Summary
Denne protokollen beskriver en intervensjonsradiologisk prosedyre etablert for intratymisk injeksjon hos mus for å unngå risikoen for åpen kirurgi og forbedre nøyaktigheten av blinde perkutane injeksjoner.
Abstract
Intratymisk injeksjon i musemodeller er en viktig teknikk for å studere tymisk og immunfunksjon, inkludert genetiske og ervervede T-celleforstyrrelser. Dette krever metoder for direkte avsetning av reagenser og/eller celler i thymus hos levende mus. Tradisjonelle metoder for intratymisk injeksjon inkluderer thoraxkirurgi eller minimalt invasive perkutane blinde injeksjoner, som begge har betydelige begrensninger. Ultrahøyfrekvente ultralydavbildningsenheter har gjort bildestyrte perkutane injeksjoner mulig hos mus, noe som forbedrer injeksjonsnøyaktigheten til perkutan injeksjonsmetode og muliggjør injeksjon av mindre mål. Bildestyrte injeksjoner er imidlertid avhengige av bruk av et integrert skinnesystem, noe som gjør dette til en stiv og tidkrevende prosedyre. En unik, sikker og effektiv metode for perkutan intratymisk injeksjon hos mus er presentert her, og eliminerer avhengigheten av skinnesystemet for injeksjoner. Teknikken er avhengig av å bruke en høyoppløselig mikro-ultralydsenhet for å avbilde musen thymus ikke-invasivt. Ved hjelp av en frihåndsteknikk kan en radiolog plassere en nålespiss direkte inn i musmusen under sonografisk veiledning. Mus rengjøres og bedøves før avbildning. For en erfaren radiolog som er flink til ultralydveiledede prosedyrer, er læringsperioden for den oppgitte teknikken ganske kort, vanligvis innen en økt. Metoden har lav sykelighet og dødelighet for musene og er mye raskere enn dagens mekanisk assisterte teknikker for perkutan injeksjon. Det gjør det mulig for etterforskeren å effektivt utføre presise og pålitelige perkutane injeksjoner av thymuser av hvilken som helst størrelse (inkludert svært små organer som thymus av eldre eller immundefekte mus) med minimal stress på dyret. Denne metoden muliggjør injeksjon av individuelle lober om ønskelig og letter store eksperimenter på grunn av prosedyrens tidsbesparende natur.
Introduction
Thymus har en viktig rolle i T-celleutvikling og immunitet. T-cellemangel, som blant annet kan skyldes tymisk involusjon, genetiske lidelser, infeksjoner og kreftbehandlinger, fører til høy dødelighet og sykelighet 1,2. Musemodeller er uunnværlige i både grunnleggende og translasjonell immunologiforskning og har blitt brukt i flere tiår for å studere tymisk biologi og T-celleutvikling, samt å utvikle behandlinger for de som lider av tymisk dysfunksjon og T-cellemangel 3,4,5.
En sentral del av tymiske undersøkelser har vært intratymisk injeksjon av biologisk materiale som celler, gener eller proteiner i musemodellene 6,7,8,9,10,11,12. Konvensjonelle intratymiske injeksjonsmetoder bruker torakotomi etterfulgt av intratymisk injeksjon under direkte visualisering eller ved "blind" perkutan injeksjon i mediastinum. Den kirurgiske tilnærmingen øker blant annet pneumothorax-risikoen betydelig. Videre resulterer det forhøyede stresset under denne operasjonen i immunsuppresjon, og dermed potensielt kompromitterer immunologiske data13. Erfarne forskere, etter litt praksis, kan utføre blind injeksjonsteknikk, men denne tilnærmingen er mindre nøyaktig og begrenser derfor eksperimentelle til unge mus med stor tymus.
