Summary
El análisis de los cambios en la función contráctil y la integridad celular de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC es de inmensa importancia para el desarrollo de fármacos no clínicos. Un sistema híbrido de análisis celular de 96 pocillos aborda ambos parámetros en tiempo real y de manera fisiológica para obtener resultados confiables y relevantes para el ser humano, necesarios para una transición segura a las etapas clínicas.
Abstract
La evaluación de la contractilidad cardíaca es de inmensa importancia para el desarrollo de nuevas terapias y su transición segura a las etapas clínicas. Si bien los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) prometen servir como un modelo relevante para humanos en las fases preclínicas del descubrimiento de fármacos y la farmacología de seguridad, su madurez sigue siendo controvertida en la comunidad científica y en constante desarrollo. Presentamos una tecnología híbrida de contractilidad e impedancia / potencial de campo extracelular (EFP), agregando características significativas de pro-maduración a una plataforma de 96 pocillos estándar de la industria.
El sistema de impedancia/EFP monitorea la funcionalidad celular en tiempo real. Además de la velocidad de latido de las células contráctiles, las lecturas de espectroscopia de impedancia eléctrica detectan cambios morfológicos inducidos por compuestos, como la densidad celular y la integridad de la monocapa celular. En el otro componente del sistema de análisis de células híbridas, las células se cultivan en membranas biocompatibles que imitan el entorno mecánico del tejido cardíaco real. Este entorno fisiológico apoya la maduración de hiPSC-CMs in vitro, lo que lleva a respuestas contráctiles más adultas que incluyen efectos inotrópicos positivos después del tratamiento con isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil. Parámetros como la amplitud de la fuerza de contracción (mN/mm2) y la duración del batido también revelan efectos posteriores de compuestos con influencia en las propiedades electrofisiológicas y el manejo del calcio.
El sistema híbrido proporciona la herramienta ideal para el análisis celular holístico, permitiendo la evaluación preclínica del riesgo cardíaco más allá de las perspectivas actuales de los ensayos basados en células relevantes para el ser humano.
Introduction
Uno de los principales objetivos del desarrollo de fármacos modernos es la mejora de la tasa de éxito de la mesa a la cama de nuevas terapias en la línea de descubrimiento de fármacos. Las pruebas farmacológicas de seguridad de estos nuevos fármacos a menudo revelan reacciones adversas al sistema cardiovascular que representan casi una cuarta parte de la tasa de deserción del fármaco en las etapas preclínicas1. El desarrollo y la integración de nuevas metodologías de enfoque (NAM) desempeñan un papel clave en la modernización de la evaluación preclínica, en particular los órganos centrales de la batería como el corazón. Dado que estas metodologías son enfoques libres de animales, el uso de modelos celulares basados en humanos como los cardiomiocitos (CM) de origen de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se convirtió en el caballo de batalla durante la última década para la evaluación moderna de cuestiones farmacológicas y toxicológicas de seguridad2. Los sistemas de ensayo ampliamente utilizados para tales investigaciones son la matriz de microelectrodos (MEA) y los enfoques experimentales basados en colorantes sensibles al voltaje3.
Sin embargo, la pretendida inmadurez fenotípica y funcional de este tipo celular pone obstáculos en el camino de un modelo celular ideal basado en humanos, con el potencial de reducir las brechas traslacionales entre los estudios no clínicos y clínicos4.
Se han realizado enormes investigaciones a lo largo de los años para comprender la razón del fenotipo inmaduro implícito y para encontrar formas de impulsar el proceso de maduración de los iPSC-CM humanos in vitro.
Se demostró que la falta de señales de maduración cardíaca, como tiempos prolongados de cultivo celular, ausencia de otros tipos celulares en la vecindad o falta de estimulación hormonal, afecta el proceso de maduración5. Además, el ambiente no fisiológico de las placas de cultivo celular regular fue identificado como una causa significativa que impide la maduración de las iPSC-CM humanas, debido a la rigidez del sustrato fisiológico faltante del corazón humano nativo 5,6.
