Summary
यह प्रोटोकॉल एक ऑपरेटिंग-आधारित ओरोफेशियल दर्द मूल्यांकन उपकरण का उपयोग करके न्यूरोपैथिक ओरोफेशियल दर्द के चूहे मॉडल में यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता के मूल्यांकन का वर्णन करता है।
Abstract
दर्द में संवेदी और भावात्मक घटक होते हैं। पारंपरिक, रिफ्लेक्स-आधारित दर्द परख के विपरीत, ऑपरेटिंग दर्द परख कृन्तकों में दर्द के संज्ञानात्मक और प्रेरक पहलुओं को संबोधित करके अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं। यह पेपर एक ओरोफेशियल ऑपरेटिंग दर्द प्रणाली का उपयोग करके चूहों में इन्फ्राऑर्बिटल नसों (सीसीआई-आईओएन) की पुरानी कसना चोट के बाद यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। सीसीआई-आईओएन सर्जरी से पहले, चूहों को एक ओरोफेशियल दर्द मूल्यांकन उपकरण (ओपीएडी) में प्रशिक्षित किया गया था, ताकि वे धातु स्पाइक्ड बार और चाट-ट्यूब के साथ चेहरे का संपर्क बनाते हुए मीठा गाढ़ा दूध पी सकें।
इस परख में, चूहे एक सकारात्मक सुदृढ़क के रूप में दूध प्राप्त करने या एक प्रतिकूल यांत्रिक उत्तेजना से बचने के बीच चयन कर सकते हैं जो इनाम पहुंच छेद के प्रत्येक तरफ छोटे पिरामिड के आकार के स्पाइक्स की ऊर्ध्वाधर पंक्ति द्वारा उत्पन्न होता है। ओपीएडी में 2 सप्ताह के प्रशिक्षण के बाद और सीसीआई-आईओएन सर्जरी से पहले, 10 मिनट के परीक्षण सत्र के दौरान प्रत्येक चूहे के लिए 5 दिनों के लिए बेसलाइन मैकेनिकल संवेदनशीलता डेटा दर्ज किया गया था। एक सत्र के दौरान, ऑपरेटिंग सिस्टम स्वचालित रूप से इनाम बोतल सक्रियण (चाटना) और चेहरे के संपर्कों, संपर्क अवधि और पहली चाट के लिए विलंबता की संख्या को रिकॉर्ड करता है।
बेसलाइन माप के बाद, चूहों को या तो सीसीआई-आईओएन या शाम सर्जरी से गुजरना पड़ा। इस प्रोटोकॉल में, यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता को चाटने की संख्या, पहले चाटने की विलंबता, संपर्कों की संख्या और चेहरे के संपर्कों (एल / एफ) के लिए चाटने के अनुपात को मापकर निर्धारित किया गया था। आंकड़ों से पता चला है कि सीसीआई-आईओएन के परिणामस्वरूप चाटने वालों की संख्या और एल /एफ अनुपात में उल्लेखनीय कमी आई और पहली चाट की विलंबता में वृद्धि हुई, जो यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता का संकेत देती है। ये डेटा प्रीक्लिनिकल दर्द अनुसंधान में यांत्रिक दर्द संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए ऑपरेटिंग-आधारित दर्द परख के उपयोग का समर्थन करते हैं।
Introduction
क्रोनिकदर्द सालाना लाखों अमेरिकियों को प्रभावित करता है। दुर्भाग्य से, पुरानी दर्द का इलाज करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि मौजूदा उपचार पुराने दर्द को कम करने में अपेक्षाकृत अप्रभावी हैं और अक्सर दीर्घकालिक उपयोग 2,3,4 के साथ अवांछित दुष्प्रभाव होते हैं। पारंपरिक प्रीक्लिनिकल दर्द परख, जैसे वॉन फ्रे परख, रिफ्लेक्सिव परिणामों या दर्द-उत्तेजित प्रतिक्रियाओं पर भरोसा करतेहैं। जबकि वॉन फ्रे परख का उपयोग यांत्रिक एलोडोनिया को मापने के लिए दशकों से किया गया है, यह कई भ्रामक कारकों के लिए अतिसंवेदनशील है, विशेष रूप से प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह6। ओरोफेशियल दर्द के मूल्यांकन के लिए वॉन फ्रे परीक्षण का उपयोग चेहरे के क्षेत्र का सफलतापूर्वक परीक्षण करने के लिए जानवर के सिर को सुरक्षित करने के लिए आवश्यक संयम की डिग्री के कारण भी समस्याग्रस्त है, जो अवांछित तनाव प्रभाव पैदा कर सकता है, जैसे कि दर्द को बढ़ाना या, इसके विपरीत, तनाव-प्रेरित एनाल्जेसिया।
दर्द-उत्तेजित व्यवहार भी झूठे-सकारात्मक परिणामों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं7 और दर्द के भावात्मक घटक के लिए जिम्मेदार नहीं होते हैं, जो मानव दर्द अनुभव8 का अभिन्न अंग है। इसलिए, ऑपरेटिंग दर्द मॉडल का उपयोग करने में रुचि बढ़ रही है जो दर्द-उदास व्यवहार का आकलन करते हैं जो प्रीक्लिनिकल परीक्षण में सामग्री और पूर्वानुमानित वैधता में सुधार के लिए दर्द के संवेदी और भावात्मक दोनों घटकों को शामिल करते हैं। यहां वर्णित ऑपरेटिंग ओरोफेशियल दर्द मूल्यांकन परख एक इनाम-संघर्ष प्रतिमान 9,10,11 पर आधारित है। इस परख में, कृंतक एक सकारात्मक सुदृढ़क प्राप्त करने और खुद को एक नोसिसेप्टिव उत्तेजना के अधीन करने या इनाम को छोड़ने और नोसिसेप्टिव उत्तेजना से बचने के बीच चयन कर सकता है, जिससे दर्द की मात्रा को नियंत्रित किया जा सकता है। पारंपरिक दर्द परख के विपरीत, ऑपरेटिंग-आधारित परख प्रयोगकर्ता-स्वतंत्र है और अप्रिय शामक प्रभावों के कारण झूठे-सकारात्मक परिणामों के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है।
