Summary
Bu protokol, açık cerrahi riskini önlemek ve kör perkütan enjeksiyonların doğruluğunu artırmak için farelerde intratimik enjeksiyon için oluşturulan girişimsel bir radyoloji prosedürünü tanımlamaktadır.
Abstract
Fare modellerinde intratimik enjeksiyon, genetik ve edinilmiş T hücre bozuklukları da dahil olmak üzere timik ve bağışıklık fonksiyonlarını incelemek için önemli bir tekniktir. Bu, reaktiflerin ve / veya hücrelerin canlı farelerin timusuna doğrudan birikmesi için yöntemler gerektirir. Geleneksel intratimik enjeksiyon yöntemleri, her ikisi de önemli sınırlamalara sahip olan göğüs cerrahisi veya minimal invaziv perkütan kör enjeksiyonları içerir. Ultra yüksek frekanslı ultrason görüntüleme cihazları, farelerde görüntü rehberliğinde perkütan enjeksiyonları mümkün kılarak perkütan enjeksiyon yaklaşımının enjeksiyon doğruluğunu büyük ölçüde artırmış ve daha küçük hedeflerin enjeksiyonunu sağlamıştır. Bununla birlikte, görüntü kılavuzlu enjeksiyonlar, entegre bir raylı sistemin kullanımına dayanır ve bu da bunu katı ve zaman alıcı bir prosedür haline getirir. Farelerde perkütan intratimik enjeksiyonlar için benzersiz, güvenli ve etkili bir yöntem burada sunulmakta ve enjeksiyonlar için raylı sisteme olan bağımlılığı ortadan kaldırmaktadır. Teknik, fare timusunu invaziv olmayan bir şekilde görüntülemek için yüksek çözünürlüklü bir mikro-ultrason ünitesi kullanmaya dayanır. Serbest el tekniği kullanarak, bir radyolog sonografik rehberlik altında doğrudan fare timusuna bir iğne ucu yerleştirebilir. Fareler görüntülemeden önce temizlenir ve anestezi altına alınır. Ultrason rehberliğindeki prosedürlerde usta deneyimli bir radyolog için, belirtilen tekniğin öğrenme süresi, tipik olarak bir seansta oldukça kısadır. Yöntem, fareler için düşük morbidite ve mortalite oranına sahiptir ve perkütan enjeksiyon için mevcut mekanik destekli tekniklerden çok daha hızlıdır. Araştırmacının, hayvan üzerinde minimum stresle her büyüklükteki (yaşlı veya immün yetmezlikli farelerin timusları gibi çok küçük organlar dahil) timüzlerin hassas ve güvenilir perkütan enjeksiyonlarını verimli bir şekilde gerçekleştirmesini sağlar. Bu yöntem, istenirse bireysel lobların enjeksiyonunu sağlar ve prosedürün zaman kazandıran doğası nedeniyle büyük ölçekli deneyleri kolaylaştırır.
Introduction
Timus, T hücresi gelişimi ve bağışıklığında önemli bir role sahiptir. Timik evrim, genetik bozukluklar, enfeksiyonlar ve kanser tedavilerinin neden olabileceği T hücre eksikliği, diğer faktörlerin yanı sıra, yüksek mortalite ve morbiditeye yol açmaktadır 1,2. Fare modelleri hem temel hem de translasyonel immünoloji araştırmalarında vazgeçilmezdir ve timik biyoloji ve T hücresi gelişimini incelemek ve ayrıca timik disfonksiyon ve T hücre eksikliğinden muzdarip olanlar için tedaviler geliştirmek için onlarca yıldır kullanılmaktadır 3,4,5.
Timik araştırmaların merkezi bir kısmı, fare modellerinde hücreler, genler veya proteinler gibi biyolojik materyallerin intratimik enjeksiyonu olmuştur 6,7,8,9,10,11,12. Konvansiyonel intratimik enjeksiyon yöntemleri, torakotomi ve ardından doğrudan görselleştirme altında intratimik enjeksiyon veya mediastenin içine "kör" perkütan enjeksiyon kullanır. Cerrahi yaklaşım, diğerlerinin yanı sıra pnömotoraks riskini önemli ölçüde artırır. Dahası, bu ameliyat sırasında artan stres immünsüpresyona neden olur, böylece potansiyel olarak immünolojik verilerden ödün verir13. Deneyimli araştırmacılar, bazı uygulamalardan sonra, kör enjeksiyon tekniğini uygulayabilirler, ancak bu yaklaşım daha az doğrudur ve bu nedenle deneysel konuları büyük bir timuslu genç farelerle sınırlar.