Se desarrollaron diferentes sistemas de ensayo con un enfoque en las condiciones fisiológicas nativas para abordar este problema, incluidos los sistemas de cultivo celular 3D donde las células se alinean tridimensionalmente para parecerse a la arquitectura cardíaca nativa en lugar de los típicos cultivos celulares bidimensionales7. Aunque la maduración mejorada se obtiene con ensayos 3D, la necesidad de una mano de obra calificada y el bajo rendimiento de estos sistemas dificulta un uso abundante de esto en el proceso de desarrollo de fármacos, ya que el tiempo y el costo juegan un papel fundamental en la evaluación de nuevas terapias a nivel financiero8.
Las lecturas importantes para la evaluación farmacológica y toxicológica de la seguridad de nuevas terapias son los cambios en las características funcionales y estructurales de las iPSC-CM humanas, ya que las reacciones adversas del sistema cardiovascular inducidas por compuestos generalmente afectan una o ambas de estas propiedades 1,9. Ejemplos bien conocidos de reacciones adversas tan amplias son los medicamentos contra el cáncer de la familia de las antraciclinas. Aquí, los efectos funcionales y estructurales adversos peligrosos sobre el sistema cardiovascular son ampliamente reportados durante y después del tratamiento del cáncer en pacientes, así como con ensayos basados en células in vitro 10,11.
En el presente estudio, describimos una metodología integral para la evaluación de los efectos secundarios compuestos funcionales y estructurales en los hiPSC-CM. La metodología incluye el análisis de la fuerza contráctil de los cardiomiocitos y el análisis de impedancia/potencial de campo extracelular (EFP). La fuerza contráctil se mide en condiciones mecánicas fisiológicas, con las células cultivadas en sustratos de silicona blanda (33 kPa), lo que refleja el entorno mecánico del tejido cardíaco humano nativo.
El sistema está equipado con placas de 96 pocillos para el análisis de alto rendimiento de iPSC-CM humanos para estudios farmacológicos y toxicológicos preclínicos de seguridad cardíaca, y por lo tanto proporciona una ventaja a los enfoques 3D utilizados actualmente como el corazón de Langendorff o los cortes de corazón12,13.
En detalle, el sistema híbrido consta de dos módulos, ya sea para la evaluación de la contractilidad cardíaca en condiciones fisiológicas o para el análisis de la toxicidad estructural celular en tiempo real 6,14. Ambos módulos funcionan con placas especializadas de 96 pocillos de alto rendimiento para una adquisición de datos rápida y rentable.
Sin la necesidad de una construcción 3D, el módulo de contractilidad emplea placas especiales que contienen membranas de silicona flexibles como sustrato para las células en lugar del vidrio rígido o plástico en el que generalmente consisten las placas de cultivo celular regulares. Las membranas reflejan las propiedades biomecánicas típicas del corazón humano y, por lo tanto, imitan las condiciones in vivo de una manera de alto rendimiento. Mientras que las iPSC-CM humanas a menudo no muestran un comportamiento cardiomiocitario adulto con respecto a la inotropía positiva inducida por compuestos en otros ensayos basados en células14, se puede evaluar una reacción más adulta cuando las células se cultivan en las placas del módulo de contractilidad. En estudios previos, se ha demostrado que los iPSC-CM exhiben efectos inotrópicos positivos sobre el tratamiento con compuestos como isoproterenol, S-Bay K8644 u omecamtiv mecarbil 6,15. Aquí, se pueden evaluar múltiples parámetros de contractilidad, como parámetros primarios como la amplitud de la fuerza de contracción (mN / mm2), la duración del latido y la frecuencia de latido, así como parámetros secundarios del ciclo de contracción como el área debajo de la curva, las pendientes de contracción y relajación, las variaciones de la frecuencia de latido y las arritmias (Figura complementaria 1)16 . Los cambios inducidos por fármacos en todos los parámetros se evalúan de forma no invasiva mediante detección de distancia capacitiva. Los datos en bruto son analizados posteriormente por un software especializado.