सिर और चेहरे से हानिकारक संवेदनाएं ट्राइजेमिनल तंत्रिका की नेत्र, मैक्सिलरी और मैंडिबुलर शाखाओं द्वारा की जाती हैं। ट्राइजेमिनल तंत्रिका की चोट या सूजन थर्मल या यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए संवेदी न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता को बढ़ाती है 12,13,14,15. ऑपरेटिंग-आधारित ओरोफेशियल दर्द परख कृन्तकों में ट्राइजेमिनल तंत्रिका द्वारा प्रेषित थर्मल या यांत्रिक ओरोफेशियल दर्द का एक स्वचालित माप प्रदान करते हैं 11,12,16,17,18। गैर-हानिकारक और हानिकारक उत्तेजनाओं के साथ उत्तेजना ओपीएडी के साथ ओरोफेशियल क्षेत्र में थर्मल और मैकेनिकल एलोडोनिया और हाइपरलेजेसिया के परीक्षण के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है, क्योंकि वे विभिन्न अंतर्निहित तंत्रों की अभिव्यक्तियों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।
ओरोफेशियल थर्मल परख में, जानवर इनाम तक पहुंचने के लिए चिकनी थर्मोड के खिलाफ अपना चेहरा दबाते हैं। थर्मोड्स को विभिन्न शांत, गर्म और गर्म तापमानों पर सेट किया जा सकता है, जिससे तटस्थ या नोसिसेप्टिव स्थितियों के तहत व्यवहार का आकलन करने की अनुमति मिलती है। ओरोफेशियल मैकेनिकल परख में, जानवर ऑपरेटिंग परीक्षण के दौरान स्पाइक्ड सलाखों के खिलाफ अपना चेहरा दबाते हैं; चूंकि ये स्पाइक्स कुछ स्तर की असुविधा का कारण बनते हैं, कृन्तक कम पी सकते हैं जब उनके चेहरे थर्मोड की चिकनी सतहों की तुलना में स्पाइक्स को छूते हैं। इस प्रकार, ऑपरेटिंग ओरोफेशियल मैकेनिकल परख यांत्रिक नोसिसेप्टिव उत्तेजना की अलग-अलग डिग्री के प्रभाव का आकलन कर सकती है। हमने पहले प्रदर्शित किया है कि ओपीएडी तीव्र थर्मल9, साथ ही तीव्र यांत्रिक19, नोसिसेप्टियन और हाइपरलेगेसिया का आकलन करने के लिए एक उपयोगी और विश्वसनीय तरीका है।
यह पेपर यांत्रिक नोसिसेप्शन और अतिसंवेदनशीलता का आकलन करने के लिए ओपीएडी के एक नए विकसित संस्करण के उपयोग की रिपोर्ट करता है। इसके अतिरिक्त, सत्यापन के माध्यम से, हम पुरानी न्यूरोपैथी को प्रेरित करने के लिए सीसीआई-आईओएन की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं जिसके परिणामस्वरूप ओपीएडी में अनुमानित प्रतिक्रिया होती है। यह भी विस्तृत है कि कृंतक व्यवहार डेटा को तेजी से प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए ओपीएडी और उससे जुड़े सॉफ़्टवेयर का उपयोग कैसे करें।
Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को फ्लोरिडा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड में बताए गए मानकों का अनुपालन किया गया था। यहां, ओपीएडी का उपयोग करके यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता का आकलन न्यूरोपैथिक ओरोफेशियल दर्द के चूहे मॉडल का उपयोग करके वर्णित किया गया है। अध्ययन में उपयोग की जाने वाली समयरेखा का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। सभी व्यवहार मूल्यांकन महिला प्रयोगकर्ताओं द्वारा किए गए थे।
1. जानवर
- 12 घंटे: 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ तापमान-नियंत्रित कमरे (22 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस) में जोड़े में महिला स्प्रैग-डॉवले चूहे (एन = 8/समूह, 150-200 ग्राम) घर की मादा स्प्रैग-डॉवले चूहे(एन = 8/समूह, 150-200 ग्राम)। लिबिटम के लिए भोजन और पानी प्रदान करें। प्रयोगों से पहले अनुकूलन के लिए चूहों को 5 दिनों के लिए सुविधा में रखें।
- सप्ताह और समय के एक ही दिन (सुबह 9 बजे से 11 बजे) ऑपरेशनल दर्द परीक्षण करें।
- प्रयोगों के अंत में, आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के बाद चूहों को डिकैपिटेशन द्वारा इच्छामृत्यु करें।
2. OPAD सेट करना
- ओपीएडी पर दूध-ड्रिप ट्रे, प्लेक्सीग्लास पिंजरे और धातु फर्श के टुकड़े रखें। पिंजरों में तारों को संलग्न करें। बोतल धारक को डिवाइस के पीछे धातु के खंभे पर फिसलें।
- मीठे गाढ़े दूध का एक कैन खोलकर और इसे 1 लीटर बीकर में डालकर इनाम समाधान के रूप में मीठे गाढ़ा दूध के लिए पानी का 2: 1 अनुपात तैयार करें। 300 एमएल दूध में ~ 600 एमएल नल का पानी मिलाएं। प्रारंभ में एक चम्मच का उपयोग करके घोल को हिलाएं, और फिर एक हलचल पट्टी और गर्म प्लेट स्टिरर का उपयोग करें। फिर, दूध के घोल के साथ इनाम की बोतलों को भरें और स्टॉक दूध के घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: प्लास्टिक खाद्य लपेट के साथ स्टॉक दूध समाधान को कवर करें। प्रत्येक उपयोग से पहले दूध के घोल को गर्म करें। फ्रिज में स्टॉक दूध का घोल एक सप्ताह के बाद जमा हो सकता है। जब यह जमा होता है, तो यह चाट ट्यूब को अवरुद्ध कर सकता है। इसलिए, इसे त्याग दें और एक नया स्टॉक समाधान तैयार करें। - बोतल धारक पर इनाम दूध की बोतलें रखें और उन्हें समायोजित करें ताकि जानवर द्वारा स्पाउट तक पहुंचा जा सके। बोतल को सुरक्षित करने के लिए धारक के बाईं ओर के घुंडी को कसें।
- फ्रंट पैनल पर स्विच का उपयोग करके पिंजरों को चालू करें।
3. प्रोटोकॉल सेट करना और एक प्रयोग फ़ाइल बनाना
नोट: सबसे पहले, प्रयोग चलाने के लिए प्रोटोकॉल सेट करें। प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि ANY-भूलभुलैया सॉफ्टवेयर प्रयोग कैसे करता है।
- सॉफ़्टवेयर खोलें. पासवर्ड टाइप करें. मुझे लॉग ऑन करें पर क्लिक करें या Enter दबाएँ.