Bruken av ultralydveiledning er introdusert som et presist og minimalt invasivt alternativ til tradisjonelle intratymiske injeksjonsmetoder14. Denne prosedyren er imidlertid svært tidkrevende når du bruker det integrerte skinnesystemet i stedet for frihåndsteknikken. Å utføre injeksjoner med injeksjonsfestet krever nøye bildeoptimalisering og posisjonering av transduseren ved hjelp av de forskjellige vedleggene som transduserstativet og -monteringen, X-, Y- og Z-posisjoneringssystemet, samt dyktig drift av mikromanipuleringskontrollene og skinnesystemutvidelsene. En enkel alternativ teknikk, ultralydstyrt tymisk injeksjon, presenteres her av en radiolog ved hjelp av en frihånds tilnærming15, som både er et raskt og nøyaktig minimalt invasivt alternativ til de ovenfor beskrevne metodene. Det er viktig at den nåværende tilnærmingen kan utføres med et hvilket som helst høyoppløselig ultralydbildesystem uten å trenge et injeksjonsfeste og integrert skinnesystem. Det er spesielt nyttig for studier som krever injeksjon av et stort antall mus11, for eksperimenter som involverer injeksjon av begge tymiske lober, eller for nøyaktig injeksjon av små thymuser i alderen, bestrålt eller immunkompromitterte mus12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer for dyrepleie ved Center for Discovery and Innovation (IACUC protokoll 290). For denne studien, C57BL / 6 mus (kvinne, 4-6 uker gammel), C57BL / 6 mus (kvinne, 6 måneder gammel), J: NU kvinnelige mus, NOD scid gamma (NSG) kvinnelige mus og B6; CAG-luc, -GFP-mus ble brukt som henholdsvis ung musemodell, alderen musemodell, akymisk nakenmodell, immunsviktmodell og bioluminescenscellekilde. Musene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell). Denne prosedyren vil vanligvis kreve to personer (en for å forbli steril mens du utfører injeksjonene og en annen for å håndtere musene).
1. Forberedelse av dyr
- Indusere anestesi hos musene ved bruk av 3% -4% isoflurangass og opprettholde anestesi ved bruk av 1% -3% isoflurangass administrert via nesekegle og presisjonskalibrert fordamper (se materialtabell).
- Bekreft riktig bedøvelsesdybde/bevisstløshet ved å ikke svare på bakpoteklemmen.
- Fjern pelsen fra musens fremre brystområde ved å påføre et tynt lag med hårfjerningskrem i mindre enn 1 min. Bruk et vått papirhåndkle for å fjerne kremen helt sammen med den løse pelsen.
MERK: Påføring av for mye krem vil føre til at huden i brystområdet blir betent. - Plasser en mus om gangen, liggende, på den oppvarmede plattformen til den lille ultralydbildestasjonen for små dyr (se Materialtabell) med nesekjeglen på plass (figur 1).
- Fest musen til scenen med medisinsk tape på bak- og forbenene (figur 1).
- Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørking av hornhinnen.
- Desinfiser den pelsfrie øvre thoraxhuden ved hjelp av en klorhexidinglukonatapplikator (se materialtabell).
2. Forberedelse av ultralydsmaskinen og det sterile feltet
- Aktiver den høyeste frekvens lineære sonden som er tilgjengelig, vanligvis sonden med høyest romlig oppløsning for størrelsen på dyret som blir avbildet. Aktiver sonden ved å trykke på den tilsvarende knappen etter oppstartsskjermen.
MERK: For denne applikasjonen med mus er sonden som brukes designet spesielt for bruk med mus og små rotter (se Materialtabell). - Optimaliser ultralydinnstillingene for avbildning og injeksjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Juster dybdeskarpheten til en passende størrelse for måldyret ved å justere de vertikalt orienterte glidebryterne på høyre side av skjermen (figur 2). Maksimal dybdeinnstilling vil typisk være ca 6-8 mm for unge mus.
- Juster gråtoneforsterkningen ved å skyve knappen langs den vannrette linjen nederst på skjermen (figur 2). Målet er å starte med et bilde som bare er litt mørkere enn et typisk "grått" utseende.
- Juster fokussonen (blå pil til høyre på skjermen, figur 2) til det forventede nivået på thymus. For unge mus vil dette være rundt en dybde på 4 mm.
- Hvis bildeopptak er ønskelig, kan du teste funksjonaliteten til butikkbildet og lagre klippknappene for å sikre at bildene kan lagres på riktig måte gjennom hele prosedyren. Utfør dette ved å trykke på Lagre klipp-knappen nederst til høyre på skjermen eller ved å trykke på Frys-knappen , og deretter trykke på Lagre bilde (figur 2).