El módulo de toxicidad estructural añade sus parámetros únicos de impedancia y EFP como lectura para la toxicidad celular estructural y el análisis de propiedades electrofisiológicas17,18. La tecnología de espectroscopia de impedancia eléctrica revela cambios inducidos por compuestos en la densidad celular o la integridad celular y monocapa monitoreados en tiempo real, como se muestra con iPSC-CMs humanos tratados con compuestos cardiotóxicos conocidos13. Con lecturas de impedancia a diferentes frecuencias (1-100 kHz) es posible diseccionar aún más una respuesta fisiológica, y así revelar cambios en la topografía de la membrana, las uniones célula-célula o célula-matriz es alcanzable. El registro adicional de EFP de iPSC-CMs humanas permite además el análisis de los efectos electrofisiológicos provocados por el tratamiento compuesto, como se demostró a la luz del estudio CiPA17,19.
En el presente estudio, se emplearon iPSC-CM humanos, tratados con epirrubicina y doxorrubicina, ambas bien descritas como antraciclinas cardiotóxicas, y erlotinib, un inhibidor de la tirosina cinasa (TKI) con un riesgo bastante bajo de toxicidad cardiovascular. La evaluación crónica con epirrubicina, doxorrubicina y erlotinib se realizó durante 5 días. El resultado muestra cambios menores en la contractilidad y la impedancia de base cuando las células fueron tratadas con erlotinib, pero una disminución tóxica dependiente del tiempo y la dosis en la amplitud de contracción y la impedancia de base cuando se trataron con epirrubicina y doxorrubicina respectivamente. Las mediciones agudas se realizaron con el bloqueador de los canales de calcio nifedipino y muestran una disminución en la amplitud de la contracción, la duración del potencial de campo y la impedancia base, demostrando efectos secundarios cardiotóxicos de este compuesto a nivel funcional y estructural.
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Protocol
NOTA: El flujo de trabajo para la medición de contractilidad e impedancia/EFP se da en la Figura complementaria 2.
1. Revestimiento de la placa
- Abra el envase sellado al vacío y saque la placa de 96 pocillos. Los procedimientos de manipulación para las placas de 96 pocillos de ambos módulos son los mismos. Deje la placa de contracción cubierta por el protector de membrana suministrado adicionalmente hasta la medición en el módulo de contractilidad.
- Cubra las placas flexibles de 96 pocillos para sembrar cardiomiocitos.
- Prepare una solución diluida de recubrimiento de gel EHS transfiriendo 2,75 ml de solución de gel EHS lista para usar en un tubo centrífugo estéril. Luego agregue 8.25 ml de DPBS con Ca 2+ y Mg2+. Mezcle la solución cuidadosamente.
NOTA: Opcionalmente, la fibronectina también se puede utilizar para recubrir los pocillos: preparar 13 ml de solución de recubrimiento de fibronectina en un tubo de centrífuga estéril diluyendo 650 μL de solución madre de fibronectina (1 μg/ml) en 13 ml de DPBS con Ca 2+ y Mg2+, lo que resulta en una solución de trabajo de 50 μg/ml. Mezcle la solución cuidadosamente.
- Prepare una solución diluida de recubrimiento de gel EHS transfiriendo 2,75 ml de solución de gel EHS lista para usar en un tubo centrífugo estéril. Luego agregue 8.25 ml de DPBS con Ca 2+ y Mg2+. Mezcle la solución cuidadosamente.
- Transfiera la solución de recubrimiento a un depósito de reactivo estéril colocado en el robot de automatización de laboratorio.
- Agregue 100 μL de la solución de recubrimiento por pocillo con el robot de automatización de laboratorio utilizando el programa "ADD100μL". Volver a colocar la tapa sobre la placa de 96 pocillos e incubar durante 3 h a 37 °C.
