Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av sultindusert autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64282
Automatic Translation
1, 1
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

Summary

Denne protokollen beskriver induksjon av autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via næringsutarming og analyserer endringer i autofagi ved bruk av transgene fluestammer.

Abstract

Autofagi er en cellulær selvfordøyelsesprosess. Det leverer last til lysosomene for nedbrytning som svar på ulike påkjenninger, inkludert sult. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med aldring og flere menneskelige sykdommer. Autofagimaskineriet er sterkt konservert – fra gjær til mennesker. Larvefettlegemet til Drosophila melanogaster, en analog for virveldyr lever og fettvev, gir en unik modell for overvåking av autofagi in vivo. Autofagi kan lett induseres av næringssult i larvefettkroppen. De fleste autofagirelaterte gener er bevart i Drosophila. Det er utviklet mange transgene fluestammer som uttrykker merkede autofagimarkører, noe som letter overvåkingen av ulike trinn i autofagiprosessen. Den klonale analysen muliggjør en nøye sammenligning av autofagimarkører i celler med forskjellige genotyper i samme vevsstykke. Den nåværende protokollen beskriver prosedyrer for (1) generering av somatiske kloner i larvefettlegemet, (2) indusering av autofagi via aminosyresult og (3) dissekering av larvefettlegemet, med sikte på å lage en modell for å analysere forskjeller i autofagi ved hjelp av en autofagosommarkør (GFP-Atg8a) og klonal analyse.

Introduction

Autofagi er en "selvspisende" prosess indusert av ulike påkjenninger, inkludert aminosyresult1. Makroautofagi (heretter kalt autofagi) er den mest studerte typen autofagi og spiller en uerstattelig rolle i å opprettholde cellulær homeostase2. Funksjonsfeil i autofagi er forbundet med flere menneskelige sykdommer3. I tillegg er noen autofagirelaterte gener potensielle mål for behandling av ulike sykdommer4.

Autofagi reguleres på en svært sofistikert måte5. Ved sult sekvestrerer isolasjonsmembranene cytoplasmatiske materialer for å danne dobbeltmembranerte autofagosomer6. Autofagosomer smelter deretter sammen med endosomer og lysosomer for å danne amfisomer og autolysosomer. Ved hjelp av lysosomale hydrolytiske enzymer nedbrytes det oppslukte cytoplasmatiske innholdet, og næringsstoffene resirkuleres7.

Autofagi er en evolusjonært bevart prosess8. Drosophila melanogaster er en flott modell for å studere autofagiprosessen in vivo. Aminosyresult induserer lett autofagi i fluefett kroppsvev, en analog av menneskelig lever og fettvev9. Defekter i autofagi forstyrrer de distinkte punctamønstrene til flere autofagirelaterte proteiner, som Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 og p62, blant andre10. Derfor vil en analyse av mønstrene til disse autofagimarkørene bidra til å skjelne forekomsten av autofagidefekter og det defekte autofagitrinnet. For eksempel er det ubiquitinlignende proteinet Atg8 den mest brukte autofagimarkøren11. I Drosophila melanogaster har transgene stammer med et grønt fluorescerende protein (GFP)-merket Atg8a blitt utviklet12. GFP-Atg8a diffunderes i cytosol og kjerner i matede celler. Ved sult blir GFP-Atg8a behandlet og modifisert av fosfatidyletanolamin (PE) og danner puncta, som merker isolasjonsmembranene og fullt utviklede autofagosomer13,14. Gjennom direkte fluorescensmikroskopi kan autofagiinduksjonen lett observeres som en økning i GFP-Atg8 punctadannelse15. Atg8a puncta ville ikke dannes som respons på sult i nærvær av en autofagi initieringsdefekt. Siden GFP-Atg8a kan slukkes og fordøyes av den lave pH-verdien i autolysosomer, kan GFP-Atg8a puncta øke i antall hvis autofagi blokkeres sent i trinn16.

