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Neuroscience

न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए लार्वा ज़ेबराफिश में लिपोपॉलेसेकेराइड के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64313
Automatic Translation
1, 1,2
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

यह प्रोटोकॉल परिणामी न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी का अध्ययन करने के लिए एक जेब्राफिश लार्वा मॉडल में मस्तिष्क वेंट्रिकुलर क्षेत्र में लिपोपॉलेसेकेराइड के माइक्रोइंजेक्शन को प्रदर्शित करता है।

Abstract

न्यूरोइन्फ्लेमेशन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों सहित विभिन्न न्यूरोलॉजिकल विकारों में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। इसलिए, न्यूरोडीजेनेरेशन में न्यूरोइन्फ्लेमेशन की भूमिका को समझने के लिए विवो न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल में अनुसंधान और विकल्प विकसित करना बहुत रुचि रखता है। इस अध्ययन में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन द्वारा मध्यस्थता वाले न्यूरोइन्फ्लेमेशन के एक लार्वा जेब्राफिश मॉडल को विकसित और मान्य किया गया था। ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश लाइनों elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP, और mpo: EGFP का उपयोग प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण के साथ एकीकृत प्रतिदीप्ति लाइव इमेजिंग द्वारा मस्तिष्क न्यूरॉन व्यवहार्यता के वास्तविक समय की मात्रा का ठहराव करने के लिए किया गया था। जेब्राफिश लार्वा के लोकोमोटर व्यवहार को वीडियो-ट्रैकिंग रिकॉर्डर का उपयोग करके स्वचालित रूप से रिकॉर्ड किया गया था। नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) की सामग्री, और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) सहित भड़काऊ साइटोकिन्स के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर, और मानव ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर α (टीएनएफ -α) की जांच लार्वा जेब्राफिश सिर में एलपीएस-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए की गई थी। एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, जेब्राफिश लार्वा में न्यूरॉन्स का नुकसान और हरकत की कमी देखी गई। इसके अलावा, एलपीएस-प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन ने निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश लार्वा के 6 दिनों के बाद के सिर में आईएल -6, आईएल -1, और टीएनएफ -α की कोई रिहाई और एमआरएनए अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं की, और इसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती हुई। इस अध्ययन में, 5 डीपीएफ पर 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एलपीएस के साथ ज़ेब्राफिश का इंजेक्शन इस फार्माकोलॉजिकल न्यूरोइन्फ्लेमेशन परख के लिए इष्टतम स्थिति के रूप में निर्धारित किया गया था। यह प्रोटोकॉल एक ज़ेब्राफिश लार्वा में एलपीएस-मध्यस्थता न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकल माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक नई, त्वरित और कुशल पद्धति प्रस्तुत करता है, जो न्यूरोइन्फ्लेमेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है और विवो ड्रग स्क्रीनिंग परख में उच्च-थ्रूपुट के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरोइन्फ्लेमेशन को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 1 के कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में शामिल एक महत्वपूर्ण एंटी-न्यूरोजेनिक कारक के रूप में वर्णित किया गया है। पैथोलॉजिकल अपमान के बाद, न्यूरोइन्फ्लेमेशन के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रतिकूल परिणाम हो सकते हैं, जिसमें न्यूरोजेनेसिस का निषेध और न्यूरोनल सेल मृत्यु 2,3 का प्रेरण शामिल है। सूजन प्रेरण की प्रतिक्रिया को अंतर्निहित प्रक्रिया में, कई भड़काऊ साइटोकिन्स (जैसे टीएनएफ-α, आईएल -1, और आईएल -6) बाह्य अंतरिक्ष में स्रावित होते हैं और न्यूरॉन मृत्यु और न्यूरोजेनेसिस 4,5,6 के दमन में महत्वपूर्णघटकों के रूप में कार्य करते हैं।

मस्तिष्क में सूजन मध्यस्थों (जैसे आईएल -1, एल-आर्जिनिन और एंडोटॉक्सिन) का माइक्रोइंजेक्शन न्यूरोनल सेल में कमी और न्यूरोइन्फ्लेमेशन 7,8,9 का कारण बन सकता है। लिपोपॉलीसेकेराइड (एलपीएस, चित्रा 1), ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका भित्ति में मौजूद एक रोगजनक एंडोटॉक्सिन, न्यूरोइन्फ्लेमेशन को प्रेरित कर सकता है, न्यूरोडीजेनेरेशन को बढ़ा सकता है, और जानवरों में न्यूरोजेनेसिस को कम करसकता है। माउस मस्तिष्क के सीएनएस में सीधे एलपीएस इंजेक्शन ने नाइट्रिक ऑक्साइड, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स और अन्य नियामकोंके स्तर में वृद्धि की। इसके अलावा, स्थानीय मस्तिष्क के वातावरण में एलपीएस का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन न्यूरोटॉक्सिक अणुओं के अत्यधिक उत्पादन को प्रेरित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ न्यूरोनल फ़ंक्शन और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का बाद में विकास 10,12,13,14,15 हो सकता है। तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में, जीवित जीवों में सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं के लाइव और टाइम-कोर्स सूक्ष्म अवलोकन रोगजनन और औषधीय कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्रको समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी के माउस मॉडल की लाइव इमेजिंग मूल रूप से माइक्रोस्कोपी की सीमित ऑप्टिकल प्रवेश गहराई से बाधित है, जो कार्यात्मक इमेजिंग और विकास प्रक्रियाओं के लाइव अवलोकन को रोकती है 17,18,19। इसलिए, लाइव इमेजिंग द्वारा पैथोलॉजिकल विकास, और न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित तंत्र के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए वैकल्पिक न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल का विकास बहुत रुचि रखता है।

ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) अपने विकासात्मक रूप से संरक्षित जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली, ऑप्टिकल पारदर्शिता, बड़े भ्रूण क्लच आकार, आनुवंशिक पथीयता और विवो इमेजिंग 19,20,21,22,23 के लिए उपयुक्तता के कारण न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मॉडल के रूप में उभरा है। . पिछले प्रोटोकॉल ने या तो यांत्रिक मूल्यांकन के बिना लार्वा ज़ेब्राफिश की जर्दी और हिंदब्रेन वेंट्रिकल में सीधे एलपीएस इंजेक्ट किया है, या घातक प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 24,25,26,27 को प्रेरित करने के लिए मछली के पानी (कल्चर माध्यम) में एलपीएस जोड़ा है। यहां, हमने मस्तिष्क वेंट्रिकल्स में एलपीएस के माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, ताकि निषेचन (डीपीएफ) ज़ेब्राफिश लार्वा के बाद 5 दिनों में एक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या न्यूरोटॉक्सिसिटी को ट्रिगर किया जा सके। यह प्रतिक्रिया न्यूरोनल सेल हानि, लोकोमोटर व्यवहार घाटे, नाइट्राइट ऑक्साइड रिलीज में वृद्धि, भड़काऊ जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता और इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती से स्पष्ट है।

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Protocol

एबी वाइल्ड-टाइप ज़ेब्राफिश और ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइनें इलावल 3: एमचेरी, ईटीवीमैट 2: जीएफपी, और एमपीओ: ईजीएफपी चीनी चिकित्सा विज्ञान संस्थान (आईसीएमएस) से प्राप्त की गई थीं। पशु प्रयोगों के लिए नैतिक अनुमोदन (उमरे-030-2017) पशु अनुसंधान नैतिकता समिति, मकाऊ विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था, और प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. ज़ेबराफिश भ्रूण और लार्वा पशुपालन

  1. प्राकृतिक जोड़ीवार संभोग द्वारा ज़ेब्राफिश भ्रूण (प्रति संभोग 200-300 भ्रूण) उत्पन्न करें जैसा कि पहले बताया गयाथा।
  2. 34.8 ग्राम NaCl, 1.6 g KCl, 5.8 g CaCl2.2H 2 O, और 9.78 gMgCl 2.6H 2 O कोddH2O में2L की अंतिम मात्रा में घोलकर अंडे का पानी (E3) मध्यम स्टॉक (60×) तैयार करें और NAOH और HCl का उपयोग करके pH को 7.2 तक समायोजित करें। ई 3 माध्यम (1×) की कार्यशील एकाग्रता तैयार करने के लिए, उपयोग में नहीं होने पर डीडीएच2ओ स्टोर में स्टॉक को 60 बार पतला करें।
  3. जेब्राफिश भ्रूण को ई 3 माध्यम युक्त डिश में स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। भ्रूण को इनक्यूबेटर में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर उठाएं और उनके विकास और स्वास्थ्य की निगरानी करें। मृत भ्रूण को हटा दें और अशुद्ध ई 3 माध्यम को प्रतिदिन ताजा माध्यम से बदलें।
  4. जेब्राफिश इमेजिंग प्रयोगों के लिए, 0.003% एन-फेनिलथियोरिया (पीटीयू) युक्त 1× ई 3 माध्यम के लगभग 15 एमएल में 0-2 घंटे पोस्ट फर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) भ्रूण (लगभग 200 अंडे) एकत्र करने के लिए प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: पीटीयू भ्रूणजनन 29 के दौरान मेलानोफोर के गठन को रोकसकता है। भ्रूणजनन के दौरान पीटीयू के साथ भ्रूण का उपचार माइक्रोस्कोपी में सिग्नल डिटेक्शन या फ्लोरेसेंस 30 की अभिव्यक्ति में सुधार करसकता है।
  5. उपरोक्त परिस्थितियों के तहत ज़ेब्राफिश भ्रूण को बनाए रखें जब तक कि भ्रूण वांछित विकासात्मक लार्वा चरण तक नहीं पहुंच जाते।