NOTA: El programa para el robot de automatización de laboratorio debe preajustarse manualmente de antemano.
2. Siembra de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC en placas flexibles de 96 pocillos (Día 0)
- Descongele las células de acuerdo con las pautas del fabricante.
- Cuente las celdas con una cámara de conteo manual y ajuste las celdas en el medio de recubrimiento recomendado de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la celda (por ejemplo, 1 x 105 celdas / pocillo), lo que resulta en 11 x 106 celdas / 11 ml para sembrar una placa completa de 96 pocillos.
- Retire la solución de gel EHS de los pocillos con el robot de automatización de laboratorio utilizando el programa "REMOVE100μL". Retire del robot el depósito de reactivo que contiene la solución de recubrimiento dispensada.
- Transfiera la suspensión celular (11 ml en total) a un depósito de reactivo estéril colocado en el robot de automatización de laboratorio y siembre las células con 100 μL / pocillo utilizando el programa "CELLS_ADD100 μL".
- Inmediatamente después de la siembra celular, transfiera la placa flexible de 96 pocillos a la incubadora (37 °C, 5%CO2, humedad controlada) y deje que las células se asienten durante la noche.
3. Intercambio medio de placas flexibles de 96 pocillos (Día 1)
- Calentar al menos 22 ml de medio de mantenimiento de cardiomiocitos por placa a 37 °C en un tubo de centrífuga de 50 ml, 18-24 h después de sembrar las placas.
- Transfiera el medio fresco (al menos 22 ml) a un depósito de reactivo estéril y déjelo justo al lado del robot de automatización de laboratorio. Coloque un depósito de reactivo vacío en el robot y realice la eliminación del medio con el programa "REMOVE100μL". Posteriormente, cambie el depósito de reactivo que contiene el medio de desecho con el depósito de reactivo que contiene el medio fresco y dispense 200 μL del medio fresco por pocillo con el programa "ADD100μL". Realice este paso dos veces para alcanzar los 200 μL/pocillo.
- Inmediatamente después del intercambio medio, transfiera la placa de nuevo a la incubadora.
- Realizar un intercambio medio (200 μL/pocillo) cada dos días hasta la adición del compuesto.
4. Intercambio final del medio antes de la adición compuesta (Día 5-7)
- Realizar un cambio final del medio 4-6 h antes de la adición del compuesto.
- Calentar al menos 22 ml de tampón de ensayo para una placa flexible de 96 pocillos. El tampón del ensayo consiste en un medio de mantenimiento o derivados del mismo (por ejemplo, medios séricos bajos/nulos, medios libres de rojo de fenol u otros tampones isotónicos).
- Transfiera el medio fresco a un depósito de reactivo estéril y déjelo justo al lado del robot de automatización de laboratorio. Coloque un depósito de reactivo vacío en el robot y realice la eliminación del medio. Posteriormente, cambie el depósito de reactivo que contiene el medio de desecho con el depósito de reactivo que contiene el medio fresco y dispense 200 μL/pocillo del medio fresco.
- Inmediatamente después del intercambio de medios, transfiera la placa flexible de nuevo a la incubadora.
5. Adición de compuestos y registro de datos (Día 5-7)
NOTA: Un ejemplo de plan de medición para el experimento se da en la Figura Suplementaria 3.
- Prepare la solución de trabajo por compuesto a una concentración 4x en la campana de flujo laminar utilizando una placa de pocillo regular estéril de 96 profundidades. La solución compuesta se basa en el tampón de ensayo utilizado en el paso 4. Transfiera la placa de pocillo de 96 profundidades que contiene la solución compuesta durante al menos 1 h a la incubadora para ajustarla a las mismas condiciones que la placa flexible.
NOTA: La concentración 1x de cada fármaco utilizado para cada experimento se proporciona en las figuras y leyendas. - Transfiera la placa al dispositivo de medición respectivo 1 h antes de realizar una medición de referencia.