Siden autofagi er svært følsom for ernæringstilgjengelighet17, fører små forskjeller i kulturforhold ofte til variasjoner i fenotyper. Derfor har klonal analyse, en metode som analyserer mutante celler versus villtype kontrollceller i samme vev, en stor fordel i å dissekere autofagidefekter18. Ved å dra nytte av flippase / flippase recognition target (FLP / FRT)-mediert stedsspesifikk rekombinasjon mellom homologe kromosomer, blir fluer som bærer mosaikkvev lett laget19,20. Villtypecellene som omgir mutantcellene danner en perfekt indre kontroll for å unngå individuelle forskjeller21.

Denne studien beskriver hvordan man induserer autofagi ved aminosyresult og genererer GFP-Atg8a-uttrykkende kroppsvev med mosaikkfett. Disse protokollene kan brukes til å analysere forskjeller i autofagi blant mutante kloner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Drosophila-kryssing og egglegging

  1. Introduser 3 mannlige (genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) og 15 kvinnelige (genotype y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) voksne fluer (se materialfortegnelse) i et hetteglass med dyrkning (med standard maismel/melasse/agar Drosophila media ved 25 °C) for parring.
    MERK: Flere dyrkningsglass med samme kors må settes opp for å sikre nok larver til videre eksperimenter. Den mannlige fluestammen med genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a bærer et FRT-sted ved X-kromosomet nær sentromeren (FRT19A). Den uttrykker også FLP ved varmesjokk ved 37 °C. Et transgen med allestedsnærværende RFP-uttrykk settes inn på X-kromosomet. GFP-Atg8a uttrykkes under kontroll av cgGal4 i larvefettlegemet22. Den kvinnelige fluestammen med genotype y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP bærer en dødelig mutasjon (Mu) og FRT19A på X-kromosomet. Det detaljerte kryssingsskjemaet er vist i figur 1.
  2. For egglegging, overfør fluene til et nytt kulturflaske. Ved 48 timer etter introduksjon, bank på "parring" hetteglasset til fluene er bedøvet og slipp ned på media i bunnen av hetteglasset.
    1. Trekk ut hetteglasset med "parring" og dekk munnen med et omvendt hetteglass uten plugging med ferske medier (hetteglass med fersk dyrking). Overfør deretter fluene til hetteglasset med fersk dyrkning ved å snu og banke på hetteglassene.
    2. Plugg hetteglasset med fersk dyrkning (med de overførte fluene) og kast hetteglasset med gammel dyrking. Plasser dette hetteglasset med fersk dyrkning i en 25 °C kuvøse for egglegging på ferske medier.
      MERK: Forvarming av hetteglassene med fersk kultur til 25 °C i 15 minutter før flueoverføringsprosessen vil hjelpe fluene til å tilpasse seg det nye miljøet raskt og fremskynde eggleggingen.
  3. Fjern fluene etter 6 timer med egglegging. Hvis eksperimentene må gjentas, overfør disse fluene til et annet hetteglass med dyrkning (som beskrevet i trinn 1.2). Ellers kast fluene ved å dumpe dem i en kolbe som inneholder 75% etanol).
    1. Inkuber hetteglasset med embryoer i et vannbad på 37 °C i 1 time for å indusere FLP-uttrykk. Deretter plasserer du dem i en 25 °C kuvøse og lar embryoene fortsette å utvikle seg.
      MERK: Den vellykkede dannelsen av mutante kloner kan bekreftes senere gjennom avbildning. Fraværet av RFP-signaler markerer de mutante klonene.

