Summary
Denne protokollen demonstrerer mikroinjeksjon av lipopolysakkarid i hjernens ventrikulære region i en sebrafisklarvemodell for å studere den resulterende nevroinflammatoriske responsen og nevrotoksisiteten.
Abstract
Nevroinflammasjon er en nøkkelspiller i ulike nevrologiske lidelser, inkludert nevrodegenerative sykdommer. Derfor er det av stor interesse å undersøke og utvikle alternative in vivo nevroinflammasjonsmodeller for å forstå rollen som nevroinflammasjon i nevrodegenerasjon. I denne studien ble en larvesebrafiskmodell av nevroinflammasjon mediert av ventrikulær mikroinjeksjon av lipopolysakkarid (LPS) for å indusere en immunrespons og nevrotoksisitet utviklet og validert. De transgene sebrafisklinjene elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP og mpo:EGFP ble brukt til sanntidskvantifisering av hjernenevronenes levedyktighet ved fluorescenslevende avbildning integrert med fluorescensintensitetsanalyse. Den lokomotoriske oppførselen til sebrafisklarver ble registrert automatisk ved hjelp av en videosporingsopptaker. Innholdet av nitrogenoksid (NO) og mRNA-ekspresjonsnivåene av inflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) og human tumornekrosefaktor α (TNF-α) ble undersøkt for å vurdere LPS-indusert immunrespons i larvesebrafiskhodet. Ved 24 timer etter hjernens ventrikulære injeksjon av LPS ble det observert tap av nevroner og bevegelsesmangel hos sebrafisklarver. I tillegg økte LPS-indusert nevroinflammasjon NO-frigjøring og mRNA-ekspresjon av IL-6, IL-1β og TNF-α i hodet 6 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver, og resulterte i rekruttering av nøytrofiler i sebrafiskhjernen. I denne studien ble injeksjon av sebrafisk med LPS i en konsentrasjon på 2,5-5 mg/ml ved 5 dpf bestemt som den optimale tilstanden for denne farmakologiske nevroinflammasjonsanalysen. Denne protokollen presenterer en ny, rask og effektiv metodikk for mikroinjeksjon av LPS i hjerneventrikkelen for å indusere LPS-mediert nevroinflammasjon og nevrotoksisitet i en sebrafisklarver, som er nyttig for å studere nevroinflammasjon og kan også brukes som en high throughput in vivo drug screening assay.
Introduction
Nevroinflammasjon har blitt beskrevet som en avgjørende anti-nevrogen faktor involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer i sentralnervesystemet (CNS)1. Etter patologiske fornærmelser kan nevroinflammasjon resultere i ulike negative konsekvenser, inkludert inhibering av nevrogenese og induksjon av nevroncelledød 2,3. I prosessen som ligger til grunn for responsen på induksjon, utskilles flere inflammatoriske cytokiner (som TNF-α, IL-1β og IL-6) i det ekstracellulære rommet og fungerer som avgjørende komponenter i nevrondød og undertrykkelse av neurogenese 4,5,6.
Mikroinjeksjon av betennelsesmediatorer (som IL-1β, L-arginin og endotoksiner) i hjernen kan forårsake nevroncellereduksjon og nevroinflammasjon 7,8,9. Lipopolysakkarid (LPS, figur 1), et patogent endotoksin som er tilstede i celleveggen til gramnegative bakterier, kan indusere nevroinflammasjon, forverre nevrodegenerasjon og redusere nevrogenese hos dyr10. LPS-injeksjon direkte inn i CNS i musehjernen økte nivåene av nitrogenoksid, proinflammatoriske cytokiner og andre regulatorer11. Videre kan stereotaksisk injeksjon av LPS i det lokale hjernemiljøet indusere overdreven produksjon av nevrotoksiske molekyler, noe som resulterer i nedsatt nevronfunksjon og påfølgende utvikling av nevrodegenerative sykdommer 10,12,13,14,15. I nevrovitenskapsfeltet er levende og tidskurs mikroskopiske observasjoner av cellulære og biologiske prosesser i levende organismer avgjørende for å forstå mekanismene som ligger til grunn for patogenese og farmakologisk virkning16. Imidlertid er levende avbildning av musemodeller av nevroinflammasjon og nevrotoksisitet fundamentalt begrenset av den begrensede optiske penetrasjonsdybden av mikroskopi, som utelukker funksjonell avbildning og levende observasjon av utviklingsprosesser17,18,19. Derfor er utviklingen av alternative nevroinflammasjonsmodeller av stor interesse for å lette studiet av patologisk utvikling, og mekanismen som ligger til grunn for nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon, ved levende bildebehandling.
Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en lovende modell for å studere nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon på grunn av dets evolusjonært konserverte medfødte immunsystem, optisk gjennomsiktighet, stor embryokoblingsstørrelse, genetisk trekkraft og egnethet for in vivo-avbildning 19,20,21,22,23 . Tidligere protokoller har enten direkte injisert LPS i eggeplommen og bakhjernens ventrikel av larvesebrafisk uten mekanistisk vurdering, eller bare tilsatt LPS til fiskevann (kulturmedium) for å indusere en dødelig systemisk immunrespons24,25,26,27. Her utviklet vi en protokoll for mikroinjeksjon av LPS i hjernens ventrikler, for å utløse en medfødt immunrespons eller nevrotoksisitet i 5 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver. Denne responsen fremgår av nevroncelletap, lokomotorisk atferdsunderskudd, økt nitrittoksidfrigivelse, aktivering av inflammatorisk genuttrykk og rekruttering av nøytrofiler i sebrafiskhjernen ved 24 timer etter injeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB wild-type sebrafisk og transgene sebrafisklinjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP og mpo: EGFP ble hentet fra Institutt for kinesisk medisinsk vitenskap (ICMS). Etisk godkjenning (UMARE-030-2017) for dyreforsøkene ble gitt av Animal Research Ethics Committee, University of Macau, og protokollen følger institusjonens retningslinjer for dyrepleie.
1. Sebrafiskembryo og larvehold
- Generer sebrafiskembryoer (200-300 embryoer per parring) ved naturlig parring som tidligere rapportert28.
- Tilbered eggvann (E3) middels lager (60×) ved å oppløse 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H 2 O og 9,78 g MgCl 2·6H 2 O i ddH 2 O til et endelig volum på 2 L og juster pH til 7,2 ved bruk av NaOH og HCl. For å klargjøre arbeidskonsentrasjonen av E3 medium (1×), fortynn bestanden 60 ganger i ddH2O. Oppbevares ved 28,5 °C når den ikke er i bruk.
- Bruk en plastoverføringspipette til å overføre sebrafiskembryoene til en tallerken som inneholder E3-medium. Hev embryoene ved 28,5 °C i en inkubator og overvåk deres utvikling og helse. Fjern døde embryoer og erstatt urent E3-medium med ferskt medium daglig.
- For sebrafiskavbildningseksperimenter, bruk en plastoverføringspipette for å samle 0-2 timer etter befruktning (hpf) embryoer (rundt 200 egg) i ca. 15 ml 1× E3-medium som inneholder 0,003% N-fenylthiourea (PTU).
MERK: PTU kan hemme dannelsen av melanoforer under embryogenese29. Behandling av embryoer med PTU under embryogenese kan forbedre signaldeteksjon ved mikroskopi eller ekspresjon av fluorescens30. - Oppretthold sebrafiskembryoene under de ovennevnte forholdene til embryoene når ønsket utviklingslarvestadium.
2. Forberedelse til mikroinjeksjon
- Forbered injeksjonen ved å trekke glasskapillærer ved hjelp av en mikropipetteavtrekker (se materialtabell), etter femtrinnsprotokollen for trekking av glasskapillærrør (tabell 1).
- Åpne spissen av nålen (tynne veggglasskapillærer [3,5 tommer] med filament, OD 1,14 mm) til passende størrelse i vinkel ved hjelp av tang (figur 2A).
