. Il più grande, 70 kDa FITC-destrano è limitato al solo percorso senza restrizioni. Un altro metodo per determinare la permeabilità paracellulare è tramite misurazioni della resistenza transepiteliale (TEER), che misurano la resistenza elettrica attraverso i monostrati. Questo metodo misura solo il percorso dei pori17. Pertanto, LY fornisce una maggiore comprensione della permeabilità paracellulare complessiva prendendo di mira tutti e tre i percorsi. Questo protocollo sfrutta questo utilizzando LY per studiare la permeabilità paracellulare.
Il modello enteroide è stato selezionato in questo protocollo in quanto imita più da vicino le condizioni in vivo creando un mini-intestino 3D da studiare. Tuttavia, la sfida con il tradizionale modello enteroide BO è come accedere alla superficie apicale per studiare le interazioni ospite-patogeno e i successivi cambiamenti di permeabilità. Il modello enteroide AO supera questa sfida invertendo la polarità in cui la superficie apicale è in contatto con il mezzo circostante. Sono stati descritti diversi metodi alternativi di accesso alla superficie apicale degli enteroidi. Questi includono sistemi di chip intestinali, microiniezione, frammentazione e enteroidi in crescita in monostrati18,19. I progressi nei sistemi di chip intestinali hanno permesso la coltura di organoidi e cellule endoteliali insieme nel contesto della vascolarizzazione e della peristalsi per imitare l'ambiente intestinale18. La microiniezione comporta l'iniezione nel lume enteroide BO attraverso l'uso di attrezzature specializzate come un micromanipolatore e un microiniettore19. La frammentazione utilizza la dissociazione degli enteroidi in singole cellule che vengono poi incubate in mezzi con il patogeno prima di riformare una struttura 3D19. È stata descritta anche la trasformazione degli enteroidi in monostrati 2D con successivo trattamento della superficie apicale19. Il modello enteroide AO affronta alcune delle difficoltà di questi modelli fornendo un modo semplice ed efficace per esporre la superficie apicale senza richiedere costose attrezzature o compromettere l'integrità strutturale dell'enteroide.
Sebbene l'uso di LY in un modello AO consenta un ampio studio della permeabilità paracellulare secondaria alle interazioni ospite-patogeno, questo protocollo può essere adattato per l'uso con enteroidi BO e FITC-destrano anziché LY. Sono necessarie due modifiche chiave a questo protocollo per modificarlo per essere utilizzato per gli enteroidi BO. Innanzitutto, gli enteroidi BO possono essere mantenuti nelle cupole BMM per tutte le fasi di lavaggio prima e dopo l'aggiunta di LY. È importante utilizzare soluzioni riscaldate a 37 °C per queste fasi di lavaggio per prevenire la solubilizzazione della cupola BMM. In secondo luogo, la cupola BMM deve essere interrotta con DPBS freddo e raschiando il pozzo con una punta di pipetta dopo che tutte le fasi di lavaggio sono state completate per consentire la completa risospensione degli enteroidi dissociati e LY. Se il fitc-destrano viene sostituito con LY, si raccomanda di utilizzare la molecola da 4 kDa mentre attraversa due delle tre vie paracellulari.
I passaggi chiave di questo protocollo includono la garanzia di lavaggi adeguati per rimuovere qualsiasi traccia di LY dalla soluzione al di fuori dell'enteroide. È anche importante lavare delicatamente gli enteroidi per evitare la dissociazione e il potenziale rilascio di LY dal lume nella soluzione circostante fino al momento della quantificazione utilizzando un lettore di micropiastre. L'uso di soluzioni riscaldate durante le fasi di lavaggio riduce anche lo stress sugli enteroidi. Se vengono utilizzate soluzioni fredde, gli enteroidi possono subire apoptosi, portando a risultati imprecisi.
I limiti di questo metodo includono l'incapacità di propagare enteroidi AO e tempi di coltura più lunghi a causa delle 72 ore aggiuntive necessarie per invertire la polarità. C'è anche una diminuzione del 2% -5% del numero di enteroidi AO trattati rispetto ai controlli. Sebbene ciò sia complessivamente trascurabile, può portare a una sottostima dei risultati. I limiti dell'uso di LY sono simili ad altre molecole di permeabilità, come 4 kDa FITC-destrano, dove tracce possono attraversare la barriera epiteliale intestinale attraverso la transcitosi20. Sebbene questo importo sia trascurabile, può influire sui risultati. Sulla base di questi risultati, l'applicazione di LY ai mezzi di enteroidi AO fornisce un modo elegante e relativamente semplice per analizzare quantitativamente e qualitativamente la permeabilità intestinale paracellulare in un modello 3D.
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Disclosures
Gli autori non riportano alcun interesse proprietario o commerciale in alcun prodotto menzionato o concetto discusso in questo articolo.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Ashley Nelson dell'Università di Rochester Medical Center per il suo aiuto strumentale con il nostro modello enteroide. Vorremmo anche ringraziare la Divisione di Chirurgia Pediatrica dell'Università dell'Oklahoma per il loro sostegno a questo progetto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], dall'Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research e dal Presbyterian Health Foundation Grant # 20180587 assegnato al Dipartimento di Chirurgia presso l'Università dell'Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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