- नया खाली प्रयोग | क्लिक करें प्रोटोकॉल मेनू.
- उस मोड का चयन करें जिसका उपयोग यह प्रोटोकॉल करेगा और प्रोटोकॉल को नाम देगा। उपकरण के अंतर्गत, अनाम प्रोटोकॉल क्लिक करें, उस मोड का चयन करें जिसका उपयोग यह प्रोटोकॉल अनुभाग करेगा , और, उपकरण-विशिष्ट मोड के अंतर्गत, OPAD मैकेनिकल केज मोड का चयन करें, और ठीक क्लिक करें. फिर, प्रोटोकॉल का नाम दें (उदाहरण के लिए, ओपीएडी मैकेनिकल)।
- ओपीएडी पिंजरे जोड़ें।
- उपकरण के अंतर्गत, उपकरण | क्लिक करें प्रोटोकॉल फलक के शीर्ष पर पाया गया आइटम जोड़ें | नया OPAD पिंजरे | सभी जुड़े हुए OPAD पिंजरे जोड़ें।
नोट: पिंजरों को जोड़ने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी पिंजरों को चालू किया गया है।
- उपकरण के अंतर्गत, उपकरण | क्लिक करें प्रोटोकॉल फलक के शीर्ष पर पाया गया आइटम जोड़ें | नया OPAD पिंजरे | सभी जुड़े हुए OPAD पिंजरे जोड़ें।
- प्रयोग परीक्षण चरण जोड़ें।
- परीक्षण के तहत, चरण | क्लिक करें पहला चरण और नाम चरण (उदाहरण के लिए, बेसलाइन दिन 1)। परीक्षण अवधि के लिए 10 मिनट टाइप करें। अधिक चरण जोड़ने के लिए, प्रोटोकॉल फलक | के शीर्ष पर पाया गया आइटम जोड़ें क्लिक करें नया चरण।
नोट: प्रत्येक चरण उस सत्र को संदर्भित करता है जब एक परख का प्रदर्शन किया जाता है। उदाहरण के लिए, 10 दिनों के प्रशिक्षण के लिए, 10 चरणों की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर परीक्षण अवधि को बढ़ाया या घटाया जा सकता है।
- परीक्षण के तहत, चरण | क्लिक करें पहला चरण और नाम चरण (उदाहरण के लिए, बेसलाइन दिन 1)। परीक्षण अवधि के लिए 10 मिनट टाइप करें। अधिक चरण जोड़ने के लिए, प्रोटोकॉल फलक | के शीर्ष पर पाया गया आइटम जोड़ें क्लिक करें नया चरण।
- उपचार समूह असाइन करें।
- अतिरिक्त जानकारी के अंतर्गत, उपचार समूह क्लिक करें. | उपयोग उपचार समूहों की जांच करें उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से जानवरों को अपने समूहों में असाइन करेगा।
नोट: संदर्भित सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) जानवरों को यादृच्छिक रूप से या एक विशिष्ट क्रम में असाइन करने की अनुमति देता है। प्रयोगों को अंधा चलाया जा सकता है। असाइन किए गए उपचार समूहों को देखने के लिए, अनियंत्रित रन प्रयोग अंधे हैं।
- अतिरिक्त जानकारी के अंतर्गत, उपचार समूह क्लिक करें. | उपयोग उपचार समूहों की जांच करें उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से जानवरों को अपने समूहों में असाइन करेगा।
- पशु पहचान (आईडी) असाइन करें।
- प्रोटोकॉल मेनू क्लिक करें; अतिरिक्त जानकारी के तहत, पशु आईडी पर क्लिक करें और जानवरों को संदर्भित करने के लिए मेरी आईडी का उपयोग करें।
- प्रयोग मेनू क्लिक करें.
- कोई प्रयोग शीर्षक लिखें.