- Fyll kanylen med 0,1 ml mineralolje for å sikre at det ikke er bobler.
- Fjern skrukorken på stålnålen på mikroinjeksjonsapparatet. Juster glassnålhullet med stålnålen og stram deretter skrukorken. Monter det lastede nålemikroinjeksjonsapparatet i en mikromanipulator (se materialfortegnelse).
- Juster posisjonen til mikroinjeksjonsapparatet slik at mikromanipulatoren fleksibelt kan bevege apparatet under mikroskopet. Tøm et visst volum parafinolje for å få stålnålen til å komme inn i kapillærglassrøret.
- Slipp injeksjonsoppløsningen (for eksempel 1× PBS eller 5 mg / ml LPS) på et glassglass sterilisert med 70% etanol og juster mikroinjeksjonsapparatet slik at spissen settes inn i væskedråpen. Legg ~2 ml injeksjonsvæske, oppløsning i kanylen.
- Sett opp mikromanipulatoren (finjusteringsinnstillinger for opp, ned, venstre og høyre) slik at nålespissen på mikroinjeksjonsapparatet er i samme synsfelt som larvene ved høy forstørrelse (figur 2B).
3. Montering av sebrafisk for mikroinjeksjoner
MERK: Sebrafiskhjerneutvikling skjer innen 3 dpf og modnes ved 5 dpf med et velutviklet sentralnervesystem31,32. Derfor er 5 dpf larver allerede egnet for å studere LPS-mediert nevronskade samt atferdsmessige og inflammatoriske responser.
- Injiser sebrafisklarvene innen ca. 30 minutter etter å ha nådd interessestadiet, for å opprettholde konsistensen av injeksjonstidspunktet.
- For å bedøve sebrafisklarvene, kombiner tricaine med rent akvariumvann (endelig konsentrasjon på 0,02% w / v tricaine).
- Smelt en løsning på 2% agarose i ddH2O ved hjelp av mikrobølgeovn. Hell den smeltede agarosen i en plastfat. Den 2% agarosebelagte plastskålen kan lagres ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Bruk en plastoverføringspipette til å transportere bedøvede larver til midten av den 2% agarosebelagte plastskålen. Orienter de monterte larvene med hjernesiden opp for nåletilgang.
4. Injisere hjernen ventrikkel
- Juster forstørrelsen av mikroskopet slik at hjernens ventrikulære struktur av sebrafisk vises tydelig i synsfeltet (figur 2B).
- Plasser nålen forsiktig over hjernetektumet (figur 2C).
- Punkter huden på sebrafiskhjernen med nålespissen sakte ved hjelp av mikromanipulatoren.
- Trykk på fotpedalen for å løse ut 1 nL 1x PBS eller forskjellige konsentrasjoner av LPS (1,0, 2,5 og 5,0 mg/ml) (se materialfortegnelse). Vellykkede bilder av ventrikelinjeksjon der hjerneventrikkel ble injisert med 1 ml 1 % Evans blått fargestoff (fortynnet i PBS) er vist som et eksempel (figur 2D). Overfør larvene til E3 medium umiddelbart etter injeksjonen. Etter 24 timer, samle larver for mikroskopisk bildebehandling, lokomotiv atferdsanalyse og bestemmelse av andre indikatorer.
5. Bildebehandling
- Forbered 1,5% lavsmelte agaroseoppløsning i E3 medium og varm den i en mikrobølgeovn for å danne en klar væske.
- Bruk en ren plastoverføringspipette til å transportere larvene til en glasssklie og fjern så mye vann som mulig.
- Bruk en plastoverføringspipette for å legge til en dråpe 1,5% lavsmelte agarose til larver.
MERK: Avkjøl lavsmeltet agarose i pipetten en stund før du tilsetter for ikke å skade larvene. - Bruk en 1 ml sprøytekanyle til å orientere larvene. Vent til agarosen er avkjølt og stivner før du starter avbildningen.