- Abra Edit Protocol en el software de control (parte del sistema de análisis de células híbridas) y seleccione la contractilidad o impedancia / EFP del modo de medición correspondiente.
- Defina la duración del barrido (longitud de una medición; por ejemplo, 30 s) y el intervalo de repetición (tiempo entre mediciones; por ejemplo, 5 min) y guarde el número de protocolo.
- Seleccione Iniciar protocolo > Continuar y rellene los campos solicitados.
- Por último, seleccione Iniciar medición. Realice un mínimo de tres mediciones de referencia (barridos) en intervalos de 5 minutos poco antes de la adición del compuesto.
NOTA: En la Figura complementaria 4 se representan datos de ejemplo de una medición de línea base de contractilidad utilizando el módulo de contractilidad antes de la adición de compuestos. - Retire 50 μL del tampón de ensayo de cada pocillo sin retirar la placa flexible de 96 pocillos del dispositivo de medición.
- Añadir 50 μL de la solución compuesta concentrada 4x en cada pocillo de la placa, de acuerdo con el plan de medición.
- Seleccione Agregar marcador de región y defina el diseño de la placa compuesta y el volumen de la solución compuesta después de la adición compuesta.
- Finalmente, seleccione Proceder con la medición estándar o Continuar con la serie de medición de acuerdo con el plan experimental.
6. Análisis de datos
- Con el software de grabación, mida los barridos, cuya duración e intervalo de repetición son definidos por el usuario.
- Con el software de análisis, capture la forma de la señal leyendo parámetros como la amplitud, la frecuencia de latido, el ancho del pulso, etc., automáticamente.
NOTA: Una señal promediada que incluye la desviación estándar, el llamado latido medio, se calcula automáticamente en función de los datos de un barrido. El usuario puede definir los parámetros de contractilidad/IMP/EFP que el software calcula y muestra. - Con el software de análisis calcule la curva dosis-respuesta e IC50/EC50 para cada compuesto.
NOTA: Los datos sin procesar y los resultados del análisis generados con el software de análisis se pueden exportar fácilmente en una variedad de formatos. Finalmente, los informes de datos se generan automáticamente para resumir y archivar los resultados experimentales. Una descripción completa de qué y cómo se mide una señal EFP se discute en 17.
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Representative Results
Los efectos del inhibidor de la quinasa erlotinib sobre la contractilidad de los hiPSC-CM se muestran en la Figura 1. Las células fueron tratadas con concentraciones que oscilaron entre 10 nM y 10 μM durante 5 días y los parámetros de latido se registraron diariamente. Erlotinib, un EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) e inhibidor de la tirosina cinasa con un riesgo comparativamente bajo de cardiotoxicidad, tuvo una dosis menor y un efecto dependiente del tiempo sobre hiPSC-CM solo a concentraciones en el rango micromolar. A la concentración más baja (10 nM), erlotinib indujo una disminución estadísticamente insignificante de la amplitud en la primera medición después de la aplicación del compuesto (1 h). En todas las mediciones posteriores, no se midió ningún efecto comparable a esta concentración. La disminución transitoria podría ser el resultado de un efecto compuesto, pero también el resultado de una distorsión transitoria del patrón de latido durante el procedimiento de adición de compuestos, por ejemplo, de naturaleza térmica o mecánica. Las concentraciones micromolares de erlotinib mostraron efectos cardiotóxicos leves pero significativos dependientes del tiempo y la dosis. El inicio del efecto se observó a partir de 96 h con erlotinib de 1 μM, mientras que 10 μM resultó en una disminución significativa solo 24 h después de la adición del compuesto.