- Påfør en liten mengde (~ 1 ml) ultralydgel på transduseroverflaten (se materialtabell) mens den er oppreist, enten hvilende i ultralydmaskinholderen eller i hendene på en assistent.
- Forbered et lite sterilt felt ved siden av den oppvarmede plattformen. Den optimale posisjoneringen for dette er vanligvis mellom plattformen og ultralydsmaskinen.
- Tøm disse elementene på det sterile feltet: et sterilt sondedeksel, gummibånd, sterile hansker og steril ultralydgel (se materialtabell).
- Med det sterile feltet satt opp og gjenstander på plass, ta på deg de sterile hanskene.
- Plasser forsiktig det sterile sondedekselet over ultralydtransduseren (samt over gelen som opprinnelig ble plassert på sonden). Oppretthold steriliteten og berør bare det sterile dekselet, ingenting annet. Skyv det sterile gummibåndet over det sterile sondedekselet for å holde det på plass.
MERK: Luftfokuset, uavhengig av størrelse, kan forstyrre ultralydavbildning. Derfor er det viktig å påføre ultralydgelen mellom transduseren og det sterile sondedekselet, og på toppen av sondedekselet for å sikre et luftfritt grensesnitt mellom ultralydssonden og dyret. - Plasser en moderat mengde (2-3 ml) steril ultralydgel på transduseren.
MERK: Brukeren er nå klar til å avbilde en bedøvet mus.
3. Avbildning og lokalisering av thymus
- Mens du opprettholder steriliteten, plasser ultralydgel-toppet sonde vertikalt på den desinfiserte delen av musens fremre brystvegg for første avbildning.
- Ta deg tid til å se på ultralydbildet og optimalisere det ytterligere. Gå tilbake til trinn 2.2 og juster for å få et utseende som ligner på figur 3.
- Skann musens fremre bryst i et tverrplan. Utfør dette ved å holde transduseren vertikalt og flytte den opp og ned fra nakken til magen i en pensellignende eller "feiende" bevegelse.
MERK: Hjertet vil være den mest gjenkjennelige strukturen i brystet på grunn av sin raske bevegelse og "kammer" utseende. Når hjertet er lokalisert, kan dette brukes som et referansepunkt for å skaffe seg et bilde av thymus. - Med hjertet sentrert i synsfeltet, fei transduseren litt mot nakken. Bare overlegen hjertet, er thymus vanligvis oppstått.
- Visualiser thymus som en bilobed, pyramidal, hypoechoic ("mørk" eller "svart" som vises på skjermen) struktur som er sentrert i midtlinjen, fremre til aorta og bakre til brystbenet (figur 3A).
- Noter de to runde parrede svarte (dvs. "hypoechoic") strukturer på hver side av øvre bryst.
MERK: Dette er den bilaterale venae cavae. Aorta er en lignende krøllete hypoekkoisk struktur i midtlinjen mellom de to venae cavae. Disse er lett gjenkjennelige ved deres pulsatile bevegelse.
4. Injeksjon av thymus
- Om nødvendig, bruk mer (2-3 ml) steril ultralydgel til transduseren.
MERK: En relativt stor mengde steril gel på transduseren (sammenlignet med størrelsen på musethoraxen) vil fungere som en "gelpute" rundt musens brystvegg. Dette vil redusere antall ultralydartefakter laget av luft innenfor synsfeltet. - Ved hjelp av ultralydssonden, finn den bredeste delen av thymus, som vanligvis er det ideelle målstedet for injeksjon. Forvent en horisontal nålbane på det valgte stedet.
- Legg merke til hvor de store blodkarene (SVC og aorta) ligger på dette stedet. Unngå disse under injeksjonen.
- Blodkarene vil være hypoekkoiske, pulsatile strukturer, som beskrevet i trinn 3.7. Hvis du er usikker, bruk fargedopplermodus for å se etter flyt i karene (figur 4A). Aktiver fargedopplermodus ved å trykke på Farge-knappen på skjermen.
- Hvis en av de store blodårene (eller hjertet) forventes å være langs den forventede nålbanen, velg et nytt målområde eller finn en annen tilnærming / bane.
- Hold transduseren i den ene hånden og en 30 g insulinkanyle (se Materialtabell) med 10 mikroliter injeksjon i den andre.
MERK: Injektatet vil variere basert på det eksperimentelle designet. Denne studien brukte fosfatbufret saltvann, trypanblått eller D-luciferin (0,1 μg/10 μL). - For å starte injeksjonsprosessen, flytt transduseren lateralt slik at thymus er utenfor sentrum i ultralydfeltet. Sørg for at den andre siden av synsfeltet består av for det meste ultralydgel og ingenting annet.
- Plasser spissen av nålen i gelen under transduseren og beveg nålen sakte til den visualiseres ved siden av hudoverflaten (figur 4B).
- Mens kontinuerlig imaging nålen under ultralyd, sett nålen inn i thymuskjertelen med en perkutan bane, vekk fra blodårene.
- Bruk en "kryss thymus" horisontal bane for å plassere nålespissen i den tymiske loben kontralateralt til inngangsstedet. Dette forklarer potensiell lekkasje langs nåleveien (figur 5A).
- Når kanylespissen er inne i ønsket del av thymus, injiseres innholdet raskt (f.eks. 10 μL trypanblått eller D-luciferin, 0,1 μg/10 μL) fra 30 G-sprøyten mens du bruker sonografisk visualisering.
- For å stabilisere sprøyten under nålestikk og injeksjon, hold sprøyten mellom tommelen og tredjefingeren og kontroller sprøytestemplet med pekefingeren.
- Fjern kanylen etter at alt innholdet er avsatt.
5. Overvåking av dyr etter injeksjon
- Overfør dyret til et tomt bur og observer til det gjenvinner tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
MERK: Full gjenoppretting fra anestesi forventes å skje innen 2 minutter. - Overvåk dyret i ytterligere 10 minutter for tegn på nød, anstrengt pust eller blødning.
MERK: Smerte etter injeksjon forventes ikke, og det er vanligvis ikke behov for analgesi etter injeksjon. - Når det er fullstendig gjenopprettet og etter en begivenhetsløs observasjonsperiode etter injeksjon, returner det injiserte dyret til selskap med andre dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede implementeringen av denne teknikken er avhengig av noen få viktige trinn som skal følges. Først må pålitelig identifikasjon av thymuskjertelen selv sikres. Hos unge mus er dette enkelt på grunn av kjertelens store størrelse (figur 3A). Hos eldre mus eller immunsviktende mus kan det være mer utfordrende; Det er imidlertid fortsatt svært mulig med moderne ultralydutstyr (figur 3B, C). For det andre er det kritisk viktig å stille nålbanen slik at den blir visualisert kontinuerlig under utviklingen av nålespissen gjennom brystvegglagene og inn i thymus. En vellykket injeksjon vil få nålen visualisert helt mens den blir avansert. Dette forsikrer operatøren om at nålen ikke har krysset en kritisk struktur, som hjertet, aorta eller en av de nedre venae cavae (figur 4). Dette gjelder også selve injeksjonen. Nålespissen må alltid visualiseres på målstedet under injeksjonen, slik at den intratymiske avsetningen bekreftes (figur 5).
Noen mindre fallgruver eksisterer som, hvis de gjenkjennes, kan reduseres relativt enkelt. Når musen festes til scenen og nesekjeglen, må musens thorax gjøres så nøytral som mulig (dvs. uten signifikant venstre- eller høyrerotasjon). Hvis det er for mye rotasjon av thoraxen, kan det hende at den riktige "tilnærmingsvinkelen" på nålen ikke er lett oppnåelig. Også, hvis musen ikke er festet på plass tett nok, kan den bevege seg eller gli når du prøver å fremme nålen, forvrenge anatomien og gjøre visualisering vanskelig. Men med riktig teknikk og forberedelse kan en vellykket intratymisk injeksjon oppnås med konsistens, pålitelighet og reproduserbarhet.
Når injeksjonen er fullført, er det flere måter å bekrefte den intratymiske plasseringen av injeksjonen på. Denne studien brukte luciferin som injektat i luciferase transgene mus. Disse kan deretter evalueres umiddelbart etter injeksjonen med bioluminescensavbildning, noe som bekrefter injeksjonens korrekte plassering uten å ofre dyret (figur 6A). Denne teknikken har den ekstra fordelen at injiserte luciferin-merkede celler kan avbildes på flere tidspunkter, noe som sikrer vedvarende aktivitet i thymus. Alternativt kan trypanblå injiseres som visuell markør på injeksjonsstedet, og injeksjonsnøyaktighet kan da bekreftes ex vivo med nekropsi16 (figur 6B).
Figur 1: Bedøvet mus plassert på bildestadiet for ultralyd av thymus. En 6 uker gammel kvinnelig C57BL/6-mus med depilert bryst ble bedøvet og overført til bildestasjonen. Musen er i en liggende stilling, med de utstrakte bena sikret med tape. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ultralyd maskininnstillinger. Bilde av ultralydmaskinens kontrollpanel (berøringsskjerm). Hovedjusteringene av innstillingene for å optimalisere bildebehandlingen vil være å justere dybden (rød pil), fokalsonen (sirklet i gult) og gevinsten (rød stjerne). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ultralydavbildning av thymus hos immunkompetente og immunsviktende unge og eldre mus. (A) Immunkompetent ung mus (C57BL/6, kvinne, 4 uker gammel, n = 5). Den tverrgående sonografiske visningen viser thymus høyre og venstre lobes (stjerner). (B) Immunkompetent mus i alderen (C57BL/6, kvinne, 6 måneder gammel, n = 5). Thymus (stjerne) er mindre, men opprettholder sin typiske plassering og pyramideform. (C) Immunsvikt ung mus (NOD scid gamma, kvinne, 4 uker gammel, n = 5). Legg merke til den mye mindre størrelsen på thymus (stjerne) sammenlignet med den normale unge musen. (D) Akymisk naken mus (kvinne, 8 uker gammel, n = 1). Det er et komplett fravær av tymisk vev. Merk at den mørke (hypoekkoiske) vertikale linjen i midten av bildet (stjerne) er en skyggeartefakt fra brystbenet, uten ekte tymisk vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Klargjøring for injeksjon . (A) Fargedopplerbilde av fremre thorax demonstrerer thymus' forhold til de mediastinale karene. Det nederste midten er aortabuen (rød pil), og de avrundede karene på hver side er høyre og venstre superior venae cavae (gule pilspisser). Blod som strømmer mot avbildningssonden er kodet i rødt, og blod som strømmer bort fra transduseren er kodet i blått. (B) Nåleplassering fra før avansement i brystet fra en venstresidig tilnærming. Nålespissen (gul pil) må være på linje med ultralydtransduseren og spissnivået med den midterste delen av thymus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Injeksjonsteknikk . (A) Plassering av kanylen for injeksjon av høyre tromoginne av en immunkompetent ung mus. Nålespissen (gul pil) er i den sentrale delen av høyre. (B) Bilde etter injeksjon av høyre som viser en samling mørk (hypoekkoisk) væske og små lyse (ekkogene) luftbobler på injeksjonsstedet (stiplet rød linje). Den gule pilen indikerer nålespissen. (C) Plassering av kanylen (gul pil på nålespissen) til injeksjon av venstre thymiske av en immunkompetent ung mus. (D) Nålplassering (gul pil) til injeksjon av høyre lobe av en immunkompetent ung mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: In vivo og ex vivo verifisering av nøyaktighet. (A) Injeksjon av D-luciferin (0,1 μg/10 μL) i thymus hos en 8 uker gammel transgen mus med luciferase etterfulgt av 1 s in vivo bioluminescensavbildning ved bruk av et in vivo bioluminescensavbildningssystem (n = 3). Fargekodingen viser den totale bioluminescensutstrålingen (fotoner·s−1·cm−2·steradian−1) som angitt med fargelinjen til høyre. (B) Thymus fra to 5 uker gamle C57BL/6-mus ble injisert med trypanblått, og injeksjonsnøyaktigheten ble demonstrert ved nekropsi (n = 3). Toppanel: Dorsal overflate av en Trypan Blue-farget injisert thymus in situ. Bunnpanel: Ventral overflate av en Trypan Blue-farget thymus ex situ etter injeksjon av venstre lobe. Gjengitt med tillatelse fra Tuckett et al.1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ultralydstyrt frihåndsinjeksjon er en svært nøyaktig teknikk for å levere studiemateriell til thymus på en effektiv og aseptisk måte. Etter den første steriliseringen av huden på injeksjonsstedet, opprettholdes steriliteten under prosedyren på grunn av bruk av sterile hansker, sterile ultralydsondedeksler og steril ultralydgel. I motsetning til den blinde perkutane tilnærmingen 10,17 eller stole på kirurgiske snitt for direkte visualisering av thymus18,19, som er de mest brukte metodene for intratymiske injeksjoner hos mus, kombinerer bruk av frihånds ultralydveiledning en høy grad av sikkerhet og hurtighet med enorm presisjon i prosedyren. Gjennomføring av ultralydstyrte injeksjoner ved hjelp av skinneplattformen14 gir et lignende nivå av sikkerhet og nøyaktighet, men denne tungvinte tilnærmingen tar vanligvis minst 5 minutter per injeksjon fra det øyeblikket musen har blitt bedøvet og plassert på bildeplattformen, sammenlignet med frihåndsteknikken som gjør det mulig for en ekspert å fullføre injeksjoner på rundt 20-30 s per mus15.
Betydelig erfaring og opplæring er en forutsetning for å oppnå et høyt ferdighetsnivå i alle de ulike metodene for intratymisk injeksjon, inkludert den ultralydstyrte frihåndsinjeksjonsteknikken. Imidlertid kan en radiolog med klinisk erfaring i ultralydstyrte prosedyrer bli dyktig i intratymisk injeksjon av mus innen en 1 timers treningsøkt.
Fleksibiliteten til frihåndsinjeksjonsmetoden gjør det mulig for etterforskeren å injisere enten en tymisk lobe, begge tymiske lober i en injeksjonspass, eller begge tymiske lober i to separate injeksjoner, avhengig av de spesifikke eksperimentelle behovene til studien. Merk at injeksjon av individuelle tymiske lober med placebo versus studiemateriale kan brukes som en strategi for å redusere antall studiepersoner som trengs ved å bruke placeboinjisert lobe som en intern kontroll. I motsetning til dette tillater det stive oppsettet av det integrerte skinnesystemet injeksjon i en tymisk lobe per injeksjonsperiode. Injeksjon av en ekstra vil kreve demontering av sprøyteholderen, montering på baksiden av musen og nøye justering av mikromanipuleringskontrollene til nålens bane er riktig før neste injeksjon kan fortsette. Disse problemene øker anestesieksponeringen betydelig og tiden som trengs for å fullføre eksperimentet.
En unik fordel med den intrathymiske metoden med fri ultralyd sammenlignet med den blinde intratymiske injeksjonsprosedyren er den relative lettheten ved nøyaktig injeksjon av små thymuser som thymusene til eldre mus (6 måneder eller eldre), som er mye mindre i størrelse enn de hos yngre mus (4-10 uker gamle). Denne fordelen, kombinert med den enkle oppskaleringen, gjør det mulig for immunologer å gjennomføre intratymiske injeksjonsbaserte studier i et bredt spekter av prekliniske musemodeller.
Avslutningsvis gir observasjonene rikelig med bevis som støtter frihåndsteknikken for sikre, raske og presise injeksjoner rettet mot individuelle tymiske lober. Denne minimalt invasive metoden representerer derfor et svært effektivt og nøyaktig alternativ for thymusforskning, og letter storskala prekliniske undersøkelser hos mus med thymuser som spenner fra store til ekstremt små.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Vi vil takke Raymond H. Thornton for hans innsiktsfulle og omfattende tidlige arbeid med denne teknikken. Denne studien ble finansiert av tilskuddsstøtte fra National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), Children's Leukemia Research Association, Hackensack Meridian School of Medicine og HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A. Surgery induced immunosuppression. Surgeon. 9 (1), 38-43 (2011).
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic injection. Methods in Molecular Biology. 1323, 203-209 (2016).
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D. Refinement of intrathymic injection in mice. Laboratory Animals. 36 (5), 27-32 (2007).