- Observer og fotografer nevronregionen i hele hjernen til Tg(ETvmat2:EGFP) og Tg(elavl3:mCherry) sebrafisk, samt rekruttering av nøytrofiler i Tg(mpo:EGFP) sebrafiskhjernen under et fluorescensstereomikroskop (se Materialtabell).
MERK: Fluorescensmikroskopinnstillinger som brukes til avbildning, er vist nedenfor. Tg(ETvmat2:EGFP) sebrafiskhjerne (eksitasjonsbølgelengde: 450-490 nm, emisjonsbølgelengde: 500-550 nm, visuell forstørrelse: 100x); Tg(elavl3:mCherry) sebrafiskhjerne (eksitasjonsbølgelengde: 541-551 nm, emisjonsbølgelengde: 590 nm, visuell forstørrelse: 100x); Tg(mpo:EFGP) sebrafiskhjerne (eksitasjonsbølgelengde: 450-490 nm, emisjonsbølgelengde: 500-550 nm, visuell forstørrelse: 63x). - Måle og analysere fluorescensintensiteten og lengden på Ra-nevronregionen i Tg (ETvmat2: EGFP) sebrafisk og fluorescensintensiteten til Tg (elavl3: mCherry) sebrafiskhjerneneuroner ved hjelp av ImageJ-programvare. Tell nøytrofile manuelt i hjerneområdet til Tg(mpo:EFGP)-sebrafisk.
6. Bestemmelse av genuttrykksmarkører
- Ved 24 timer etter LPS hjerne ventrikulær injeksjon, fortsett med bestemmelse av genuttrykksmarkører. For å gjøre dette, bedøve sebrafisklarver med 0,02% tricaine (som nevnt i trinn 3.2).
- Bruk to 1 ml sprøyter for å skille hodedelene av larvene (40 larver per gruppe) uten øye- og plommesekkregioner (figur 2E).
- Pakk ut RNA fra larvehodedelene.
- For RNA-ekstraksjon, homogeniser hodedelen med 200 μL RNA-ekstraksjonsreagens (se Materialtabell) ved hjelp av en vevkvern (se Materialtabell) med en rotasjonshastighet på 11 000 o / min i 5 s.
- Utfør RNA-ekstraksjon ved bruk av kloroform-isopropanol-metoden. For å gjøre det, tilsett 40 μL kloroform, rist rørene kraftig og inkuber dem ved romtemperatur i 10 minutter. Sentrifuge prøvene ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overfør den vandige fasen til et friskt rør (ca. 100 μL) og tilsett 100 μL isopropanol. Inkuber i 10 minutter og sentrifuger deretter ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Tilsett 200 μL 75% etanol for å vaske RNA-pelleten. Vortex prøvene kort og deretter sentrifuge ved 7500 x g i 5 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask RNA-pelleten igjen.
- Lufttørk RNA-pelleten i 5-10 minutter, tilsett deretter 30 μL RNase-fritt vann for å oppløse RNA-pelleten. Kontroller renheten (forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm) og integriteten til RNA ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer (se materialtabellen).
- Syntetiser cDNA fra RNA ekstrahert i trinn 6.3, ved hjelp av revers transkriptase med tilfeldige primere (se Tabell over materialer).
- Tilsett 1 μL tilfeldige primere, 1 μL dNTP, 1 μg RNA og destillert vann (totalt volum til 12 μL) til et nukleasefritt rør. Varm blandingen til 65 °C i 5 minutter og avkjøl den raskt på is.
- Tilsett 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-hemmer, 4 μL 5× førstestrengsbuffer og 1 μL M-MLV revers transkriptase (totalt volum: 20 μL) til røret. Bland forsiktig og inkuber tuben ved 25 °C i 2 minutter, etterfulgt av 42 °C i 50 minutter. Inaktiver reaksjonen ved oppvarming ved 70 °C i 15 minutter.
- Utfør sanntids PCR på et qPCR-system (se Materialtabell) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RT-qPCR-sett (se Materialtabell) for å bestemme uttrykket av målgenene (IL-1β, IL-6 og TNF-α). Reaksjonsblandingen (20 μL) inneholdt 10 μL SYBR-grønn, 0,4 μL ROX-referansefargestoff, 0,8 μL hver av forover- og reversprimerne, 6 μL ddH 2 O og2μL mal cDNA (1 μg). Utfør PCR-forsterkning under forholdene: 95 °C i 30 s, etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 34 s, og med et dissosiasjonsstadium på 95 °C i 15 s, 60 °C i 60 s og 95 °C i 15 s.
- Normaliser mRNA-nivåene av målgenene til et housekeeping-gen, forlengelsesfaktor 1 α (Ef1α). Beregn ekspresjonsnivåene for hvert målgen ved hjelp av 2-ΔΔCT-metoden33. Primersekvensene til hvert gen er beskrevet i tabell 2.
- For bestemmelse av nitrogenoksid, homogeniser hodedelen (oppnådd i trinn 6.2) i 100 μL kald PBS ved hjelp av en vevkvern. Sentrifuge den resulterende PBS og hodeporsjonssuspensjonen ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Samle lysatene og utfør nitrittkonsentrasjonsanalyse34 ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialtabell).
7. Sebrafisk lokomotiv atferdsanalyse
- Ved 24 timer etter LPS hjerne ventrikulær injeksjon, overfør sebrafisklarvene til brønnene på en 96-brønns firkantet mikroplate individuelt. Tilsett 300 μL E3 medium til hver brønn og inkuber deretter larvene i 4 timer for å akklimatisere seg til testplaten.
- Overfør den larvebelastede mikroplaten til sebrafisksporingsboksen (se materialtabellen). Slå på lyskilden og inkuber larvene i testboksen i 30 minutter for å akklimatisere miljøet.
- Overvåk og registrer sebrafiskens oppførsel ved hjelp av et automatisert videosporingssystem. Ta opp 12 økter (5 min hver, totalt 1 time) for hver sebrafisk. Definer den totale avstanden (består av inaktive, små og store avstander) som avstanden (i mm) som hver fisk beveget seg i løpet av en sporingsperiode på 60 minutter.
8. Statistisk analyse
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av standard analyseprogramvare (se Materialfortegnelse).
- Utføre statistisk analyse av forskjeller mellom to grupper ved bruk av vanlig enveis ANOVA. Beregn Pearsons korrelasjonskoeffisient for å vurdere styrken av korrelasjoner. P < 0,05 ble vurdert som signifikant i alle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten beskrevet her presenterer en ny, rask og effektiv metodikk for å indusere LPS-mediert nevroinflammasjon og nevrotoksisitet hos sebrafisklarver. I denne beskrevne protokollen ble 5 dpf sebrafisk injisert med LPS (figur 1) i hjerneventriklene ved hjelp av en mikroinjektor (figur 2A-C). Vellykket injeksjon i hjernens ventrikkelsted ble verifisert ved bruk av 1% Evans blå flekk (figur 2D). Sebrafiskhodet ble skilt fra øynene og kroppen ved hjelp av sprøyter (figur 2E) for å utelukke påvirkning av inflammatorisk cytokinuttrykk og nitrogenoksidfrigjøring i sebrafisklegemet ved bestemmelse av nevroinflammasjon og nevrotoksisitet i hjernen.
Det samme volumet av PBS (som LPS) ble injisert i sebrafiskhjernens ventrikulære område som en humbug-operert kontroll. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom kontroll- og humbugopererte grupper i nevronene, spesielt fra spesielt den fremre gruppen av raphekjerner (Ra) (figur 3A-C), fluorescensintegrert tetthet av hjerneneuronene (figur 3D, E), den totale bevegelsesavstanden til sebrafisken (figur 4A, B), NO-produksjon og mRNA-uttrykk av proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-6 og IL-1β) (figur 4A-D), og rekruttering av nøytrofiler til larvesebrafiskhjernen (figur 6A,B). Disse resultatene viste at riktig mikroinjeksjon ikke forårsaker nevrotoksisitet og nevroinflammasjon hos sebrafisk.
Etter behandling i 24 timer induserte hjernens ventrikulære injeksjon av LPS nevrotoksisitet hos sebrafisk. LPS (1-5 mg / ml) induserte et signifikant tap av Ra-nevroner i hjernen til Tg (ETvmat2: GFP) larvesebrafisk sammenlignet med kontroll- og humbuggruppene (figur 3A-C). Den transgene linjen elav13: mCherry sebrafisk skisserer nevroncellene med det kjernerøde fluorescerende proteinet35. Som vist i figur 3D, E, førte 2,5-5 mg / ml LPS til signifikante endringer i fluorescensintegrert tetthet av hjerneneuronene i denne larvesebrafisklinjen. Imidlertid viste LPS-injeksjonsgruppen på 1 mg / ml ingen effekt på den fluorescensintegrerte tettheten av hjerneneuronene sammenlignet med kontroll- og humbuggruppene. Videre induserte 5 mg / ml LPS en bevegelsesmangel (figur 4A) og reduserte den totale bevegelsesavstanden til sebrafisk over en 60 min sporingsperiode (figur 4B). Resultatene viste at 1-2,5 mg / ml LPS kunne indusere tap av nevroner, men ingen signifikant bevegelsesmangel.
I tillegg kan hjernens ventrikulære injeksjon av LPS også aktivere den inflammatoriske responsen i sebrafiskhjernen. NO-produksjon (figur 5A) og mRNA-ekspresjon av proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-6 og IL-1β) (figur 5B-D) i hodet av sebrafisklarver ble økt ved 2,5-5 mg/ml LPS-behandling sammenlignet med uttrykket i kontroll- og humbuggruppene. Etter 1-5 mg/ml LPS-injeksjon ble det observert rekruttering av nøytrofiler til larvesebrafiskhjernen (figur 6A), noe som resulterte i en signifikant økning i antall nøytrofiler i Tg(mpo:EGFP) sebrafiskhjerneregionen (figur 6B).
| Skritt | Driftstid (sek) | Varmenivå | Handling |
| T1 | L> | H80-89 | P1L005 |
| T2 | 1.6-3 | H00 | |
| T3 | L> | H00 | P2L001c |
| T4 | 3 | H00 | KJØLIG |
| T5 | 0 | H00 |
Tabell 1: Femtrinnsprotokoll for trekking av glasskapillærrør.
| Primer navn | Sekvens | |
| IL-1β fremover | 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3' | |
| IL-1β omvendt | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 fremover | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 omvendt | 5'-TCTTTCCCTCTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α fremover | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTA-3' | |
| TNF-α omvendt | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α fremover | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α revers | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Tabell 2: Primere brukt i sanntid qPCR.
Figur 1: Generell struktur av lipopolysakkarid (LPS). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mikroinjeksjonsoppsett, kroppsholdning og posisjon av sebrafisk, og separasjon av hodedeler. (A) Valg av glassnål: Bruk en pinsett til å kutte spissen av en ferdigtrukket nål under mikroskopet, for å få en nål med en lignende åpning som vist på figuren. (B) Juster brennvidden på mikroskopet slik at hjernens ventrikulære område av sebrafisklarver kan observeres ved høy forstørrelse (skissert i svart). Lyseblå sirkler indikerer injeksjonsstedet. (C) De monterte larvene må være orientert med hjernesiden opp for nåltilgang (hjernetektum indikert med rød sirkel). (D) Demonstrasjon av vellykket ventrikulær injeksjon med Evans blå i sebrafisk larver hjernen. (E) Sebrafisk hode del uten øyet og eggeplomme sac regioner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hjerneventrikulær injeksjon av LPS ablates nevroner etter 24 timer i sebrafisklarver. (A) (Øverst) Representative fluorescensmikroskopibilder av vmat2:GFP sebrafisk etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av LPS (røde parenteser indikerer raphe nuclei [Ra] nevroner; skala bar = 265,2 μm). (Nederst) Ra neuronal region ble forstørret for å forbedre den morfologiske visualiseringen. (B,C) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet og lengde av Ra-nevronregionen i vmat2: GFP sebrafisk larver. (D,E) Representativ morfologi (skalalinje = 265,2 μm) og gjennomsnittlig fluorescensintensitet av Tg(elavl3:mCherry) sebrafiskhjernenevroner. Data uttrykkes som en prosentandel av kontrollgruppen. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Hjerneventrikulær injeksjon av LPS induserer bevegelsesmangel etter 24 timer i sebrafisklarver. (A) Representative mønstre av sebrafiskens bevegelsesspor. I det digitale sporingskartet er høyhastighetsbevegelse representert av røde linjer (> 6,6 mm / s); middels hastighet bevegelse er avbildet av grønne linjer (3,3-6,6 mm / s); Lavhastighetsbevegelse er avbildet med svarte linjer (< 3,3 mm / s). (B) Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig total tilbakelagt distanse av sebrafisken på 60 min. * P < 0,05 mot kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Hjerneventrikulær injeksjon av LPS øker proinflammatoriske mediatorer. (A) Nitrogenoksidnivåer ble målt ved hjelp av Griess-reagens. (B-D) Genuttrykksnivåene av interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α) i sebrafiskhodet ble undersøkt ved qPCR. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: LPS hjerne ventrikulær mikroinjeksjon fører til rekruttering av nøytrofiler i sebrafiskhjernen etter 24 timer. (A) Migrasjon av nøytrofiler (område inne i den røde sirkelen) inn i larvehodet etter LPS hjerne ventrikulær injeksjon (skala bar = 851,1 μm). (B) Antall nøytrofiler i larvehoder etter LPS hjerne ventrikulær injeksjon. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrollgruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1: Rådata Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En økende mengde epidemiologiske og eksperimentelle data impliserer kroniske bakterielle og virusinfeksjoner som mulige risikofaktorer for nevrodegenerative sykdommer36. Infeksjonen utløser aktivering av inflammatoriske prosesser og vertsimmunresponser37. Selv om responsen virker som en forsvarsmekanisme, er overaktivert betennelse skadelig for nevrogenese, og det inflammatoriske miljøet tillater ikke overlevelse av nyfødte nevroner38. Som et resultat forårsaker det skade på vertsneuronale funksjoner og levedyktighet. Studier indikerer at betennelse spiller en viktig rolle i patofysiologien til nevrodegenerasjon39.
Som et hyppig studert patogent endotoksin har LPS vært involvert i hemming av nevrogenese og nevrodegenerasjon. LPS-aktivering av inflammatoriske prosesser svekker nevrogenesen betydelig, delvis gjennom produksjon av NO, TNF-α, IL-6 og IL-1β40. En økende mengde bevis viser at LPS forårsaker atferdsunderskudd og nevrontap, og påvirker nevrogeneseprogresjon når det injiseres sentralt i nevrodegenerative gnagermodeller10,38. Sebrafiskmodeller har blitt mye brukt som alternative eksperimentelle modeller for å studere immunresponser41 og screene nye antiinflammatoriske legemidler. Sebrafiskens medfødte og adaptive immunforsvar ligner på pattedyr42. Videre har noen studier identifisert flere inflammatoriske cytokiner og reseptorer som finnes hos pattedyr i sebrafisken CNS43. Tidligere studier tyder på at nedsenking av sebrafiskembryoer / larver i LPS eller injeksjon av LPS i eggeplommen av sebrafisklarver kan indusere immunresponsen og øke proinflammatoriske faktorer forbundet med betennelse44,45. Den spesifikke effekten av LPS på sebrafiskens nervevev, og på induksjon av nevroinflammasjon, er imidlertid ennå ikke kjent.
Selv om gnagermodeller har mange fordeler i forhold til andre dyremodeller, er deres begrensninger når det gjelder sanntids in vivo-bildebehandling og narkotikascreening åpenbare. In vivo imaging er mye brukt til å undersøke mekanismene som ligger til grunn for utvikling av nervesystemet og patologiske hjerneendringer som et kraftig og ikke-invasivt verktøy46,47. På grunn av den optiske gjennomsiktigheten til sebrafiskembryoer og larver, er de godt egnet til levende bildeeksperimenter av hjerneobservasjon48,49. Spesielt den lille størrelsen på sebrafisk, og deres evne til å produsere tusenvis av embryoer, betyr at narkotikascreening med høy gjennomstrømning kan utføres ved hjelp av sebrafiskembryoer eller larver50,51. Videre, med utviklingen innen vitenskap og teknologi, kan robotmikroinjeksjoner leveres nøyaktig og effektivt, og kan brukes til å injisere store mengder embryoer eller larver52,53. Anvendelsen av det mikrorobotiske injeksjonssystemet til nevronforskning, for rettidig injeksjon av materialer i et stort antall embryoer eller larver, vil lette storskala screening av biomolekyler og narkotikaforbindelser.
I denne studien ble sebrafisk ved 5 dpf injisert med LPS i en konsentrasjon på 2,5-5 mg/ml; Dette ble bestemt som den optimale tilstanden for utvikling av nevroinflammasjonsmodeller. Så vidt vi vet er denne metodikken ikke beskrevet i litteraturen. Følgelig var hjernens ventrikulære mikroinjeksjon av LPS i sebrafisklarver i stand til å forårsake tap av nevroner og bevegelsesmangel. Videre viste våre resultater at LPS-indusert nevroinflammasjon øker nivåene av proinflammatoriske mediatorer som NO, TNF-α, IL-6 og IL-1β, og fører til rekruttering av nøytrofiler i larvesebrafiskhjernen ved 24 timer etter injeksjon. I andre dyremodeller kan LPS-injeksjon også fremme utviklingen av betennelse og forårsake nevropatologiske endringer i hjernen13,54. Resultatene fra denne studien fremmer vår forståelse av nevroinflammatoriske veier. I denne metoden bør det bemerkes at åpningen av nåler for mikroinjeksjon ikke skal være for stor for å unngå hjerneskade forårsaket av mekanisk drift, og en rimelig mengde kraft bør påføres for å unngå å skade larver. I tillegg er det viktig å skille hodet fra øynene og kroppen av sebrafisk for bestemmelse av inflammatoriske faktorer og nitrogenoksid, da dette vil bidra til å oppnå retningsresultater som spesifikt reflekterer nevroinflammasjon indusert av LPS hjerne ventrikulær injeksjon.
En liten ulempe ved denne metoden er at på grunn av den lille størrelsen på sebrafisklarver er mengden biomolekyler som totalt mRNA oppnådd ved homogenisering og ekstraksjon lavere enn musemodellen. Sebrafisk er imidlertid i stand til å gyte ofte med flere hundre egg hver uke. Å øke antall sebrafisklarver som brukes i hver gruppe kan gi tilstrekkelige mengder ekstraherte biomolekyler for forskjellige biokjemiske analyser. Avslutningsvis induserer denne metoden nevrotoksisitet og en immunrespons i larvesebrafiskhjernen. På grunn av sebrafiskens gjennomsiktighet kan endringer i larvehjernen til levende sebrafisk forstås bedre via in vivo-avbildning. Teknikken beskrevet her er et utmerket verktøy for raskt og effektivt å evaluere mulige anti-neuroinflammatoriske legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Science and Technology Development Fund (FDCT) av Macao SAR (Ref. nr. FDCT0058/2019/A1 og 0016/2019/AKP), Forskningsutvalget, University of Macau (MYRG2020-00183-ICMS og CPG2022-00023-ICMS), og National Natural Science Foundation of China (nr. 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