El agente quimioterapéutico epirrubicina tuvo un efecto dependiente del tiempo y de la dosis sobre los CM-hiPSC (Figura 2). Las células dejaron de latir dentro de las 24 h después de la aplicación de epirrubicina 10 μM. Con 1 μM, una disminución drástica de la amplitud al 44% ± el 2% del control después de 24 h fue seguida por el cese completo del latido hasta 48 h después de la adición del compuesto. A 100 nM, se observó una disminución dependiente del tiempo en la amplitud del latido durante un período de 5 días con una amplitud residual del 25% ± 3% el día 5. A la concentración más baja de 10 nM, el efecto de la epirrubicina fue sólo dependiente de la dosis pero no dependiente del tiempo, comenzando en la primera medición (1 h después de la adición del compuesto). La amplitud fluctuó constantemente entre el 60% y el 80% del control durante el período de 5 días. Las desviaciones en este grupo fueron mayores en comparación con las concentraciones más altas. Una posible razón podría ser el hecho de que esta concentración tuvo un efecto medible solo en una parte de los pozos.
La doxorrubicina es otra clase de medicamento antraciclina, y la vitalidad celular de hiPSC-CM se investigó mediante el monitoreo de la impedancia de la base a lo largo del tiempo. La Figura 3 muestra que una exposición de 24 h a doxorrubicina 300, 1, 3 y 10 μM disminuye la viabilidad celular de una manera dependiente de la concentración y el tiempo.
Nifedpinie es un bloqueador de los canales de calcio dihidropiridínico que bloquea principalmente los canales de calcio de tipo L. El monitoreo a largo plazo durante 24 h de viabilidad celular revela una disminución dependiente del tiempo y la concentración de la impedancia de base que se utiliza como medida de toxicidad (Figura 4A). Tras la aplicación de concentraciones crecientes de nifedipino (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM), los registros de potencial de campo en hiPSC-CM revelan un acortamiento dependiente de la concentración de la duración del campo normalizado (FPD) como se esperaba (Figura 4B, C). La evaluación de nifedipino con respecto a la contractilidad cardíaca también mostró una disminución significativa de la amplitud dependiente de la concentración en la medición aguda con concentraciones de 10 nM y 30 nM (Figura 5).
Los resultados obtenidos con el sistema de análisis de células híbridas demuestran que tres criterios de valoración cardíacos (contractilidad, estructura y electrofisiología) de hiPSC-CM pueden evaluarse utilizando un solo sistema.
Figura 1: Evaluación de la contractilidad de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC tratados con erlotinib durante 5 días. El eje x muestra el tiempo en horas, el eje y traza la amplitud de los parámetros en términos de porcentaje. Los asteriscos representan significación estadística con p < 0,05 (*) o p < 0,01 (**) (prueba de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la contractilidad de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC tratados con antraciclina epirrubicina cardiotóxica durante 5 días. El eje x muestra el tiempo en horas, el eje y traza la amplitud de los parámetros en términos de porcentaje. Los asteriscos representan significación estadística con p < 0,05 (*) o p < 0. 01 (**) (prueba de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Impedancia base de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC después del tratamiento con doxorrubicina. Evolución temporal de la impedancia base de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC para una exposición de 24 h a doxorrubicina de 300, 1, 3 y 10 μM (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Registros de impedancia y EFP de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC. (A) Evolución temporal de la impedancia base de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC durante 24 h, tras la exposición a nifedipino 3, 10, 30 y 100 nM (n = 5). (B) Evolución temporal de la duración potencial de campo de los cardiomiocitos humanos derivados de iPSC durante 1 h, tras la exposición a 3, 10, 30 y 100 nM de nifedipino (n = 5). (C) Disposición del electrodo de la impedancia / placa EFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación de la contractilidad (módulo de contractilidad) de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC tratados con nifedipino durante 20 min. El eje x muestra el tiempo en min, el eje Y traza la amplitud de los parámetros en términos de porcentaje. Los asteriscos representan significación estadística con p < 0. 