- उपचार देखें पर क्लिक करके उपचार को नाम दें, और उपचार के नाम टाइप करें (उदाहरण के लिए, उपचार 1: सीसीआई-आईओएन, उपचार 2: शाम)।
- जानवरों को जोड़ें और जानवरों को देखें पर क्लिक करके उपचार और पशु आईडी असाइन करें | जानवरों को जोड़ें, परीक्षण किए जाने वाले जानवरों की संख्या दर्ज करें, और ठीक पर क्लिक करें। जानवरों की सूची दिखाई देने और प्रत्येक चूहे के लिए पशु आईडी और उपचार जोड़ने की प्रतीक्षा करें।
नोट: पशु आईडी के बगल में दिखाई देने वाली स्थिति सूची अध्ययन की शुरुआत में सामान्य पर सेट की जाएगी। जानवरों को बाद में उनकी स्थिति को सेवानिवृत्त या हटाए गए में बदलकर परीक्षण अनुसूची से हटाया जा सकता है।
- प्रोटोकॉल मेनू | क्लिक करके प्रोटोकॉल सहेजें प्रोटोकॉल फलक के शीर्ष पर पाए गए प्रोटोकॉल सहेजें। फ़ाइल का नाम और सॉफ़्टवेयर (ANY-भूलभुलैया) पासवर्ड टाइप करें और सहेजें क्लिक करें.
नोट: सहेजे गए प्रोटोकॉल को नए प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। - फ़ाइल फ़ाइल क्लिक करके प्रयोग फ़ाइल सहेजें | सहेजें, सॉफ़्टवेयर पासवर्ड टाइप करें, और सहेजें क्लिक करें.
4. प्रशिक्षण और आधारभूत परीक्षण सत्र
नोट: परीक्षण से कम से कम 15 मिनट पहले चूहों को कमरे में लाएं यदि व्यवहार परीक्षण कक्ष एक ही पशु आवास सुविधा में है। यदि उन्हें पशु सुविधा के बाहर एक परीक्षण कक्ष में ले जाया जाता है, तो चूहों को कमरे में अनुकूलन करने के लिए 1 घंटे दें।
- बेसलाइन रिकॉर्डिंग से पहले, चूहों को 2 सप्ताह (5 दिन / सप्ताह, 10 मिनट / दिन) के लिए ओपीडी में प्रशिक्षित करें ताकि दूध का घोल प्राप्त करने के लिए धातु स्पाइक्ड सलाखों के खिलाफ उनके चेहरे दबा सकें।
नोट: स्पाइक्ड सलाखों और परख करने वाले चूहे की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 2 में दिखाई गई है। - OPAD उपकरण सेट करें।
- फ्रंट पैनल पर स्विच का उपयोग करके पिंजरों को चालू करें। पिंजरे पर हरी रोशनी की तलाश करें, जिसका अर्थ है कि पिंजरा परीक्षण करने के लिए तैयार है।
- सहेजी गई प्रयोग फ़ाइल को खोलने के लिए डबल-क्लिक करें. पासवर्ड टाइप करें. मुझे लॉग ऑन करें पर क्लिक करें या Enter दबाएँ.
- टेस्ट मेनू के दिखाई देने की प्रतीक्षा करें। स्क्रीन के बाईं ओर, जानवरों की संख्या और संबंधित पिंजरे (जैसे, पशु 1 का परीक्षण पिंजरे 1 में किया जाएगा), उस दिन चलने वाला चरण, और परीक्षण की स्थिति ("तैयार") का नोट करें। स्क्रीन के दाईं ओर, प्रत्येक जानवर के चार्ट का निरीक्षण करें जो चाटने और संपर्कों की संख्या दिखाता है।
- परीक्षण किए जाने वाले जानवर की आईडी प्रदर्शित करने वाले पिंजरों की स्क्रीन का निरीक्षण करें। प्रत्येक चूहे को संबंधित पिंजरे में रखें और पिंजरे पर बटन को दो बार दबाएं। ध्यान दें कि परीक्षण शुरू होने के बाद हरी बत्ती नारंगी रोशनी में बदल जाएगी, और परीक्षण सत्र समाप्त होने पर एक चेतावनी ध्वनि सुनाई देगी।
- प्रशिक्षण के पहले 2 दिनों के लिए, दूध की बोतलों को पूरी तरह से पिंजरे में रखें ताकि चूहों को उत्तेजना से संपर्क किए बिना दूध पीने की अनुमति मिल सके।
- प्रशिक्षण के 3-8 दिनों में, एक बार जब जानवर पीना शुरू कर देते हैं, तो बोतलों को उत्तरोत्तर पीछे की ओर ले जाएं ताकि चूहों को स्पाइक ्ड सलाखों के खिलाफ अपना चेहरा दबाने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके।
- प्रशिक्षण के 9-10 दिनों में, एक बार जब जानवर स्पाइक ्ड सलाखों के खिलाफ पूरी तरह से दबाते हैं और चाटने की संख्या सुसंगत होती है (10 मिनट के परीक्षण सत्र के दौरान न्यूनतम 500 चाट), प्रत्येक जानवर के लिए दूध की बोतल के स्थान पर ध्यान दें और बेसलाइन रिकॉर्डिंग के लिए इस दूरी का उपयोग करें।
- 2 सप्ताह के प्रशिक्षण के बाद, बेसलाइन (10 मिनट / दिन) के रूप में 5 दिनों के लिए नोट किए गए दूध की बोतल की दूरी से डेटा एकत्र करें।
5. ओरोफेशियल न्यूरोपैथिक दर्द का प्रेरण और यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता का मूल्यांकन