2. माइक्रोइंजेक्शन की तैयारी

  1. ग्लास केशिका ट्यूब खींचने के लिए पांच चरण प्रोटोकॉल का पालन करते हुए माइक्रोपिपेट पुलर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं को खींचकर इंजेक्शन के लिए तैयार करें (तालिका 1)।
  2. सुई की नोक (पतली दीवार कांच केशिकाओं [3.5 इंच] फिलामेंट, ओडी 1.14 मिमी के साथ) को बल का उपयोग करके एक कोण पर उपयुक्त आकार में खोलें (चित्रा 2 ए)।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई बुलबुले नहीं हैं, सुई को 0.1 एमएल खनिज तेल से भरें।
  4. माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की स्टील सुई की पेंच कैप को हटा दें। स्टील सुई के साथ कांच की सुई छेद को संरेखित करें और फिर स्क्रू कैप को कस लें। एक माइक्रोमैनिपुलेटर में लोड किए गए सुई माइक्रोइंजेक्शन उपकरण को माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की स्थिति को समायोजित करें ताकि माइक्रोमैनिपुलेटर माइक्रोस्कोप के नीचे उपकरण को लचीले ढंग से स्थानांतरित कर सके। स्टील की सुई को केशिका ग्लास ट्यूब में प्रवेश करने के लिए पैराफिन तेल की एक निश्चित मात्रा का निर्वहन करें।
  6. इंजेक्शन समाधान (जैसे 1× पीबीएस या 5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस) को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल ग्लास स्लाइड पर छोड़ दें और माइक्रोइंजेक्शन उपकरण को समायोजित करें ताकि टिप तरल बूंद में डाली जा सके। सुई में इंजेक्शन समाधान के ~ 2 μL लोड करें।
  7. माइक्रोमैनिपुलेटर (ऊपर, नीचे, बाएं और दाएं की ठीक समायोजन सेटिंग्स) सेट करें ताकि माइक्रोइंजेक्शन उपकरण की सुई टिप उच्च आवर्धन पर लार्वा के समान दृष्टि के क्षेत्र में हो (चित्रा 2 बी)।

3. माइक्रोइंजेक्शन के लिए जेब्राफिश को माउंट करना

नोट: ज़ेबराफिश मस्तिष्क का विकास 3 डीपीएफ के भीतर होता है और एक अच्छी तरह से विकसित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र31,32 के साथ 5 डीपीएफ पर परिपक्व होता है। इसलिए, 5 डीपीएफ लार्वा पहले से ही एलपीएस-मध्यस्थता न्यूरोनल क्षति के साथ-साथ व्यवहार और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं।

  1. इंजेक्शन के समय की स्थिरता बनाए रखने के लिए, रुचि के चरण तक पहुंचने के लगभग 30 मिनट के भीतर ज़ेब्राफिश लार्वा इंजेक्ट करें।
  2. ज़ेब्राफिश लार्वा को एनेस्थेटाइज करने के लिए, ट्राइकेन को साफ मछली टैंक के पानी (0.02% डब्ल्यू / वी ट्राइकेन की अंतिम एकाग्रता) के साथ मिलाएं।
  3. माइक्रोवेव का उपयोग करके डीडीएच 2 ओ में2% अगारोस के घोल को पिघलाएं। पिघले हुए अगारोस को प्लास्टिक डिश में डालें। 2% अगारोस-लेपित प्लास्टिक डिश को 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 2% अगारोस-लेपित प्लास्टिक डिश के केंद्र में एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को परिवहन करने के लिए प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें। सुई तक पहुंच के लिए मस्तिष्क की तरफ से माउंटेड लार्वा को उन्मुख करें।

4. मस्तिष्क वेंट्रिकल को इंजेक्ट करना

  1. माइक्रोस्कोप के आवर्धन को समायोजित करें ताकि जेब्राफिश की मस्तिष्क वेंट्रिकुलर संरचना स्पष्ट रूप से दृष्टि के क्षेत्र में प्रदर्शित हो (चित्रा 2 बी)।
  2. सुई को मस्तिष्क टेक्टम (चित्रा 2 सी) के ऊपर सावधानी से रखें।
  3. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके धीरे-धीरे सुई की नोक के साथ ज़ेब्राफिश मस्तिष्क की त्वचा को पंचर करें।
  4. 1x PBS के 1 nL या LPS की विभिन्न सांद्रता (1.0, 2.5, और 5.0 mg/mL) को निकालने के लिए पैर पेडल दबाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। सफल वेंट्रिकल इंजेक्शन छवियां जिस पर मस्तिष्क वेंट्रिकल को 1% इवांस ब्लू डाई (पीबीएस में पतला) के 1 एनएल के साथ इंजेक्ट किया गया था, एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है (चित्रा 2 डी)। इंजेक्शन के तुरंत बाद लार्वा को ई 3 माध्यम को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें। 24 घंटे के बाद, माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग, लोकोमोटिव व्यवहार परख और अन्य संकेतकों के निर्धारण के लिए लार्वा एकत्र करें।