05 (*) o p < 0,01 (**) (prueba de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Parámetros de contractilidad y datos brutos evaluados con el módulo de contractilidad. (Izquierda) Parámetros evaluados con el módulo de contractilidad. Parámetros: Amplitud de la fuerza de contracción (mN/mm2), duración del latido, carrera ascendente y descendente, carrera ascendente y área de carrera descendente bajo curva (AUC), frecuencia de latido, variaciones de la frecuencia de latido, eventos arrítmicos. (Derecha) Registros de datos brutos de contractilidad de un pozo con cardiomiocitos no tratados (A) frecuencia de latido, (B) variaciones de frecuencia de latido, (C) temprano después de las contracciones y (D) eventos arrítmicos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Flujo de trabajo para la medición de contractilidad e impedancia/EFP. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Ejemplo de diseño de un plan de medición para una placa de 96 pocillos. Se representan cuatro compuestos (resaltados en rojo, verde claro, marrón y verde oscuro) con cuatro concentraciones y cuatro réplicas. Los controles positivos y negativos (p. ej., condiciones previas al cultivo y DMSO) se resaltan en amarillo. Las celdas de respaldo se resaltan en azul. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: Datos de ejemplo de una medición de línea base de contractilidad utilizando el módulo de contractilidad antes de la adición del compuesto. En cada gráfico se representa el promedio de todos los ciclos de contracción de un barrido. Para visualizar la frecuencia de latido, se muestran dos contracciones consecutivas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El sistema híbrido de impedancia/EFP/contractilidad es una metodología integral para la evaluación farmacológica y toxicológica de seguridad de alto rendimiento de las responsabilidades cardíacas para el desarrollo preclínico de fármacos. Proporciona un enfoque moderno para las pruebas de seguridad preclínicas sin el uso de modelos animales, pero con mayores capacidades de rendimiento que reducen significativamente el tiempo y los costos. Este sistema tiene el potencial de ser utilizado como un enfoque complementario para el corazón de Langendorff y otros modelos animales para la evaluación preclínica de toxicidad funcional y estructural.
Como enfoque libre de animales, se emplean iPSC-CM humanos para el sistema híbrido20. Aquí, las placas flexibles especiales de 96 pocillos con el efecto de promaduración en iPSC-CMs humanas proporcionan una ventaja importante en comparación con otros ensayos basados en células21,22, ya que el rendimiento y un ambiente fisiológico se combinan de manera única para una evaluación del riesgo cardíaco humano más similar a la de los adultos 6,15.
El paso más crítico en el protocolo es la aplicación del compuesto, especialmente cuando se deben examinar los efectos agudos. Dado que las células se cultivan sobre sustratos blandos que conducen fuerzas mecánicas, la aceleración excesiva durante la manipulación de la placa y la aplicación de fuerzas de cizallamiento durante el pipeteo pueden dar lugar a alteraciones transitorias (5-10 min) de los parámetros de contracción y deben evitarse. En general, se debe tener cuidado durante los reemplazos de medios para evitar la interrupción de las membranas. Se recomienda el uso de equipos de automatización de laboratorio.
Antes de realizar el análisis del compuesto, se requiere un paso previo al cultivo de 5-7 días, para que los iPSC-CM humanos, generalmente adquiridos en estado criopreservado, puedan recuperarse del procedimiento de descongelación y construir un sincitio adecuado. Para ambos módulos, la amplitud de contracción, así como la velocidad de latido, dan una idea del punto de partida ideal de la medición que generalmente ocurre entre los días 5-7. La medición basal es un paso crítico para identificar las características basales funcionales utilizadas como criterios de inclusión para los MC-hiPSC estudiados3. Los valores basales deben registrarse justo antes del tratamiento compuesto para que los cambios en el comportamiento de contracción puedan compararse con condiciones sin tratamiento (Figura complementaria 3).