नोट: बेसलाइन माप के बाद, चूहों को सीसीआई-आईओएन सर्जरी से गुजरना पड़ा, जिसमें आईओएन का द्विपक्षीय बंधाव शामिल था, जैसा कि पहले वर्णित20 था। नियंत्रित चूहों की शाम की सर्जरी हुई थी। प्रक्रिया में कोई पूर्व या पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया का उपयोग नहीं किया गया था क्योंकि यह न्यूरोपैथी के समय पाठ्यक्रम को बदल सकता है। चेतावनी: अपशिष्ट आइसोफ्लुरेन को लकड़ी का कोयला कनस्तर के माध्यम से साफ किया जाना चाहिए। स्केलपेल ब्लेड और सुइयों को बायोहाजार्ड कचरे में निपटाया जाना चाहिए।
- प्रेरण कक्ष में चूहे को ओ2 (1 एल / मिनट) और 4% आइसोफ्लुरेन के मिश्रण के साथ एनेस्थेटाइज करें और सर्जरी की अवधि के लिए एक विशेष नाक शंकु के साथ एनेस्थेटिक अवस्था को बनाए रखें।
- एनेस्थेटाइज्ड चूहे को सर्जिकल वर्कबेंच पर रखें और इसे रोकें। हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। आंखों को सूखने से रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें। पैर की अंगुली को चुटकी मारकर एनेस्थेटिक गहराई की जांच करें और प्रक्रिया शुरू करें जब पैर की अंगुली वापसी रिफ्लेक्स अब नहीं देखा जाता है।
- स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत शल्य चिकित्सा प्रक्रिया करें। रिट्रैक्टर्स का उपयोग करके मुंह खोलें और एक छोटी क्लिप का उपयोग करके होंठ को वापस लें।
- स्केलपेल ब्लेड (# 15) का उपयोग करके पृष्ठीय गोंद और होंठ के बीच एक छोटा सा चीरा लगाएं। आईओएन की एक शाखा को प्रकट करने के लिए स्केलपेल ब्लेड की नोक का उपयोग करके धीरे से नरम ऊतक को काट लें।
- एक कुंद, मुड़ी हुई सिरिंज सुई का उपयोग करके आईओएन के चारों ओर दो क्रोमिक आंत (# 5-0) लिगेटर रखें।
- ऊतक चिपकने वाला का उपयोग करके घाव को बंद करें।
- शाम सर्जरी के लिए, उसी प्रक्रिया का उपयोग करके आईओएन को उजागर करें लेकिन तंत्रिका को संक्रमित न करें।
- सर्जरी के बाद, खाने को प्रोत्साहित करने और निर्जलीकरण को रोकने के लिए 2 दिनों के लिए दूध-नरम कृंतक चाउ प्रदान करें।
- सर्जरी के अगले दिन लगातार 3 दिनों के लिए और फिर 3 दिन / सप्ताह (जैसे, हर मंगलवार, गुरुवार और शुक्रवार) को अगले हफ्तों के लिए ओपीएडी में चूहों का परीक्षण करें जब तक कि चाटने की संख्या उनके बेसलाइन मूल्यों तक न पहुंच जाए।
नोट: सीसीआई-आईओएन-प्रेरित यांत्रिक संवेदनशीलता की अवधि लिंग, उपयोग किए गए कृंतक के तनाव और प्रयोगकर्ता के प्रदर्शन पर निर्भर कर सकती है। इस प्रकार, जानवरों का परीक्षण करने के लिए एक निश्चित अवधि को इंगित करना सटीक नहीं हो सकता है। इसलिए, जब तक चाटने की संख्या बेसलाइन मानों तक नहीं पहुंच जाती है तब तक परीक्षण अधिक सटीक होता है।
6. डिवाइस को साफ करना
- परीक्षण समाप्त होने पर, शीर्ष-दाएं कोने पर एक्स आइकन पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर छोड़ दें और डेटा को स्वचालित रूप से सहेजने की प्रतीक्षा करें।
- फ्रंट पैनल पर स्विच का उपयोग करके पिंजरों को बंद करें।
- धातु के फर्श से तारों को अनप्लग करें। दूध-ड्रिप ट्रे, प्लेक्सीग्लास पिंजरों, धातु फर्श के गेट, और बोतल धारकों को डिश साबुन से हटा दें और धो लें। सुखाने वाले रैक पर सब कुछ रखो।
- 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल का उपयोग करके धातु स्पाइक्ड बार, परीक्षण उपकरण और लैब बेंचों को पोंछें।
नोट: उपकरणों को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। दूध की बोतलों को साफ करते समय और ट्यूब चाटते समय नरम ब्रश का उपयोग करें। गंदे उपकरण बैक्टीरिया के निर्माण का कारण बन सकते हैं।
7. डेटा विश्लेषण
- इसे खोलने के लिए प्रयोग फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें।
- परिणाम मेनू पर क्लिक करें। चयन करें कि कौन से उपाय (यानी, चाटना, संपर्क करना) या परीक्षण के दिन देखना है।
- पाठ, ग्राफ़ या सांख्यिकीय विश्लेषण रिपोर्ट देखने के लिए परिणाम पैनल के शीर्ष पर पाए गए पाठ या ग्राफ़ या सांख्यिकीय पर क्लिक करें.
- कच्चा डेटा देखने के लिए, डेटा मेनू पर क्लिक करें। डेटा को स्प्रेडशीट के रूप में सहेजने के लिए डेटा पैनल के शीर्ष पर सहेजें क्लिक करें या ई-मेल के माध्यम से इसे प्राप्त करने के लिए भेजें पर क्लिक करें.
- देखने के लिए अधिक चर बदलने या जोड़ने के लिए, डेटा का चयन करें क्लिक करें, माप ों का चयन करें, और स्प्रेडशीट देखें क्लिक करें.