5. इमेजिंग

  1. ई 3 माध्यम में 1.5% कम पिघला हुआ अगारोस समाधान तैयार करें और इसे एक स्पष्ट तरल बनाने के लिए माइक्रोवेव में गर्म करें।
  2. लार्वा को ग्लास स्लाइड में ले जाने और जितना संभव हो उतना पानी निकालने के लिए एक साफ प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
  3. लार्वा में 1.5% कम पिघले हुए अगारोस की एक बूंद जोड़ने के लिए प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
    नोट: कम पिघले हुए अगारोस को थोड़ी देर के लिए पिपेट में ठंडा करें ताकि लार्वा को चोट न पहुंचे।
  4. लार्वा को उन्मुख करने के लिए 1 एमएल सिरिंज सुई का उपयोग करें। इमेजिंग शुरू करने से पहले अगारोस ठंडा होने और जमने तक प्रतीक्षा करें।
  5. टीजी (ईटीवीमैट 2: ईजीएफपी) और टीजी (इलावल 3: एमचेरी) जेब्राफिश के पूरे मस्तिष्क में न्यूरॉन क्षेत्र का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें, साथ ही एक फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत टीजी (एमपीओ: ईजीएफपी) जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेटिंग्स नीचे दिखाए गए हैं। टीजी (ईटीवीमैट 2: ईजीएफपी) जेब्राफिश मस्तिष्क (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 450-490 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 500-550 एनएम, दृश्य आवर्धन: 100x); टीजी (इलावल 3: एमचेरी) जेब्राफिश मस्तिष्क (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 541-551 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 590 एनएम, दृश्य आवर्धन: 100x); टीजी (एमपीओ: ईएफजीपी) ज़ेबराफिश मस्तिष्क (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 450-490 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 500-550 एनएम, दृश्य आवर्धन: 63 एक्स)।
  6. इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टीजी (ईटीवीमैट 2: ईजीएफपी) जेब्राफिश में आरए न्यूरॉन क्षेत्र की प्रतिदीप्ति तीव्रता और लंबाई और टीजी (इलावल 3: एमचेरी) जेब्राफिश मस्तिष्क न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें और विश्लेषण करें। मैन्युअल रूप से टीजी (एमपीओ: ईएफजीपी) जेब्राफिश के मस्तिष्क क्षेत्र में न्यूट्रोफिल की गणना करें।

6. जीन अभिव्यक्ति मार्करों का निर्धारण

  1. एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, जीन अभिव्यक्ति मार्करों के निर्धारण के साथ आगे बढ़ें। ऐसा करने के लिए, 0.02% ट्राइकेन (जैसा कि चरण 3.2 में उल्लेख किया गया है) के साथ ज़ेब्राफिश लार्वा को एनेस्थेटाइज करें।
  2. आंख और जर्दी थैली क्षेत्रों के बिना लार्वा (प्रति समूह 40 लार्वा) के सिर के हिस्सों को अलग करने के लिए दो 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें (चित्रा 2 ई)।
  3. लार्वा सिर के हिस्सों से आरएनए निकालें।
    1. आरएनए निष्कर्षण के लिए, 5 सेकंड के लिए 11,000 आरपीएम की रोटेशन गति पर टिशू ग्राइंडर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 200 μL के साथ सिर के हिस्से को समरूप करें।
    2. क्लोरोफॉर्म-आइसोप्रोपेनॉल विधि का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण करें। ऐसा करने के लिए, 40 μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें, ट्यूबों को जोर से हिलाएं, और उन्हें 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। नमूनों को 12,000 x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. जलीय चरण को एक ताजा ट्यूब (लगभग 100 μL) में स्थानांतरित करें और आइसोप्रोपेनोल के 100 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    4. आरएनए गोली को धोने के लिए 75% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें। भंवर नमूने संक्षेप में और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और आरएनए गोली को फिर से धो लें।
    5. 5-10 मिनट के लिए आरएनए गोली को हवा में सुखाएं, फिर आरएनए गोली को भंग करने के लिए 30 μL RNase-मुक्त पानी जोड़ें। माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की शुद्धता (260 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषण का अनुपात) और अखंडता की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. यादृच्छिक प्राइमरों के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस का उपयोग करके चरण 6.3 में निकाले गए आरएनए से सीडीएनए को संश्लेषित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. न्यूक्लियस-मुक्त ट्यूब में यादृच्छिक प्राइमरों के 1 μL, dNTPs के 1 μL, RNA के 1μg, और आसुत जल (कुल मात्रा 12 μL) जोड़ें। मिश्रण को 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और बर्फ पर जल्दी ठंडा करें।
    2. ट्यूब में 0.1 एम डीटीटी का 1 μL, RNase इनहिबिटर का 1 μL, 5× फर्स्ट-स्ट्रैंड बफर का 4 μL और M-MLV रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (कुल मात्रा: 20 μL) का 1 μL जोड़ें। धीरे से मिलाएं और ट्यूब को 2 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, इसके बाद 50 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस। 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें।
  5. लक्ष्य जीन (आईएल -1, आईएल -6, और टीएनएफ -α) की अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरटी-क्यूपीसीआर किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके क्यूपीसीआर सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) पर वास्तविक समय पीसीआर करें। प्रतिक्रिया मिश्रण (20 μL) में SYBR हरे रंग का 10 μL, ROX संदर्भ डाई का 0.4 μL, आगे और पीछे प्राइमरों में से प्रत्येक में 0.8 μL, ddH2O का 6 μL और टेम्पलेट cDNA का 2 μL (1 μg) शामिल था। शर्तों के तहत पीसीआर प्रवर्धन करें: 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 5 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 34 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, और 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 60 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के पृथक्करण चरण के साथ।
  6. लक्ष्य जीन के एमआरएनए स्तर को हाउसकीपिंग जीन, बढ़ाव कारक 1 α (ईएफ 1) के लिए सामान्य करें। प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए अभिव्यक्ति स्तरों की गणना 2−33सीटी विधि33 द्वारा करें। प्रत्येक जीन के प्राइमर अनुक्रम तालिका 2 में वर्णित हैं।
  7. नाइट्रिक ऑक्साइड के निर्धारण के लिए, ऊतक ग्राइंडर का उपयोग करके ठंडे पीबीएस के 100 μL में सिर के हिस्से (चरण 6.2 में प्राप्त) को समरूप करें। परिणामी पीबीएस और हेड पार्ट सस्पेंशन को 12,000 x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। लाइसेट एकत्र करें और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके नाइट्राइट एकाग्रता परख34 करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

7. जेब्राफिश लोकोमोटिव व्यवहार परख

  1. एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के 24 घंटे बाद, ज़ेबराफिश लार्वा को व्यक्तिगत रूप से 96-वेल स्क्वायर माइक्रोप्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुएं में 300 μL E3 माध्यम जोड़ें और फिर परीक्षण प्लेट में प्रवेश करने के लिए लार्वा को 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. लार्वा-लोडेड माइक्रोप्लेट को ज़ेबराफ़िश ट्रैकिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रकाश स्रोत चालू करें और फिर लार्वा को 30 मिनट के लिए परीक्षण बॉक्स में इनक्यूबेट करें ताकि पर्यावरण को अनुकूलित किया जा सके।
  3. स्वचालित वीडियो ट्रैकिंग सिस्टम का उपयोग करके ज़ेबराफ़िश व्यवहार की निगरानी और रिकॉर्ड करें। प्रत्येक ज़ेबराफिश के लिए रिकॉर्ड 12 सत्र (प्रत्येक 5 मिनट, कुल 1 घंटे)। कुल दूरी (निष्क्रिय, छोटी और बड़ी दूरी से युक्त) को उस दूरी (मिमी में) के रूप में परिभाषित करें जो प्रत्येक मछली 60 मिनट की ट्रैकिंग अवधि के दौरान स्थानांतरित होती है।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. मानक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. साधारण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके दो समूहों के बीच अंतर का सांख्यिकीय विश्लेषण करें। सहसंबंधों की ताकत का आकलन करने के लिए पियरसन के सहसंबंध गुणांक की गणना करें। पी < 0.05 को सभी विश्लेषणों में महत्वपूर्ण माना गया था।

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Representative Results

यहां वर्णित वर्कफ़्लो ज़ेबराफ़िश लार्वा में एलपीएस-मध्यस्थता न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करने के लिए एक नई, त्वरित और कुशल पद्धति प्रस्तुत करता है। इस वर्णित प्रोटोकॉल में, 5 डीपीएफ जेब्राफिश को माइक्रोइंजेक्टर (चित्रा 2 ए-सी) का उपयोग करके मस्तिष्क वेंट्रिकल में एलपीएस (चित्रा 1) के साथ इंजेक्ट किया गया था। मस्तिष्क वेंट्रिकल साइट में सफल इंजेक्शन 1% इवांस ब्लू स्टेन (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। मस्तिष्क में न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी के निर्धारण पर जेब्राफिश शरीर में भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति और नाइट्रिक ऑक्साइड रिलीज के किसी भी प्रभाव को बाहर करने के लिए सिरिंज (चित्रा 2 ई) का उपयोग करके जेब्राफिश सिर को अपनी आंखों और शरीर से अलग किया गया था।

पीबीएस (एलपीएस के रूप में) की एक ही मात्रा को ज़ेब्राफिश मस्तिष्क वेंट्रिकुलर क्षेत्र में शाम-संचालित नियंत्रण के रूप में इंजेक्ट किया गया था। विशेष रूप से न्यूरॉन्स में नियंत्रण और शाम-संचालित समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया, विशेष रूप से राफे नाभिक (आरए) (चित्रा 3 ए-सी), मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति एकीकृत घनत्व (चित्रा 3 डी, ई), ज़ेबराफिश के आंदोलन की कुल दूरी (चित्रा 4 ए, बी), प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (टीएनएफ -α) का कोई उत्पादन और एमआरएनए अभिव्यक्ति नहीं। आईएल -6, और आईएल -1) (चित्रा 4 ए-डी), और लार्वा जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती (चित्रा 6 ए, बी)। इन परिणामों से पता चला है कि उचित माइक्रोइंजेक्शन जेब्राफिश में किसी भी न्यूरोटॉक्सिसिटी और न्यूरोइन्फ्लेमेशन का कारण नहीं बनता है।

24 घंटे के उपचार के बाद, एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन ने जेब्राफिश में न्यूरोटॉक्सिसिटी को प्रेरित किया। एलपीएस (1-5 मिलीग्राम / एमएल) ने नियंत्रण और शाम समूहों (चित्रा 3 ए-सी) की तुलना में टीजी (ईटीवीमैट 2: जीएफपी) लार्वा ज़ेबराफिश के मस्तिष्क में आरए न्यूरॉन्स के महत्वपूर्ण नुकसान को प्रेरित किया। ट्रांसजेनिक लाइन एलाव 13: एमचेरी जेब्राफिश परमाणु लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन35 के साथ न्यूरोनल कोशिकाओं को रेखांकित करती है। जैसा कि चित्रा 3 डी, ई में दिखाया गया है, 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस ने इस लार्वा जेब्राफिश लाइन में मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति एकीकृत घनत्व में महत्वपूर्ण परिवर्तन किए। हालांकि, 1 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस इंजेक्शन समूह ने नियंत्रण और शाम समूहों की तुलना में मस्तिष्क न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति एकीकृत घनत्व पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया। इसके अलावा, 5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस ने हरकत की कमी (चित्रा 4 ए) को प्रेरित किया और 60 मिनट की ट्रैकिंग अवधि में ज़ेबराफिश की गति की कुल दूरी को कम कर दिया (चित्रा 4 बी)। परिणामों से पता चला है कि 1-2.5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस न्यूरॉन्स के नुकसान को प्रेरित कर सकता है लेकिन कोई महत्वपूर्ण हरकत की कमी नहीं है।

इसके अलावा, एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन भी ज़ेबराफिश मस्तिष्क में भड़काऊ प्रतिक्रिया को सक्रिय कर सकते हैं। जेब्राफिश लार्वा के सिर में प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स (टीएनएफ-α, आईएल -6, और आईएल -1) (चित्रा 5 बी-डी) के कोई उत्पादन (चित्रा 5 ए) और एमआरएनए अभिव्यक्ति नियंत्रण और शाम समूहों में अभिव्यक्ति की तुलना में 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस उपचार पर बढ़ी थी। 1-5 मिलीग्राम / एमएल एलपीएस इंजेक्शन के बाद, लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती देखी गई (चित्रा 6 ए), जिसके परिणामस्वरूप टीजी (एमपीओ: ईजीएफपी) जेब्राफिश मस्तिष्क क्षेत्र (चित्रा 6 बी) में न्यूट्रोफिल की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई।

क़दम ऑपरेटिंग समय (sec) गर्मी का स्तर क्रिया
T1 एल> H80-89 P1L005
T2 1.6-3 H00
T3 एल> H00 P2L001c
T4 3 H00 ठंडा
T5 0 H00

तालिका 1: ग्लास केशिका ट्यूब खींचने के लिए पांच-चरण प्रोटोकॉल।

प्राइमर का नाम अनुक्रम
IL-1β forward 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3'
IL-1β reverse 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3'
आईएल-6 आगे 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3'
आईएल-6 का उलटा 5'-TCTTTCTCTTTTCCTCG-3'
TNF-α आगे 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3'
TNF-α रिवर्स 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3'
Ef1α forward 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3'
Ef1α reverse 5'-AGGGCATCAAGAAGAGAGAGAGAGAGACCG-3'

तालिका 2: रियल टाइम क्यूपीसीआर में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।

Figure 1
चित्रा 1: लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) की सामान्य संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: माइक्रोइंजेक्शन सेटअप, शरीर की मुद्रा और ज़ेबराफिश की स्थिति, और सिर के हिस्से को अलग करना। (A) ग्लास सुई चयन: माइक्रोस्कोप के नीचे एक पूर्व-खींची गई सुई की नोक को काटने के लिए एक चिमटी का उपयोग करें, ताकि आकृति में दिखाए गए समान उद्घाटन के साथ सुई प्राप्त की जा सके। (बी) माइक्रोस्कोप की फोकल लंबाई को समायोजित करें ताकि जेब्राफिश लार्वा के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर क्षेत्र को उच्च आवर्धन (काले रंग में उल्लिखित) पर देखा जा सके। हल्के नीले घेरे इंजेक्शन साइट को इंगित करते हैं। (सी) माउंटेड लार्वा को सुई तक पहुंच के लिए मस्तिष्क की तरफ उन्मुख होने की आवश्यकता होती है (लाल सर्कल द्वारा इंगित मस्तिष्क टेक्टम)। (डी) जेब्राफिश लार्वा मस्तिष्क में इवांस ब्लू के साथ सफल वेंट्रिकुलर इंजेक्शन का प्रदर्शन। (ई) आंख और जर्दी थैली क्षेत्रों के बिना ज़ेबराफिश सिर का हिस्सा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एलपीएस का मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन जेब्राफिश लार्वा में 24 घंटे के बाद न्यूरॉन्स को उत्तेजित करता है। (ए) (शीर्ष) एलपीएस की विभिन्न सांद्रता के साथ उपचार के बाद वीमैट 2: जीएफपी जेब्राफिश की प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां (लाल कोष्ठक राफ नाभिक [आरए] न्यूरॉन्स का संकेत देते हैं; स्केल बार = 265.2 μm)। (नीचे) आकृति विज्ञान विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार के लिए आरए न्यूरोनल क्षेत्र को बढ़ाया गया था। (बी, सी) vmat2: GFP ज़ेब्राफिश लार्वा में आरए न्यूरॉन क्षेत्र की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता और लंबाई। (D, E) प्रतिनिधि आकृति विज्ञान (स्केल बार = 265.2 μm) और Tg (elavl3: mCherry) ज़ेब्राफिश मस्तिष्क न्यूरॉन्स की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता। डेटा को नियंत्रण समूह के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी < 0.05 और ** पी 0.01 बनाम नियंत्रण समूह <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एलपीएस का मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन जेब्राफिश लार्वा में 24 घंटे के बाद हरकत की कमी को प्रेरित करता है। डिजिटल ट्रैकिंग मानचित्र में, उच्च गति आंदोलन को लाल रेखाओं (> 6.6 मिमी / सेकंड) द्वारा दर्शाया जाता है; मध्यम गति आंदोलन को हरी रेखाओं (3.3−6.6 मिमी / एस) द्वारा चित्रित किया गया है; कम गति आंदोलन को काली रेखाओं (< 3.3 मिमी / सेकंड) द्वारा चित्रित किया गया है। (बी) 60 मिनट में जेब्राफिश द्वारा तय की गई औसत कुल दूरी का मात्रात्मक विश्लेषण * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एलपीएस का मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन प्रो-भड़काऊ मध्यस्थों को बढ़ाता है। (ए) नाइट्रिक ऑक्साइड के स्तर को ग्रिस अभिकर्मक का उपयोग करके मापा गया था। (बी-डी) जेब्राफिश हेड में इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), इंटरल्यूकिन -1 (आईएल -1) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर -α (टीएनएफ -α) के जीन अभिव्यक्ति स्तर की जांच क्यूपीसीआर द्वारा की गई थी। * पी < 0.05 और ** पी 0.01 बनाम नियंत्रण समूह <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन 24 घंटे के बाद जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती की ओर जाता है। (ए) एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन (स्केल बार = 851.1 μm) के बाद लार्वा के सिर में न्यूट्रोफिल (लाल सर्कल के अंदर का क्षेत्र) का प्रवास। (बी) एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन के बाद लार्वा सिर में न्यूट्रोफिल की संख्या। * पी < 0.05 और ** पी 0.01 बनाम नियंत्रण समूह <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

महामारी विज्ञान और प्रयोगात्मक डेटा की बढ़ती मात्रा न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए संभावित जोखिम कारकों के रूप में पुरानी जीवाणु और वायरल संक्रमणको फंसाती है। संक्रमण भड़काऊ प्रक्रियाओं और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की सक्रियता को ट्रिगर करताहै। यहां तक कि अगर प्रतिक्रिया एक रक्षा तंत्र के रूप में कार्य करती है, तो अतिसक्रिय सूजन न्यूरोजेनेसिस के लिए हानिकारक है, और भड़काऊ वातावरण नवजात न्यूरॉन्सके अस्तित्व की अनुमति नहीं देता है। नतीजतन, यह मेजबान न्यूरोनल कार्यों और व्यवहार्यता को नुकसान पहुंचाता है। अध्ययनों से संकेत मिलता है कि सूजन न्यूरोडीजेनेरेशन39 के पैथोफिज़ियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।

अक्सर अध्ययन किए गए रोगजनक एंडोटॉक्सिन के रूप में, एलपीएस को न्यूरोजेनेसिस और न्यूरोडीजेनेरेशन के निषेध में फंसाया गया है। भड़काऊ प्रक्रियाओं का एलपीएस सक्रियण न्यूरोजेनेसिस को काफी कम करता है, आंशिक रूप से एनओ, टीएनएफ -α, आईएल -6, और आईएल -140 के उत्पादन के माध्यम से। साक्ष्य का एक बढ़ता शरीर दर्शाता है कि एलपीएस व्यवहार की कमी और न्यूरोनल हानि का कारण बनता है, और न्यूरोडीजेनेरेटिव कृंतक मॉडल10,38 में केंद्रीय रूप से इंजेक्ट किए जाने पर न्यूरोजेनेसिस प्रगति को प्रभावित करता है। ज़ेब्राफिश मॉडल को प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने और नई विरोधी भड़काऊ दवाओं को स्क्रीन करने के लिए वैकल्पिक प्रयोगात्मक मॉडलके रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। ज़ेबराफिश की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षाप्रणाली स्तनधारियों के समान है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों ने ज़ेबराफिश सीएनएस43 में स्तनधारियों में मौजूद कई भड़काऊ साइटोकिन्स और रिसेप्टर्स की पहचान की है। पहले के अध्ययनों से पता चलता है कि एलपीएस में जेब्राफिश भ्रूण / लार्वा को डुबोने या जेब्राफिश लार्वा की जर्दी में एलपीएस इंजेक्ट करने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित किया जा सकता है और सूजन से जुड़े प्रो-भड़काऊकारकों को बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, ज़ेबराफिश तंत्रिका ऊतक पर एलपीएस का विशिष्ट प्रभाव, और न्यूरोइन्फ्लेमेशन के प्रेरण पर, अभी तक ज्ञात नहीं है।

यद्यपि कृंतक मॉडल में अन्य पशु मॉडल पर कई फायदे हैं, लेकिन विवो इमेजिंग और ड्रग स्क्रीनिंग में वास्तविक समय के संदर्भ में उनकी सीमाएं स्पष्ट हैं। विवो इमेजिंग में व्यापक रूप से तंत्रिका तंत्र के विकास और पैथोलॉजिकल मस्तिष्क परिवर्तनों को अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली और गैर-आक्रामक उपकरण46,47 के रूप में उपयोग किया जाता है। ज़ेबराफिश भ्रूण और लार्वा की ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, वे मस्तिष्क अवलोकन48,49 के लाइव इमेजिंग प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। विशेष रूप से, ज़ेबराफ़िश के छोटे आकार, और हजारों भ्रूणों का उत्पादन करने की उनकी क्षमता का मतलब है कि ज़ेबराफ़िश भ्रूण या लार्वा50,51 का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग की जा सकती है। इसके अलावा, विज्ञान और प्रौद्योगिकी में विकास के साथ, रोबोटिक माइक्रोइंजेक्शन को सटीक और प्रभावी ढंग से वितरित किया जा सकता है, और इसका उपयोग बड़ी मात्रा में भ्रूण या लार्वा52,53 को इंजेक्ट करने के लिए किया जा सकता है। बड़ी संख्या में भ्रूण या लार्वा में सामग्री के समय पर इंजेक्शन के लिए न्यूरोनल अनुसंधान के लिए माइक्रोरोबोटिक इंजेक्शन प्रणाली का अनुप्रयोग, बायोमोलेक्यूल्स और दवा यौगिकों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करेगा।

इस अध्ययन में, 5 डीपीएफ पर ज़ेब्राफिश को 2.5-5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एलपीएस के साथ इंजेक्ट किया गया था; यह न्यूरोइन्फ्लेमेशन मॉडल विकास के लिए इष्टतम स्थिति के रूप में निर्धारित किया गया था। हमारे ज्ञान के लिए, इस पद्धति को साहित्य में वर्णित नहीं किया गया है। नतीजतन, जेब्राफिश लार्वा में एलपीएस के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन न्यूरॉन्स के नुकसान और हरकत की कमी का कारण बनने में सक्षम था। इसके अलावा, हमारे परिणामों से पता चला है कि एलपीएस-प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन एनओ, टीएनएफ-α, आईएल -6 और आईएल -1 जैसे प्रोइन्फ्लेमेटरी मध्यस्थों के स्तर को बढ़ाता है, और इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में लार्वा जेब्राफिश मस्तिष्क में न्यूट्रोफिल की भर्ती की ओर जाता है। अन्य पशु मॉडल में, एलपीएस इंजेक्शन सूजन के विकास को भी बढ़ावा दे सकता है और मस्तिष्क में न्यूरोपैथोलॉजिकल परिवर्तन का कारण बन सकता है 13,54. इस अध्ययन के परिणाम न्यूरोइन्फ्लेमेटरी मार्गों की हमारी समझ को आगे बढ़ाते हैं। इस विधि में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यांत्रिक ऑपरेशन के कारण मस्तिष्क की क्षति से बचने के लिए माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुइयों का उद्घाटन बहुत बड़ा नहीं होना चाहिए, और लार्वा को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए उचित मात्रा में बल लगाया जाना चाहिए। इसके अलावा, भड़काऊ कारकों और नाइट्रिक ऑक्साइड के निर्धारण के लिए जेब्राफिश की आंखों और शरीर से सिर को अलग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह विशेष रूप से एलपीएस मस्तिष्क वेंट्रिकुलर इंजेक्शन द्वारा प्रेरित न्यूरोइन्फ्लेमेशन को दर्शाते हुए दिशात्मक परिणाम प्राप्त करने में मदद करेगा।

इस विधि का एक मामूली नुकसान यह है कि, ज़ेबराफिश लार्वा के छोटे आकार के कारण, होमोजिनाइजेशन और निष्कर्षण द्वारा प्राप्त कुल एमआरएनए जैसे बायोमोलेक्यूल्स की मात्रा माउस मॉडल की तुलना में कम है। हालांकि, ज़ेबराफिश हर हफ्ते कई सौ अंडों के साथ अक्सर पैदा करने में सक्षम है। प्रत्येक समूह में उपयोग किए जाने वाले ज़ेब्राफिश लार्वा की संख्या में वृद्धि विभिन्न जैव रासायनिक परखों के लिए निकाले गए बायोमोलेक्यूल्स की पर्याप्त मात्रा प्रदान कर सकती है। निष्कर्ष में, यह विधि लार्वा ज़ेबराफिश मस्तिष्क में न्यूरोटॉक्सिसिटी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करती है। ज़ेबराफ़िश की पारदर्शिता के कारण, लार्वा जीवित ज़ेबराफ़िश मस्तिष्क में परिवर्तन को विवो इमेजिंग के माध्यम से बेहतर ढंग से समझा जा सकता है। यहां वर्णित तकनीक संभावित एंटी-न्यूरोइन्फ्लेमेटरी दवाओं का जल्दी और कुशलता से मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित घोषित नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को मकाओ एसएआर के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास कोष (एफडीसीटी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एफडीसीटी0058/2019/ए1 और 0016/2019/एकेपी, अनुसंधान समिति, मकाऊ विश्वविद्यालय (MYRG2020-00183-ICMS और CPG2022-00023-ICMS), और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 81803398)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

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न्यूरोसाइंस अंक 186 मस्तिष्क वेंट्रिकल माइक्रोइंजेक्शन ज़ेबराफिश लिपोपॉलीसेकेराइड न्यूरोइन्फ्लेमेशन न्यूरोटॉक्सिसिटी
न्यूरोइन्फ्लेमेशन और न्यूरोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए लार्वा ज़ेबराफिश में लिपोपॉलेसेकेराइड के मस्तिष्क वेंट्रिकुलर माइक्रोइंजेक्शन
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain… More

He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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