2. Aminosyre sult induserer autofagi

  1. Bruk en laboratoriespatel, øs ut mediet som inneholder de utviklende larver i en petriskål 75 timer etter egglegging. Tilsett 3 ml 1x PBS i fatet og skill forsiktig ut kulturmediet og larvene med lange tang. Velg 10 til 15 tidlige tredje instar larver.
    MERK: Tidlig tredje instar larver må velges nøye. Larvenes utviklingsstadium er kritisk for denne protokollens suksess. På grunn av den begrensede varigheten av eggleggingen, forventes de fleste larver i kulturhetteglasset å være i tidlig tredje stjernestadium ved 75 timers inkubasjon. Imidlertid kan forskjellige kulturmedieoppskrifter føre til variasjoner i larvenes utviklingstidspunkt. Kriteriene for å skille tidlig tredje instar larver er kroppslengden, tilstedeværelsen av fremre og bakre spirakler, samt mandibulære kroker av munnapparatet23.
  2. Fyll brønnene på en 9-brønns glassforsenkningspunktplate (se materialfortegnelse) med 1x PBS. Plasser de separerte tredje stjernelarvene i brønnene med lang tang og vask larvene grundig for å fjerne alle medierester.
  3. Ta 5 ml 20% sukrose (i 1x PBS) oppløsning i et tomt hetteglass og plasser de rene tredje instar larver i denne løsningen ved hjelp av lange tang. Inkuber dette hetteglasset i en kuvøse på 25 °C i 6 timer før det høstes til disseksjon.
    MERK: 20% sukrose (i 1x PBS) -løsningen tjener som aminosyre-mangelfull sultemedium.

3. Tredje instar larver disseksjon og prøvevevsbehandling

  1. Slip to par #5 tang (se materialfortegnelse) jevnt på begge sider med en slipestein.
  2. Tilsett 400 μL 1x PBS i hver brønn på 9-brønns glassforsenkningspunktplaten og overfør larvene inn i brønnene med lange tang. Plasser en larve i en brønn med dorsalsiden (siden med luftrøret) vendt oppover.
    1. Ta tak i larvens kutikula med to #5 tang midt på larvestammen og riv forsiktig opp neglebåndene. De eksponerte fettlegemene, sammen med andre larvevev, vil fortsatt være festet til larvens. Trekk nok til å eksponere de indre organene så mye som mulig. Gjenta dette trinnet for alle larver.
      MERK: Hver larve har to store biter av feit kropp langs kroppsstammen. Fett kroppsvev er et hvitt, ugjennomsiktig og flatt monolag som lett kan skilles under disseksjonsmikroskopet24.
  3. Overfør larvekadaveret til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA). Inkuber i 30 minutter ved 25 °C uten å riste rørene.
    FORSIKTIG: 4% PFA er giftig. Bruk hansker og masker for beskyttelse.
    MERK: Det anbefales å forberede 4 % PFA i 1x PBS-buffer. PFA-pulver oppløses ikke i 1x PBS umiddelbart. Blandingen må derfor inkuberes ved 65 °C i en inkubator over natten eller ristes periodisk i 45 minutter ved 25 °C.
  4. Etter 30 min inkubering av slaktkroppen med 4% PFA, pipetter ut PFA-løsningen, tilsett 500 μL 1x PBS i røret, og rist røret forsiktig på en flat rotator i 10 minutter før du kaster 1x PBS-løsningen (gjenta 3x).
  5. Bruk lange tanger til å overføre det faste og vaskede larvekadaveret til en brønn i 9-forsenkningspunktplaten fylt med 1x PBS. Ved hjelp av # 5 tang, fjerne alle ikke-fett kroppsvev.
  6. Bruk # 5 tang for å montere bitene av fettlegemet på et mikroskopglass med 80% glyserol som monteringsmedium og legg et deksel på toppen.
    MERK: Før montering, kontroller pH på 80% glyserol (ved bruk av pH-papirer, pH = 7 er optimal) for å beskytte GFP-signalet. Monteringsmedier (se materialfortegnelse) med DAPI i 80% glyserol vil hjelpe til med å avbilde kjernene til fettkroppsceller. Disse lysbildene er stabile i 1 uke når de oppbevares i mørket ved 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Under matede forhold diffunderes det GFP-merkede ubiquitinlignende proteinet, GFP-Atg8a, inne i cellene. Ved sult danner den grønn puncta og merker autofagosomer. Når autofagosomer smelter sammen med lysosomer, slukkes GFP i de sure autolysosomene, og den grønne puncta forsvinner. Hvis autofagi ikke induseres eller autofagosommodningen akselereres, forventes antallet GFP-puncta å være lavt. Imidlertid, hvis fusjonen mellom autofagosomer og lysosomer er blokkert eller pH i autolysosomet blir grunnleggende, forventes antallet og / eller størrelsen på GFP-puncta å være høy.