- सांख्यिकीय विश्लेषण
- स्वचालित रूप से चाटने और संपर्कों की संख्या और सॉफ्टवेयर से पहली चाट की विलंबता प्राप्त करें और सॉफ़्टवेयर से स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करें।
- एल/एफ अनुपात की गणना अतिसंवेदनशीलता के सूचकांक के रूप में कीजिये, जिसमें चाटने वालों की संख्या को21,22,23 संपर्कों की संख्या से विभाजित किया गया है।
नोट: इस अध्ययन में, सर्जरी से पहले कम चाटने की संख्या (<500 चाट) के कारण शाम समूह के चूहों में से एक को अध्ययन से बाहर रखा गया था। - एल /एफ के बीच अंतर के सांख्यिकीय महत्व का विश्लेषण करें, चाटने और संपर्कों की संख्या, और दो-तरफा दोहराए गए उपायों के माध्यम से पहली चाट की विलंबता एनोवा के बाद डंनेट की कई तुलनाएं या सिडक के कई तुलना परीक्षण जहां उपयुक्त हो।
नोट: पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। डेटा को माध्य (एसईएम) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया था।
Representative Results
इनाम की बोतल पर एक चूहे की चाट का एक उदाहरण और बेसलाइन पर धातु स्पाइक्ड सलाखों के साथ संपर्क और सर्जरी के 2 सप्ताह, 4 सप्ताह और 6 सप्ताह बाद चित्र 3 में प्रस्तुत किया गया है। गैर-हानिकारक अवधि के दौरान, चूहों के पास आम तौर पर पीने के लंबे सत्र होते हैं (उदाहरण के लिए, सीसीआई-आईओएन के बाद बेसलाइन और रिकवरी पर: छवि में सप्ताह 6), और, सीसीआई-आईओएन के बाद, चाटने की संख्या कम हो जाती है क्योंकि वे लंबे समय तक स्पाइक्ड सलाखों के साथ चेहरे का संपर्क बनाए नहीं रख सकते हैं (चित्रा 3 ए), शाम समूह में पीने की अवधि में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं होता है (चित्रा 3 बी)।
सीसीआई-आईओएन वाले चूहों में सर्जरी के 4 सप्ताह बाद तक चाटने की संख्या में उल्लेखनीय कमी आई थी और बेसलाइन की तुलना में सर्जरी सप्ताह (सप्ताह 0) और सर्जरी के 1 सप्ताह बाद पहली बार चाटने की विलंबता में वृद्धि हुई थी। शाम समूह (चित्रा 4 ए, बी) में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं था। सीसीआई-आईओएन ने संपर्कों की संख्या में कमी का उत्पादन किया, लेकिन यह अंतर महत्वपूर्ण नहीं था (चित्रा 4 सी)। सीसीआई-आईओएन ने एल / एफ में भी महत्वपूर्ण कमी का कारण बना, और सीसीआई-आईओएन समूह के लिए कमी शाम समूह (चित्रा 4 डी) के लिए कमी से अधिक थी।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि, सीसीआई-आईओएन के बाद, चूहे कम पुरस्कृत दूध पीने का व्यवहार दिखाते हैं, और उन्हें पहली बार चाटने में थोड़ा समय लगता है, जो एक नोसिफेन्सिव व्यवहार का संकेत देता है। हालांकि, सीसीआई-आईओएन दूध तक पहुंचने की उनकी इच्छा को प्रभावित नहीं करता है। इसके अलावा, सीसीआई-आईओएन के साथ चूहों के एल / एफ में कमी यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता को इंगित करती है, क्योंकि गैर-दर्दनाक स्थितियों के दौरान एल / एफ अधिक होता है।
चित्रा 1: अध्ययन डिजाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। संक्षेप: ओपीएडी = ओरोफेशियल दर्द मूल्यांकन उपकरण; CCI-ION = इन्फ्राऑर्बिटल नसों की पुरानी कसना चोट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: स्पाइक्ड सलाखों और परख का प्रदर्शन करने वाले चूहे की प्रतिनिधि छवि। स्पाइक्ड बार स्टेनलेस स्टील धातु से बने होते हैं। पूरे बार की लंबाई 7 सेमी है। स्पाइक्स की ऊंचाई 0.3 सेमी है। स्पाइक्स के बीच की दूरी 0.5 सेमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: बेसलाइन पर मानक 10 मिनट परीक्षण सत्र के दौरान और सर्जरी के बाद 2 सप्ताह, 4 सप्ताह और 6 सप्ताह के दौरान एकल सीसीआई-आईओएन- और शाम-संचालित चूहे के प्रतिनिधि संपर्क प्रयास और चाटने के डेटा। संक्षेप: सीसीआई-आईओएन = इन्फ्राऑर्बिटल नसों की पुरानी कसना चोट; एएस = सर्जरी के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(A) सीसीआई-आईओएन (n = 8) वाले चूहों में सर्जरी के 4 सप्ताह बाद तक चाटने की संख्या में उल्लेखनीय कमी आई थी और (B) सर्जरी सप्ताह (सप्ताह 0) और सर्जरी के 1 सप्ताह बाद (*p < 0.01, *p < 0.05: सर्जरी सप्ताह बनाम बेसलाइन के बाद #p < 0.05: सीसीआई-आईओएन बनाम शाम)। शाम समूह (एन = 7, पी > 0.05) में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं थी। (ग) सीसीआई-आईओएन अथवा दिखावटी शल्य चिकित्सा से संपर्कों की संख्या में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ। (घ) सीसीआई-आईओएन वाले चूहों ने सर्जरी सप्ताह और 3 सप्ताह बाद एल/एफ में उल्लेखनीय कमी दिखाई और सर्जरी के 2 सप्ताह बाद घटती प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया। शाम समूह के चूहों की तुलना में, यह कमी सीसीआई-आईओएन चूहों में काफी अधिक थी और सर्जरी के 1 सप्ताह बाद शुरू हुई और सर्जरी के 3 सप्ताह बाद तक जारी रही। शाम समूह में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (*पी < 0.01, *पी < 0.05: सर्जरी के हफ्तों के बाद बनाम बेसलाइन। # पी < 0.05: सीसीआई-आईओएन बनाम शाम)। ग्राफ़ में, लाल रेखा सीसीआई-आईओएन समूह का प्रतिनिधित्व करती है, और नीली रेखा शाम समूह का प्रतिनिधित्व करती है। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। महत्वपूर्ण अंतरों का विश्लेषण दो-तरफा दोहराए गए एनोवा द्वारा किया गया था, जिसके बाद सिडाक या डनेट के कई तुलना परीक्षण, उपयुक्त थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
चेहरे और इंट्राओरल म्यूकोसा की निर्दोष यांत्रिक उत्तेजना से उत्पन्न दर्द ओरोफेशियल दर्द की स्थिति की एक प्रमुख विशेषता है, जिसमें ट्राइजेमिनल न्यूराल्जिया और टेम्पोरोमैंडिबुलर संयुक्त विकार24,25 शामिल हैं। यद्यपि ट्राइजेमिनल न्यूरोपैथिक दर्द चिकित्सकीय रूप से अच्छी तरह से वर्णित है, कृन्तकों में न्यूरोपैथिक नोसिसेप्टिव व्यवहार का आकलन चुनौतीपूर्ण है। रिफ्लेक्सिव व्यवहार को मापने वाले दर्द परख प्रीक्लिनिकल दर्द अनुसंधान में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके हैं। हालांकि, उपकरण से संबंधित तनाव का परीक्षण, भावात्मक स्थिति का आकलन करने में असमर्थता, और प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह रिफ्लेक्स परख26 की उपयोगिता और वैधता के बारे में चिंताओं को बढ़ाते हैं।
यह अध्ययन चूहों के ओरोफेशियल क्षेत्र में यांत्रिक संवेदनशीलता के आकलन का परिचय देता है, जो एक ऑपरेटिंग-आधारित दर्द परख का उपयोग करके सीसीआई-आईओएन के प्रति अपनी संवेदनशीलता का प्रदर्शन करता है। चूहों की यांत्रिक संवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए एक ही ऑपरेटिंग सिस्टम का भी उपयोग किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माउस और चूहे के उपभेद सीसीआई-आईओएन के प्रति उनकी प्रतिक्रिया में भिन्नता प्रदर्शित कर सकते हैं, और इस प्रकार, यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता के स्तर भिन्न हो सकते हैं। हमारे अनुभव के आधार पर, स्प्राग-डॉवले चूहे आमतौर पर सीसीआई-आईओएन के 2 सप्ताह बाद एक स्थिर यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता विकसित करते हैं, वे सीसीआई-आईओएन के 4 सप्ताह बाद ठीक होना शुरू करते हैं, और, सीसीआई-आईओएन के 6 सप्ताह के बाद, हम सर्जरी से वसूली देखते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता को चाटने की संख्या और संपर्कों, एल / एफ, और पहले चाटने के लिए विलंबता को मापकर निर्धारित किया गया था। डेटा से पता चला है कि सीसीआई-आईओएन के परिणामस्वरूप एल / एफ और चाटने की प्रतिक्रियाओं की संख्या में कमी आई और पहली चाट प्रतिक्रिया की विलंबता में वृद्धि हुई, यह दर्शाता है कि जानवर ओरोफेशियल दर्द संवेदनशीलता में वृद्धि के कारण स्पाइक्ड सलाखों के खिलाफ अपने चेहरे को दबाने के लिए तैयार नहीं थे।
ओपीएडी एक इनाम-संघर्ष परख है जिसमें जानवरों को एक स्वादिष्ट इनाम तक पहुंचने के लिए नोसिसेप्टिव उत्तेजनाओं को सहन करना चाहिए। परख में चाटने का व्यवहार क्षुधा व्यवहार से प्रभावित हो सकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन में, हमने उन चूहों का उपयोग किया जिनके चेहरे के बाल थे। कृन्तकों के बीच, ऑपरेशन दर्द के साथ पूर्व अनुभव के आधार पर, चेहरे के संपर्कों का पता लगाने के लिए बाल रहित उपभेद बेहतर हैं; हालाँकि, प्रकाशन के समय, बाल रहित चूहे के उपभेद अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं थे। इसे अध्ययन की सीमा माना जा सकता है। जैसा कि हमने केवल महिला स्प्राग-डॉवले चूहों का भी उपयोग किया, दर्द प्रतिक्रियाओं में सेक्स- और तनाव से संबंधित अंतर का अनुमान लगाया जाना चाहिए।
परख के साथ इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम भी हैं। सटीक चाटना और संपर्क डेटा क्रमशः संदर्भित सॉफ़्टवेयर में ठोस लाल और सफेद ब्लॉक के रूप में दिखाई देना चाहिए ( चित्रा 3 देखें)। प्रयोग की सफलता के लिए स्पाइक्स और दूध की बोतल के बीच की दूरी महत्वपूर्ण है। यदि दूध की बोतल की नोक बहुत दूर है, तो जानवर स्पाइक्स के साथ संपर्क नहीं करेगा, और सॉफ्टवेयर सही ढंग से संपर्क दर्ज नहीं करेगा या संख्याओं को चाटेगा। इसके विपरीत, यदि दूध की बोतल बहुत पीछे है, तो संपर्क पंजीकृत होंगे, लेकिन जानवर दूध तक पहुंचने में सक्षम नहीं होगा। प्रशिक्षण सत्रों के दौरान, चाटने वाला डेटा ठोस सफेद ब्लॉकों के रूप में दिखाई दे सकता है, क्योंकि दूध की बोतल की नोक बहुत दूर है। दूध की बोतल को पीछे धकेलने के बाद यह लाल ठोस ब्लॉकों में बदल जाता है। किसी कारण से, यदि चाटने वाला डेटा नोट की गई दूरी से सफेद ब्लॉक के रूप में दिखाई देने लगता है, तो बोतल को थोड़ा धक्का देना और दूध धारक को थोड़ा नीचे / ऊपर की ओर ले जाना मदद कर सकता है।