Tener en cuenta las variabilidades y tener características de referencia definidas es clave para las mediciones exitosas de hiPSC-CM y la interpretación de los datos. Por esta razón, las recomendaciones de mejores prácticas de Gintant et al., se siguen utilizando el sistema de análisis de células híbridas; Por ejemplo, la línea de base debe registrarse antes de la adición del compuesto, y el registro de línea base debe cumplir ciertos requisitos previos3.
Aunque las placas flexibles de 96 pocillos están equipadas con membranas frágiles, una placa protectora proporcionada en combinación con un manejo cuidadoso evitará daños. Las membranas se tratan previamente para permitir una unión estable de las células al sustrato de silicona, que tiene una baja biocompatibilidad intrínseca. El tratamiento es estable durante al menos 6 meses. Mientras que las células se mantienen constantemente a 37 °C, las propiedades mecánicas de los materiales de silicona son estables en un amplio rango de temperaturas. Además, ni los fármacos ni los disolventes afectan las propiedades de la silicona en las concentraciones utilizadas en los ensayos basados en células (por ejemplo, las concentraciones de DMSO permanecen por debajo del 0,1%).
El sistema fue validado y optimizado con una amplia gama de hiPSC-CM disponibles comercialmente. Cuando se utilizan células hechas a medida, se recomienda probar proteínas estándar de matriz extracelular (ECM) para una unión celular óptima (por ejemplo, fibronectina, matriz EHS y poli-L-lisina 6,15).
La electrofisiología, la señalización del calcio y la contractilidad son los tres principales criterios de valoración cardíacos que se abordan en el desarrollo preclínico. El sistema híbrido se limita actualmente a analizar dos de estos criterios de valoración cardíacos: contractilidad y electrofisiología. La señalización del calcio en los cardiomiocitos no puede analizarse directamente, sino detectarse tangencialmente a través de la contractilidad y las propiedades electrofisiológicas.
Tanto la impedancia / EFP como la medición de la fuerza de contracción se realizan con monocapas de cardiomiocitos. A pesar de la ventaja de una rigidez mecánica fisiológica del sustrato durante la medición de la contracción, las células no experimentan el entorno tridimensional del tejido humano real. Por otro lado, esto permite el uso de solo una fracción de los costosos modelos de células derivadas de células madre con equipos de laboratorio estándar. Por lo tanto, esta aplicación promete tener una relación favorable de costo, robustez y predictividad en comparación con los modelos in vivo / ex vivo o 3D. Las aplicaciones futuras del sistema híbrido pueden incluir el análisis de otros tipos de células contráctiles, como las células musculares lisas. En la regulación de la homeostasis cardiovascular, estas células juegan un papel importante como contrapartes de los cardiomiocitos. El sistema híbrido también proporciona complementos para proyectos específicos, como la estimulación óptica de iPSC-CM humanos. Para este propósito, se puede aplicar una tapa óptica dedicada a ambos módulos para la estimulación de iPSC-CM humanos que fueron transfectados con canalrodopsina-2 durante los tiempos de precultivo.
Por lo tanto, el sistema híbrido de impedancia / EFP / contractilidad permite la evaluación moderna de la seguridad preclínica y la toxicidad mediante el análisis de tres puntos finales cardíacos diferentes (contractilidad, cambios estructurales y electrofisiología) dentro de una metodología. La ventaja de abordar estos criterios de valoración con un modelo de células cardíacas basado en humanos en un alto nivel de rendimiento eleva este sistema híbrido más allá de las perspectivas actuales de la evaluación preclínica del riesgo cardíaco.
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Disclosures
B.L., M.Go. y P.L. trabajan en innoVitro GmbH, fabricante de las placas flexibles. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. y S.S. trabajan en Nanion Technologies GmbH, fabricante del dispositivo híbrido.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio Federal Alemán de Asuntos Económicos y Acción Climática (ZIM) y del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (KMUinnovativ). Agradecemos a FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EE. UU.) por proporcionar amablemente cardiomiocitos y a Ncardia B.V. (Leiden, Países Bajos) por proporcionar amablemente cardiomiocitos, utilizados en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
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