I protokollen som presenteres her, induserer FLP/FRT-systemet mitotisk rekombinasjon og genererer vev med både villtype og mutante celler. Mens villtypecellene uttrykker RFP, mangler mutantcellene RFP-uttrykk. Ekspresjonen av RFP i alle fettkroppsceller vil indikere at FLP/FRT-mediert mitotisk rekombinasjon ikke ble indusert eller at mutasjonen er celledødelig. I sistnevnte tilfelle (dvs. hvis mutasjonen er celledødelig), forventes larvefettlegemet å ha noen få celler med høyere RFP-signaler enn de omkringliggende cellene.

I figur 2 dannet GFP-Atg8a (grønn) puncta i villtypeceller (rød), noe som antyder at autofagi ble vellykket indusert. I de muterte klonene (RFP-negative) var mønsteret til GFP-Atg8a puncta forskjellig fra mønsteret i de omkringliggende villtypecellene, noe som tyder på autofagidefekter. Svært få GFP-ATG8a puncta ble påvist i Mu1 muterte kloner (figur 2B), noe som indikerer at autofagi var blokkert ved initieringstrinnene eller akselerert autolysosommodning. Antallet og størrelsen på GFP-Atg8a puncta ble kraftig økt i Mu2 mutante kloner (figur 2C), noe som tyder på autofagosom-lysosomfusjon eller autolysosomforsuringsdefekter. Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å skille disse mulighetene. Videre må størrelsene og antall puncta kvantifiseres for å avgjøre om de observerte forskjellene er statistisk signifikante.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentelle prosedyrer for overvåking av autofagimarkøren GFP-Atg8a i en mosaikklarvefettkropp med mutante kloner. Kryssingsskjemaet for å generere fluer som uttrykker GFP-Atg8a i larvefettkroppsvevet og bærer mutante kloner er vist (en stamme med en dødelig punktmutasjon [Mu] på X-kromosomet tjener som et eksempel). Etter varmesjokk ved 37 °C i 1 time for å aktivere FLP-uttrykk, kan de homozygote mutante cellene med GFP-Atg8a-uttrykk genereres i y' w* Mu FRT19A / hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a / + larvefettlegeme. Autofagi induseres i den fete kroppen ved å inkubere larvene i 20% sukroseoppløsning i 6 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mønstrene av GFP-Atg8a puncta i Mu1 og Mu2 kloner var forskjellig fra de i kontrollklonene. Mu1 og Mu2 er to uavhengige dødelige mutanter på X-kromosomet. Isogenisert y 'w *, FRT19A fluer tjene som en kontroll. GFP-Atg8a (grønne) mønstre ble analysert i kontroll-, Mu1- eller Mu2-mosaikklarvefettlegemene. De muterte klonene (eller kontrollklonene) ble negativt markert med RFP (rød). (A) I kontrollklonene (RFP-negative) var mønstrene av GFP-Atg8a puncta lik de i de omkringliggende RFP-positive cellene. (B) I Mu1 mutante kloner (RFP negative) ble GFP-Atg8a puncta sterkt redusert. (C) I Mu2 mutante kloner (RFP negative) ble antallet og størrelsen på GFP-Atg8a puncta økt. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver metodene for å (1) generere fluer som bærer mutante kloner i larvefettlegemene, (2) indusere autofagi gjennom aminosyresult og (3) dissekere larvefettlegemene. For å generere kloner vellykket i larvefettlegemene, må følgende kritiske trinn utføres flittig. (1) Timing av varmesjokket nøyaktig er avgjørende fordi mitotisk rekombinasjon bare skjer når vevet gjennomgår mitose, og (2) både varmesjokktemperatur og varighet er kritiske for å indusere FLP-uttrykk. Et standard vannbad på 37 °C for varmesjokk i 1 time anbefales. Tatt i betraktning den økte muligheten for embryonal / larvedød under varmesjokk og sult, må flere kryssinger settes opp for tilstrekkelig vevsprøvegenerering for avbildning.