कई बिंदुओं को यहां वर्णित ओरोफेशियल ऑपरेटिंग दर्द प्रणाली की सीमाओं के रूप में भी माना जा सकता है। कृन्तकों का प्रशिक्षण आवश्यक है और इसमें हफ्तों लगते हैं। प्रत्येक परीक्षण सत्र से पहले, चूहों में भोजन प्रतिबंध आवश्यक है लेकिन चूहों में नहीं। उपवास वाले चूहों की तुलना में अनफास्ट चूहों को कम और असंगत चाटने की संख्या दिखाई गईहै। चूंकि ओपीएडी प्रणाली एक इनाम-संघर्ष मॉडल है, इसलिए यह जानवरों के क्षुधा व्यवहार या भूख को प्रभावित करने वाली दवा से प्रभावित हो सकता है। जानवरों का परीक्षण करने के लिए समग्र समय को कम करने के लिए कई उपकरण होना भी फायदेमंद है, जिससे लागत बढ़ सकती है। हालांकि, ओरोफेशियल ऑपरेटिंग दर्द परख अभी भी पारंपरिक रिफ्लेक्स-आधारित परखों पर फायदेमंद हैं, क्योंकि वे एक ही समय में कई जानवरों के परीक्षण की अनुमति देते हैं और पशु-प्रयोगकर्ता बातचीत को सीमित करते हैं।
दर्द की स्थिति के दौरान ऑपरेटिंग कंडीशनिंग उनके परिणामों के अनुसार मानव और पशु व्यवहार को संशोधित करतीहै। इसलिए, एक इनाम-संघर्ष मॉडल का उपयोग करना दर्द की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए फायदेमंद है क्योंकि यह जानवरों को परिचालन प्रतिक्रियाओं को करने की अनुमति देता है। यह अधिक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक है क्योंकि परिचालन व्यवहार की विशेषताओं में इरादा, प्रेरणा और, आमतौर पर, कॉर्टिकल प्रोसेसिंग29 शामिल है। चूंकि जानवर स्वेच्छा से इनाम की बोतल से संपर्क करते हैं और किसी भी समय स्पाइक्ड सलाखों से स्वतंत्र रूप से वापस ले सकते हैं, यह मस्तिष्क के उच्च केंद्रों को एकीकृत करता है और दर्द 10 से संबंधित भावात्मक-प्रेरक अवस्थाओं के मूल्यांकन की अनुमतिदेता है। इस प्रकार, विवो में दर्द और एनाल्जेसिक का आकलन करते समय ऑपरेटिंग दर्द परख बेहतर डेटा प्रदान करते हैं। वे ट्राइजेमिनल सिस्टम में नोसिसेप्टिव प्रक्रियाओं को समझने में भी मदद करते हैं, जिससे ओरोफेशियल दर्द क्षेत्र की उन्नति में योगदान होता है।
Disclosures
जॉन के न्यूबर्ट और रॉबर्ट एम कॉडल ओपीएडी के आविष्कारक हैं। स्टोलिंग कंपनी ओपीएडी का निर्माता है, और रिचर्ड मिल्स स्टोलिंग का एक कर्मचारी है। प्रकाशन शुल्क का भुगतान स्टोलिंग कंपनी रिचर्ड मिल्स, जॉन के न्यूबर्ट और रॉबर्ट एम कॉडल द्वारा किया गया है, जो वेलोसिटी लेबोरेटरीज के पिछले मालिक हैं, एक कंपनी जो ऑपरेटिंग दर्द परख का उपयोग करके शुल्क-सेवा व्यवहार परीक्षण प्रदान करती है।
Acknowledgments
यह अध्ययन चेहरे के दर्द अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting | 60000 | |
| Bottle cleaning brushes | ANY | ANY | Different size brushes for bottles and tubes |
| Chromic gut suture size 5-0 | Ethicon | 687-G | |
| Dish soap | ANY | ANY | Liquid |
| Dish sponge | ANY | ANY | |
| GraphPad Prism version 9.3.1 | GraphPad Software, San Diego, CA | ||
| Hotplate magnetic stirrer | Benchmark Scientific | H4000-HS | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Pivetal |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | 60-001-56 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet Ointment, petrolatum ophthalmic ointment | |
| Operant Pain Assessment Device (OPAD) System | Stoelting | 67500 | |
| Oxygen tank | Medical | ||
| Paper towel | ANY | ANY | |
| Plastic food wrap | ANY | ANY | |
| Polygon stir bars | Fisher Scientific | 14-512-124 | |
| Reusable glass Berzelius beakers (1 L) | Fisher Scientific | FB1021000 | |
| Scalpel blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Small animal anesthesia system | VetFlo | VetFlo-1205S | |
| Spoon | ANY | ANY | |
| Sprague-Dawley rats, female | Charles River Laboratories, USA | ||
| Stereo boom microscope | Omano | OM2300S-GX4 | |
| Sweetened condensed milk | Borden | Eagle Brand | |
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Water circulating heating pad and pump | Gaymar | Model TP-500 |
References
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