Ultrason rehberliğinin kullanımı, geleneksel intratimik enjeksiyon yaklaşımlarına kesin ve minimal invaziv bir alternatif olarak tanıtılmıştır14. Bununla birlikte, serbest el tekniği yerine entegre raylı sistem kullanıldığında bu prosedür çok zaman alıcıdır. Enjeksiyon montajı ile enjeksiyonların gerçekleştirilmesi, dikkatli görüntüleme optimizasyonu ve dönüştürücü standı ve montajı, X, Y ve Z konumlandırma sistemi gibi çeşitli ataşmanların yardımıyla dönüştürücünün konumlandırılmasını ve ayrıca mikro manipülasyon kontrollerinin ve ray sistemi uzantılarının yetkin bir şekilde çalışmasını gerektirir. Basit bir alternatif teknik olan ultrason rehberliğinde timik enjeksiyon, burada bir radyolog tarafından yukarıda açıklanan yöntemlere hem hızlı hem de doğru minimal invaziv bir alternatif olan serbest el yaklaşımı15 kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Daha da önemlisi, mevcut yaklaşım, enjeksiyon montajına ve entegre raylı sisteme ihtiyaç duymadan herhangi bir yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemi ile gerçekleştirilebilir. Özellikle çok sayıda farenin enjekte edilmesini gerektiren çalışmalar içinyararlıdır 11, her iki timik lobun enjeksiyonunu içeren deneyler için veya yaşlı, ışınlanmış veya bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde küçük timüslerin doğru enjeksiyonuiçin 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Keşif ve İnovasyon Merkezi'ndeki (IACUC protokolü 290) hayvan bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, C57BL/6 fareler (dişi, 4-6 haftalık), C57BL/6 fareler (dişi, 6 aylık), J:NU dişi fareler, NOD scid gama (NSG) dişi fareler ve B6; CAG-luc, -GFP fareler sırasıyla genç fare modeli, yaşlı fare modeli, atimik çıplak model, immün yetmezlik modeli ve biyolüminesans hücre kaynağı olarak kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Bu prosedür tipik olarak iki kişi gerektirecektir (biri enjeksiyonları gerçekleştirirken steril kalmak ve diğeri fareleri idare etmek için).
1. Hayvan hazırlığı
- %3-%4 izofluran gazı kullanarak farelerde anesteziyi indükleyin ve burun konisi ve hassas kalibre edilmiş buharlaştırıcı ile uygulanan %1-%3 izofluran gazı kullanarak anesteziyi sürdürün (bkz.
- Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği / bilinçsizliği onaylayın.
- Kürkü, farelerin ön göğüs bölgesinden, 1 dakikadan daha kısa bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayarak çıkarın. Kremayı gevşek kürkle birlikte tamamen çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın.
NOT: Çok fazla krem uygulamak göğüs bölgesi cildinin iltihaplanmasına neden olur. - Her seferinde bir fareyi, sırtüstü olarak, küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformuna yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) burun konisi yerinde olacak şekilde (Şekil 1).
- Fareyi arka ve ön ayaklarda tıbbi yapışkan bant ile sahneye sabitleyin (Şekil 1).
- Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin (bkz.
2. Ultrason makinesinin ve steril alanın hazırlanması
- Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu, tipik olarak görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip probu etkinleştirin. Başlangıç ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin.
NOT: Farelerle yapılan bu uygulama için, kullanılan prob özellikle fareler ve küçük sıçanlarla kullanılmak üzere tasarlanmıştır (bkz. - Aşağıdaki adımları izleyerek görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize edin.
- Ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın (Şekil 2). Maksimum derinlik ayarı, genç fareler için tipik olarak yaklaşık 6-8 mm olacaktır.
- Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın (Şekil 2). Amaç, tipik bir "gri" görünümden biraz daha koyu bir görüntüyle başlamaktır.
- Odak bölgesini (ekranın sağındaki mavi ok, Şekil 2) beklenen timus seviyesine ayarlayın. Genç fareler için bu, 4 mm'lik bir derinlik civarında olacaktır.
- Görüntü yakalama isteniyorsa, görüntülerin yordam boyunca uygun şekilde kaydedilebildiğinden emin olmak için depo görüntüsünün işlevselliğini ve depo klibi düğmelerini sınayın. Bunu, ekranın sağ alt köşesindeki Klibi Kaydet düğmesine veya Dondur düğmesine ve ardından Görüntüyü Kaydet'e dokunarak gerçekleştirin (Şekil 2).
- Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde durarak, dik durumdayken az miktarda (~ 1 mL ) ultrason jeli uygulayın (bkz.
- Isıtmalı platformun yanında küçük bir steril alan hazırlayın. Bunun için en uygun konumlandırma genellikle platform ve ultrason makinesi arasındadır.
- Bu maddeleri steril alana boşaltın: steril bir prob kapağı, lastik bant, steril eldivenler ve steril ultrason jeli (bkz.
- Steril alan kurulduktan ve eşyalar yerleştirildikten sonra, steril eldivenleri giyin.
- Steril prob kapağını ultrason dönüştürücüsünün üzerine (ve başlangıçta proba yerleştirilen jelin üzerine) dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi koruyun ve sadece steril kapağa dokunun, başka bir şeye değil. Steril lastik bandı yerinde tutmak için steril prob kapağının üzerine kaydırın.
NOT: Hava odakları, boyutlarından bağımsız olarak, ultrason görüntülemeye müdahale edebilir. Bu nedenle, ultrason jelinin dönüştürücü ve steril prob kapağı arasına ve ultrason probu ile hayvan arasında havasız bir arayüz sağlamak için prob kapağının üstüne uygulanması önemlidir. - Transdüserin üzerine ılımlı miktarda (2-3 mL) steril ultrason jeli yerleştirin.
NOT: Kullanıcı artık anestezi uygulanmış bir fareyi görüntülemeye hazırdır.
3. Timüsün görüntülenmesi ve bulunması
- Steriliteyi korurken, ultrason jel kaplı probu, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.
- Ultrason görüntüsüne bakmak ve daha da optimize etmek için bir dakikanızı ayırın. Adım 2.2'ye geri dönün ve Şekil 3'ünkine benzer bir görünüm elde etmek için ayarlayın.
- Farenin ön göğsünü enine düzlemde tarayın. Bunu, dönüştürücüyü dikey olarak tutarak ve boya fırçası benzeri veya "süpürme" hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirerek gerçekleştirin.
NOT: Kalp, hızlı hareketi ve "odacıklı" görünümü nedeniyle göğüsteki en tanınabilir yapı olacaktır. Kalp lokalize olduğunda, bu timüsün görüntüsünü elde etmek için bir referans noktası olarak kullanılabilir. - Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün. Kalbe göre daha üstün olan timusla genellikle karşılaşılır.
- Timüsü, orta hatta ortalanmış, aortun ön tarafında ve sternumun arkasında bulunan bilobed, piramidal, hipoekoik ("karanlık" veya "siyah" ekranda görünen) bir yapı olarak görselleştirin (Şekil 3A).
- Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah (yani, "hipoekoik") yapıya dikkat edin.
NOT: Bunlar bilateral venae kavalardır. Aort, iki venae kava arasındaki orta hatta benzer eğrisel hipoekoik bir yapıdır. Bunlar pulsatil hareketleriyle kolayca tanınabilir.
4. Timus enjeksiyonu
- Gerekirse, dönüştürücüye daha fazla (2-3 mL) steril ultrason jeli uygulayın.
NOT: Dönüştürücü üzerindeki nispeten büyük miktarda steril jel (fare göğüs kafesinin boyutuna kıyasla), farenin göğüs duvarının etrafında bir "jel ped" görevi görecektir. Bu, görüş alanı içinde hava ile yapılan ultrason eserlerinin sayısını azaltacaktır. - Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen konumda yatay bir iğne yörüngesi tahmin edin.
- Ana kan damarlarının (SVC'ler ve aort) bu bölgede nerede bulunduğuna dikkat edin. Enjeksiyon sırasında bunlardan kaçının.
- Kan damarları, adım 3.7'de açıklandığı gibi hipoekoik, pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlar içindeki akışı kontrol etmek için renkli Doppler modunu kullanın (Şekil 4A). Ekrandaki Renk (Color ) düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.
- Ana kan damarlarından birinin (veya kalbin) beklenen iğne yörüngesi boyunca olması bekleniyorsa, yeni bir hedef alan seçin veya farklı bir yaklaşım / yörünge bulun.
- Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 μL enjekte edilen 30 G insülin iğnesini ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Enjektör, deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. Bu çalışmada fosfat tamponlu salin, tripan mavisi veya D-lusiferin (0.1 μg / 10 μL) kullanılmıştır. - Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.
- İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin (Şekil 4B).
- İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta, perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin.
- İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için "çapraz timus" yatay yörüngesini kullanın. Bu, iğne yolu boyunca potansiyel sızıntıyı açıklar (Şekil 5A).
- İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği (10 μL tripan mavisi veya D-lusiferin, 0.1 μg / 10 μL gibi) 30 G şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin.
- İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı başparmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin.
- Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.
5. Hayvanların enjeksiyon sonrası izlenmesi
- Hayvanı boş bir kafese aktarın ve sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözlemleyin.
NOT: Anesteziden tam iyileşmenin 2 dakika içinde gerçekleşmesi beklenmektedir. - Sıkıntı, nefes darlığı veya kanama belirtileri için hayvanı 10 dakika daha izleyin.
NOT: Enjeksiyon sonrası ağrı beklenmez ve tipik olarak enjeksiyon sonrası analjeziye gerek yoktur. - Tamamen iyileştikten sonra ve enjeksiyon sonrası olaysız bir gözlem periyodunu takiben, enjekte edilen hayvanı diğer hayvanların şirketine iade edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, izlenecek birkaç önemli adıma dayanmaktadır. İlk olarak, timus bezinin kendisinin güvenilir bir şekilde tanımlanması sağlanmalıdır. Genç farelerde, bezin büyüklüğü nedeniyle bu basittir (Şekil 3A). Yaşlı farelerde veya immün yetmezlikli farelerde, daha zor olabilir; Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok uygundur (Şekil 3B, C). İkincisi, iğne yörüngesini ayarlamak kritik derecede önemlidir, böylece iğne ucunun göğüs duvarı katmanlarından ve timüs içine ilerlemesi sırasında sürekli olarak görselleştirilecektir. Başarılı bir enjeksiyon, iğnenin ilerletilirken tamamen görselleştirilmesini sağlayacaktır. Bu, operatöre iğnenin kalp, aort veya inferior venae kavalardan biri gibi kritik bir yapıdan geçmediğini garanti eder (Şekil 4). Bu aynı zamanda enjeksiyonun kendisi için de geçerlidir. İğne ucu enjeksiyon sırasında her zaman hedef konumunda görselleştirilmelidir, böylece intratimik birikim doğrulanır (Şekil 5).
Tanındığı takdirde, nispeten kolay bir şekilde hafifletilebilecek bazı küçük tuzaklar vardır. Fareyi sahneye ve burun konisine sabitlerken, farenin göğüs kafesinin mümkün olduğunca nötr hale getirilmesi gerekir (yani, sola veya sağa doğru önemli bir dönüş olmadan). Toraksın çok fazla dönmesi varsa, iğnenin doğru "yaklaşma açısı" kolayca elde edilemeyebilir. Ayrıca, fare yeterince sıkı bir şekilde yerine sabitlenmemişse, iğneyi ilerletmeye çalışırken anatomiyi bozarak ve görselleştirmeyi zorlaştırarak hareket edebilir veya kayabilir. Bununla birlikte, uygun teknik ve hazırlık ile, tutarlılık, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik ile başarılı bir intratimik enjeksiyon elde edilebilir.
Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, enjeksiyonun intratimik yerini doğrulamanın birçok yolu vardır. Bu çalışmada lusiferin, lusiferaz transgenik farelere enjekte olarak kullanılmıştır. Bunlar daha sonra enjeksiyondan hemen sonra biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirilebilir ve hayvanı feda etmeden enjeksiyonun doğru yerini doğrular (Şekil 6A). Bu teknik, enjekte edilen lusiferin etiketli hücrelerin birden fazla zaman noktasında görüntülenebilmesi ve timusta aktivitenin kalıcılığını sağlaması gibi ek bir avantaja sahiptir. Alternatif olarak, tripan mavisi enjeksiyon bölgesinin görsel bir belirteci olarak enjekte edilebilir ve enjeksiyon doğruluğu daha sonra nekropsi16 ile ex vivo olarak doğrulanabilir (Şekil 6B).
Şekil 1: Timüsün ultrasonografisi için görüntüleme aşamasına yerleştirilen anestezi uygulanmış fare. Göğüsleri epilasyona uğramış 6 haftalık kadın C57BL/6 fareye anestezi uygulandı ve görüntüleme istasyonuna transfer edildi. Fare, uzanmış bacakları bantla sabitlenmiş olarak sırtüstü pozisyondadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Ultrason makinesi ayarları. Ultrason makinesi kontrol panelinin görüntüsü (dokunmatik ekran). Görüntülemeyi optimize etmek için ayarların ana ayarlamaları derinliği (kırmızı ok), odak bölgesini (sarı renkte daire içine alınmış) ve kazançları (kırmızı yıldız işareti) ayarlamak olacaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İmmünkompetan ve immün yetmezlikli genç ve yaşlı farelerde timusun ultrasonla görüntülenmesi. (A) İmmünkompetan genç fare (C57BL/6, dişi, 4 haftalık, n = 5). Enine sonografik görünüm timusun sağ ve sol loblarını (yıldız işaretleri) gösterir. (B) İmmünkompetan yaşlı fare (C57BL/6, dişi, 6 aylık, n = 5). Timus (yıldız işareti) daha küçüktür, ancak tipik konumunu ve piramidal şeklini korur. (C) İmmün yetmezlikli genç fare (NOD scid gama, dişi, 4 haftalık, n = 5). Normal genç fareye kıyasla timusun (yıldız işareti) çok daha küçük boyutuna dikkat edin. (D) Atimik çıplak fare (dişi, 8 haftalık, n = 1). Timik dokunun tamamen yokluğu vardır. Not olarak, görüntünün ortasındaki koyu (hipoekoik) dikey çizgi (yıldız işareti), sternumdan gerçek timik dokusu olmayan gölgeleyici bir eserdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Enjeksiyona hazırlık . (A) Anterior toraksın renkli Doppler görüntüsü, timusun mediastinal damarlarla ilişkisini göstermektedir. Alt merkez aort kemeridir (kırmızı ok) ve her iki taraftaki yuvarlak damarlar sağ ve sol superior venae kavadır (sarı ok uçları). Görüntüleme probuna doğru akan kan kırmızı, dönüştürücüden akan kan ise mavi renkte kodlanır. (B) Sol taraflı bir yaklaşımla göğsün içine ilerlemeden önce iğne yerleştirilmesi. İğne ucu (sarı ok) ultrason dönüştürücü ve timusun orta kısmı ile uç seviyesi ile aynı hizada olmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Enjeksiyon tekniği . (A) İmmünkompetan genç bir farenin sağ timik lobunun enjeksiyonu için iğne yerleştirilmesi. İğne ucu (sarı ok) sağ lobun orta kısmındadır. (B) Sağ lobun enjeksiyon sonrası görüntüsü, enjeksiyon bölgesinde koyu (hipoekoik) sıvı ve küçük parlak (ekojenik) hava kabarcıkları koleksiyonunu gösterir (kesikli kırmızı çizgi). Sarı ok iğne ucunu gösterir. (C) İmmün yetkin genç bir farenin sol timik lobunun enjeksiyonu için iğne yerleştirme (iğne ucunda sarı ok). (D) İmmün yetkin genç bir farenin sağ lobunun enjeksiyonu için iğne yerleştirme (sarı ok). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Doğruluğun in vivo ve ex vivo doğrulanması . (A) 8 haftalık bir lusiferaz transgenik farenin timusuna D-lusiferin (0.1 μg / 10 μL) enjeksiyonu ve ardından in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak 1 s in vivo biyolüminesans görüntüleme (n = 3). Renk kodlaması, sağdaki renk çubuğuyla gösterildiği gibi toplam biyolüminesans parlaklığını (fotonlar·s−1·cm−2·steradian−1) gösterir. (B) İki adet 5 haftalık C57BL/6 farenin timusuna tripan mavisi enjekte edildi ve enjeksiyon doğruluğu nekropsi ile gösterildi (n = 3). Üst panel: Tripan Mavi lekeli enjekte edilmiş timüsün dorsal yüzeyi in situ. Alt panel: Sol lob enjeksiyonundan sonra Trypan Blue lekeli timus ex situ'nun ventral yüzeyi. Tuckett ve ark.1'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultrason rehberliğinde serbest el enjeksiyonu, çalışma materyallerini timusa verimli ve aseptik bir şekilde iletmek için oldukça doğru bir tekniktir. Enjeksiyon bölgesinde cildin ilk sterilizasyonunu takiben, steril eldivenler, steril ultrason prob kapakları ve steril ultrason jeli kullanımı nedeniyle prosedür sırasında sterilite korunur. Kör perkütan yaklaşım 10,17'nin aksine veya farelerde intratimik enjeksiyonlar için yaygın olarak kullanılan yöntemler olan timus 18,19'un doğrudan görselleştirilmesi için cerrahi insizyonlara güvenerek, serbest ultrason rehberliğinin kullanılması, yüksek derecede güvenlik ve çabukluğu prosedürün muazzam hassasiyetiyle birleştirir. Ray platformu14'ü kullanarak ultrason rehberliğinde enjeksiyonlar yapmak benzer bir güvenlik ve doğruluk seviyesi sunar, ancak bu hantal yaklaşım, bir uzmanın enjeksiyonları fare başına yaklaşık 20-30 sn içinde tamamlamasını mümkün kılan serbest el tekniğine kıyasla, farenin anestezi altına alındığı ve görüntüleme platformuna yerleştirildiği andan itibaren enjeksiyon başına en az 5 dakika sürer15.
Önemli deneyim ve eğitim, ultrason rehberliğinde serbest el enjeksiyonu tekniği de dahil olmak üzere intratimik enjeksiyon için çeşitli yöntemlerde yüksek bir yeterlilik seviyesine ulaşmak için ön koşuldur. Bununla birlikte, ultrason rehberliğindeki prosedürlerde klinik deneyime sahip bir radyolog, 1 saatlik bir uygulama seansında farelerin intratimik enjeksiyonunda yetkin hale gelebilir.
Serbest el enjeksiyon yönteminin esnekliği, araştırmacının, çalışmanın spesifik deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak, bir timik lob, bir enjeksiyon geçişinde her iki timik lob veya iki ayrı enjeksiyonda her iki timik lob enjekte etmesini sağlar. Not olarak, bireysel timik lobları plasebo ile çalışma materyaline karşı enjekte etmek, plasebo enjekte edilen lobun bir iç kontrol olarak kullanılmasıyla ihtiyaç duyulan çalışma konularının sayısını azaltmak için bir strateji olarak kullanılabilir. Buna karşılık, entegre ray sisteminin sert kurulumu, enjeksiyon periyodu başına bir timik lob içine enjeksiyona izin verir. İkinci bir lobun enjeksiyonu, şırınga tutucu bağlantısının sökülmesini, farenin arka tarafına takılmasını ve bir sonraki enjeksiyon devam etmeden önce iğnenin yörüngesi doğru olana kadar mikro manipülasyon kontrollerinin dikkatlice ayarlanmasını gerektirir. Bu sorunlar anesteziye maruz kalmayı ve deneyi tamamlamak için gereken süreyi önemli ölçüde artırır.
Kör intratimik enjeksiyon prosedürüne kıyasla serbest el ultrasonu intratimik yönteminin benzersiz bir avantajı, genç farelerden (4-10 haftalık) çok daha küçük boyutlu olan yaşlı farelerin (6 ay veya daha büyük) timüsleri gibi küçük timüslerin doğru bir şekilde enjekte edilmesinin göreceli kolaylığıdır. Bu avantaj, ölçek büyütme kolaylığı ile birleştiğinde, immünologların çok çeşitli klinik öncesi fare modellerinde intratimik enjeksiyon tabanlı çalışmalar yapmalarını sağlar.
Sonuç olarak, gözlemler bireysel timik lobları hedef alan güvenli, hızlı ve hassas enjeksiyonlar için serbest el tekniğini destekleyen bol miktarda kanıt sunmaktadır. Bu nedenle, bu minimal invaziv yöntem, timus araştırması için oldukça verimli ve doğru bir seçeneği temsil eder ve timüsleri büyük ila son derece küçük arasında değişen farelerde büyük ölçekli klinik öncesi araştırmaları kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Raymond H. Thornton'a bu teknik üzerindeki anlayışlı ve kapsamlı erken çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI 1R37CA250661-01A1), Çocuk Lösemi Araştırma Derneği, Hackensack Meridyen Tıp Fakültesi ve HUMC Vakfı / Çocuk Kanseriyle Mücadele hibe desteği ile finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A.
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A.
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D.