I tillegg kan det være nødvendig å endre noen trinn med tanke på de faktiske dyrkingsforholdene. For eksempel kan forskjellene i miljø og Drosophila kulturmedier mellom laboratorier påvirke larvenes veksthastighet. Derfor kan det hende at utviklingstiden som kreves for at embryoer skal nå det tidlige tredje stjernestadiet og varigheten av larvesult (dyrking i 20% sukrose for å indusere autofagi) må standardiseres i hvert laboratorium separat.

GFP-Atg8a er den mest brukte markøren for bestemmelse av autofagi. Endringene i GFP-Atg8a puncta-mønsteret klarer imidlertid ikke å fastslå den nøyaktige autofagidefekten eller det berørte trinnet direkte. Derfor må flere markører analyseres for å tolke slike data nøyaktig. Protokollen som presenteres her kan tilpasses for andre autofagirelaterte proteiner med deres respektive transgene stammer25. Flere markører merket med forskjellige fluorescerende proteiner (for eksempel blått fluorescensprotein [BFP]) kan analyseres samtidig for å belyse initierings- eller fusjonsprosessene. Kontrollert autofagimodifikasjon, ved bruk av kjemikalier26 eller RNA-interferens av kritiske gener27, kan kombineres med den nåværende tilnærmingen for å belyse autofagimekanismer ytterligere. I tillegg er analyse av endogene proteinmarkører for autofagi (ved bruk av immunhistokjemi) i mosaikkvev viktig for å bekrefte fenotypene28.

Selv om autofagi opprinnelig ble anerkjent som en tilfeldig, ikke-selektiv prosess, indikerer økende bevis at den kan være selektiv og selektivt nedbryte cytoplasmatiske organeller som mitokondrier og endoplasmatisk retikulum, blant annet29. Videre kan prosedyren beskrevet her brukes til å utforske selektiv autofagi. For eksempel kan mitofagi overvåkes i fluefettlegemer ved å feste fluorescerende proteiner (som Keima eller GFP-RFP-tandemkoder) til en mitokondriell målrettingssekvens30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for THFC og BDSC for å gi fluestammene. Dr. Tong Chao støttes av National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) og grunnleggende forskningsfond for de sentrale universitetene. Vi takker kjernefasiliteten i Life Sciences Institute (LSI) for å tilby tjenester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
#5 Forceps Dumont RS-5015
9 Dressions Spot plate PYREX 7220-85
Fluorescence Microscope Nikon SMZ1500
Glycerol Sangon Biotech A100854-0100
KCl Sangon Biotech A610440-0500 Composition of 1x PBS solution
KH2PO4 Sangon Biotech A600445-0500 Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula Fisher 14-375-10
Long forceps R' DEER RST-14
Microscope cover glass CITOTEST 80340-1130
Microscope slides CITOTEST 80302-2104
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 Composition of 1x PBS solution
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Petri dish Corning 430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food Tong Lab-made
Stereo microscope Nikon SMZ745
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. 10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vectorlabratory H-1200-10 Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a Tong Lab's fly stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753 (2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767 (2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 186
Analyse av sultindusert autofagi i <em>Drosophila melanogaster</em> larvefettlegeme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, K., Tong, C. Analyzing… More

Shi, K., Tong, C. Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body. J. Vis. Exp. (186), e64282, doi:10.3791/64282 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter