Summary
Denne protokol demonstrerer mikroinjektion af lipopolysaccharid i hjernens ventrikulære region i en zebrafisk larvemodel for at studere det resulterende neuroinflammatoriske respons og neurotoksicitet.
Abstract
Neuroinflammation er en nøglespiller i forskellige neurologiske lidelser, herunder neurodegenerative sygdomme. Derfor er det af stor interesse at forske og udvikle alternative in vivo neuroinflammationsmodeller for at forstå neuroinflammations rolle i neurodegeneration. I denne undersøgelse blev en larve zebrafisk model af neuroinflammation medieret af ventrikulær mikroinjektion af lipopolysaccharid (LPS) for at inducere et immunrespons og neurotoksicitet udviklet og valideret. De transgene zebrafisklinjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP og mpo: EGFP blev brugt til realtidskvantificering af hjernens neuronlevedygtighed ved fluorescens levende billeddannelse integreret med fluorescensintensitetsanalyse. Zebrafisklarvernes lokomotoriske opførsel blev optaget automatisk ved hjælp af en videosporingsoptager. Indholdet af nitrogenoxid (NO) og mRNA-ekspressionsniveauerne af inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) og human tumornekrosefaktor α (TNF-α) blev undersøgt for at vurdere det LPS-inducerede immunrespons i larvezebrafiskhovedet. Ved 24 timer efter hjernens ventrikulære injektion af LPS blev tab af neuroner og bevægelsesmangel observeret i zebrafisklarver. Derudover øgede LPS-induceret neuroinflammation NO-frigivelse og mRNA-ekspression af IL-6, IL-1β og TNF-α i hovedet på 6 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisklarver og resulterede i rekruttering af neutrofiler i zebrafiskhjernen. I denne undersøgelse blev injektion af zebrafisk med LPS i en koncentration på 2,5-5 mg / ml ved 5 dpf bestemt som den optimale betingelse for dette farmakologiske neuroinflammationsassay. Denne protokol præsenterer en ny, hurtig og effektiv metode til hjerneventrikel mikroinjektion af LPS for at inducere LPS-medieret neuroinflammation og neurotoksicitet i en zebrafisklarve, hvilket er nyttigt til at studere neuroinflammation og også kan bruges som en high-throughput in vivo lægemiddelscreeningsanalyse.
Introduction
Neuroinflammation er blevet beskrevet som en afgørende anti-neurogen faktor involveret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme i centralnervesystemet (CNS)1. Efter patologiske fornærmelser kan neuroinflammation resultere i forskellige negative konsekvenser, herunder hæmning af neurogenese og induktion af neuronal celledød 2,3. I den proces, der ligger til grund for responsen på inflammationsinduktion, udskilles flere inflammatoriske cytokiner (såsom TNF-α, IL-1β og IL-6) i det ekstracellulære rum og fungerer som afgørende komponenter i neurondød og undertrykkelse af neurogenese 4,5,6.
Mikroinjektion af inflammationsmediatorer (såsom IL-1β, L-arginin og endotoksiner) i hjernen kan forårsage neuronal cellereduktion og neuroinflammation 7,8,9. Lipopolysaccharid (LPS, figur 1), et patogent endotoksin, der findes i cellevæggen af gramnegative bakterier, kan inducere neuroinflammation, forværre neurodegeneration og reducere neurogenese hos dyr10. LPS-injektion direkte i CNS i musehjernen øgede niveauet af nitrogenoxid, proinflammatoriske cytokiner og andre regulatorer11. Desuden kan stereotaxisk injektion af LPS i det lokale hjernemiljø fremkalde overdreven produktion af neurotoksiske molekyler, hvilket resulterer i nedsat neuronal funktion og efterfølgende udvikling af neurodegenerative sygdomme 10,12,13,14,15. Inden for neurovidenskab er levende og tidsmæssige mikroskopiske observationer af cellulære og biologiske processer i levende organismer afgørende for at forstå de mekanismer, der ligger til grund for patogenese og farmakologisk virkning16. Imidlertid er levende billeddannelse af musemodeller af neuroinflammation og neurotoksicitet grundlæggende begrænset af den begrænsede optiske penetrationsdybde af mikroskopi, hvilket udelukker funktionel billeddannelse og levende observation af udviklingsprocesser17,18,19. Derfor er udviklingen af alternative neuroinflammationsmodeller af stor interesse for at lette undersøgelsen af patologisk udvikling og mekanismen bag neuroinflammation og neurodegeneration ved levende billeddannelse.
Zebrafisk (Danio rerio) er opstået som en lovende model til at studere neuroinflammation og neurodegeneration på grund af dets evolutionært bevarede medfødte immunsystem, optisk gennemsigtighed, stor embryokoblingsstørrelse, genetisk kanallighed og egnethed til in vivo-billeddannelse 19,20,21,22,23 . Tidligere protokoller har enten direkte injiceret LPS i æggeblommen og baghjerneventriklen af larvezebrafisk uden mekanistisk vurdering eller simpelthen tilføjet LPS til fiskevand (kulturmedium) for at inducere et dødeligt systemisk immunrespons24,25,26,27. Heri udviklede vi en protokol for mikroinjektion af LPS i hjernens ventrikler for at udløse et medfødt immunrespons eller neurotoksicitet i de 5 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisklarver. Dette svar fremgår af neuronalt celletab, lokomotorisk adfærdsunderskud, øget frigivelse af nitritoxid, aktivering af inflammatorisk genekspression og rekruttering af neutrofiler i zebrafiskhjernen ved 24 timer efter injektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
AB vildtype zebrafisk og transgene zebrafisk linjer elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP og mpo: EGFP blev opnået fra Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Etisk godkendelse (UMARE-030-2017) til dyreforsøgene blev givet af Animal Research Ethics Committee, University of Macau, og protokollen følger de institutionelle retningslinjer for dyrepleje.
1. Zebrafisk embryo og larve husdyrhold
- Generer zebrafiskembryoner (200-300 embryoner pr. parring) ved naturlig parvis parring som tidligere rapporteret28.
- Ægvand (E3) medium lager (60×) ved at opløse 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H 2 O og 9,78 g MgCl 2·6H 2 O i ddH 2 O til et endeligt volumen på 2 L og justere pH til 7,2 ved hjælpaf NaOH og HCI. For at forberede arbejdskoncentrationen af E3-medium (1×) fortyndes 60 gange i ddH 2O.Opbevares ved 28,5 °C, når den ikke er i brug.
- Brug en plastoverførselspipette til at overføre zebrafiskembryonerne til en skål, der indeholder E3-medium. Embryonerne hæves ved 28,5 °C i en inkubator, og deres udvikling og sundhed overvåges. Fjern døde embryoner og udskift urent E3-medium med frisk medium dagligt.
- Til zebrafiskbilleddannelseseksperimenter skal du bruge en plastoverførselspipette til at indsamle 0-2 timer efter befrugtning (hpf) embryoner (ca. 200 æg) i ca. 15 ml 1× E3-medium indeholdende 0,003% N-phenylthiourea (PTU).
BEMÆRK: PTU kan hæmme dannelsen af melanoforer under embryogenese29. Behandling af embryoner med PTU under embryogenese kan forbedre signaldetektion i mikroskopi eller ekspression af fluorescens30. - Vedligehold zebrafiskembryonerne under ovennævnte forhold, indtil embryoner når det ønskede udviklingsmæssige larvestadium.
2. Forberedelse til mikroinjektion
- Forbered injektionen ved at trække i glaskapillærer ved hjælp af en mikropipettetrækker (se Materialetabel) efter femtrinsprotokollen for træk af glaskapillarrør (tabel 1).
- Åbn spidsen af nålen (tynde vægglaskapillærer [3,5 tommer] med glødetråd, OD 1,14 mm) i den passende størrelse i en vinkel ved hjælp af tang (figur 2A).
- Fyld nålen med 0,1 ml mineralolie for at sikre, at der ikke er bobler.
- Fjern skruelåget på mikroinjektionsapparatets stålnål. Juster glasnålhullet med stålnålen, og stram derefter skruelåget. Monter det indlæste nålemikroinjektionsapparat i en mikromanipulator (se Materialetabel).
- Juster mikroinjektionsapparatets position, så mikromanipulatoren fleksibelt kan flytte apparatet under mikroskopet. Tøm et bestemt volumen paraffinolie for at få stålnålen til at komme ind i kapillarglasrøret.
- Injektionsopløsningen (f.eks. 1× PBS eller 5 mg/ml LPS) hældes på et glasglas steriliseret med 70 % ethanol, og mikroinjektionsapparatet justeres, så spidsen indsættes i væskedråben. Der hældes ~2 μL injektionsvæske i kanylen.
- Opsæt mikromanipulatoren (finjusteringsindstillinger for op, ned, venstre og højre), så nålespidsen på mikroinjektionsapparatet er i samme synsfelt som larverne ved høj forstørrelse (figur 2B).
3. Montering af zebrafisk til mikroinjektioner
BEMÆRK: Zebrafisk hjerneudvikling sker inden for 3 dpf og modnes ved 5 dpf med et veludviklet centralnervesystem31,32. Derfor er 5 dpf larver allerede egnede til at studere LPS-medieret neuronal skade samt adfærdsmæssige og inflammatoriske reaktioner.
- Injicer zebrafisklarverne inden for ca. 30 minutter efter at have nået interessestadiet for at opretholde konsistensen af injektionstimingen.
- For at bedøve zebrafisklarverne kombineres tricain med rent akvariumvand (endelig koncentration på 0,02% w/v tricain).
- Smelt en opløsning på 2% agarose i ddH2O ved hjælp af en mikrobølgeovn. Hæld den smeltede agarose i en plastikskål. Den 2% agarosebelagte plastskål kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
- Brug en plastoverførselspipette til at transportere bedøvede larver til midten af den 2% agarosebelagte plastskål. Orienter de monterede larver med hjernesiden opad for nåleadgang.
4. Injektion af hjernens ventrikel
- Juster mikroskopets forstørrelse, så zebrafiskens ventrikulære struktur i hjernen vises tydeligt i synsfeltet (figur 2B).
- Placer nålen forsigtigt over hjernetektumet (figur 2C).
- Punktere huden på zebrafiskhjernen med nålespidsen langsomt ved hjælp af mikromanipulatoren.
- Tryk på fodpedalen for at skubbe 1 nL 1x PBS eller forskellige koncentrationer af LPS (1,0, 2,5 og 5,0 mg / ml) (se materialetabel). Billeder af vellykket ventrikelinjektion, hvor hjerneventrikel blev injiceret med 1 nL af 1% Evans blåt farvestof (fortyndet i PBS), er vist som et eksempel (figur 2D). Overfør larverne til at rense E3-mediet umiddelbart efter injektionen. Efter 24 timer samles larverne til mikroskopisk billeddannelse, lokomotivadfærdsanalyse og bestemmelse af andre indikatorer.
5. Billedbehandling
- Forbered 1,5% lavsmeltet agaroseopløsning i E3-medium og opvarm det i en mikrobølgeovn for at danne en klar væske.
- Brug en ren plastoverførselspipette til at transportere larverne til en glasrutsjebane og fjern så meget vand som muligt.
- Brug en plastoverførselspipette til at tilføje en dråbe 1,5% lavsmeltet agarose til larverne.
BEMÆRK: Afkøl lavsmeltet agarose i pipetten et stykke tid, før du tilføjer for ikke at skade larverne. - Brug en 1 ml sprøjtenål til at orientere larverne. Vent, indtil agarosen køler ned og størkner, før du begynder at billeddanne.
- Observer og fotografer neuronområdet i hele hjernen hos Tg(ETvmat2:EGFP) og Tg(elavl3:mCherry) zebrafisk samt rekruttering af neutrofiler i Tg(mpo:EGFP)-zebrafiskhjernen under et fluorescensstereomikroskop (se Materialetabel).
BEMÆRK: Fluorescensmikroskopindstillinger, der bruges til billeddannelse, er vist nedenfor. Tg(ETvmat2:EGFP) zebrafiskhjerne (excitationsbølgelængde: 450-490 nm, emissionsbølgelængde: 500-550 nm, visuel forstørrelse: 100x); Tg(elavl3:mCherry) zebrafiskhjerne (excitationsbølgelængde: 541-551 nm, emissionsbølgelængde: 590 nm, visuel forstørrelse: 100x); Tg(mpo:EFGP) zebrafiskhjerne (excitationsbølgelængde: 450-490 nm, emissionsbølgelængde: 500-550 nm, visuel forstørrelse: 63x). - Mål og analyser fluorescensintensiteten og længden af Ra-neuronområdet i Tg (ETvmat2: EGFP) zebrafisk og fluorescensintensiteten af Tg (elavl3: mCherry) zebrafisk hjerneneuroner ved hjælp af ImageJ-software. Tæl neutrofilerne manuelt i hjerneområdet af Tg(mpo:EFGP) zebrafisk.
6. Bestemmelse af genekspressionsmarkører
- Ved 24 timer efter LPS hjerne ventrikulær injektion, fortsæt med bestemmelsen af genekspressionsmarkører. For at gøre det skal du bedøve zebrafisklarver med 0,02% tricain (som nævnt i trin 3.2).
- Brug to 1 ml sprøjter til at adskille larvernes hoveddele (40 larver pr. Gruppe) uden øjen- og æggeblommesækområder (figur 2E).
- Ekstraher RNA fra larvehoveddelene.
- Til RNA-ekstraktion homogeniseres hoveddelen med 200 μL RNA-ekstraktionsreagens (se Materialetabel) ved hjælp af en vævssliber (se Materialetabel) ved en rotationshastighed på 11.000 o / min i 5 s.
- Udfør RNA-ekstraktion ved hjælp af chloroform-isopropanolmetoden. For at gøre det tilsættes 40 μL chloroform, rystes rørene kraftigt og inkuberes dem ved stuetemperatur i 10 minutter. Prøverne centrifugeres ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Overfør den vandige fase til et frisk rør (ca. 100 μL) og tilsæt 100 μL isopropanol. Der inkuberes i 10 minutter, og centrifugeres derefter ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten.
- Tilsæt 200 μL 75% ethanol for at vaske RNA-pellet. Hvirvel prøverne kort og centrifugeres derefter ved 7500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og vask RNA-pelleten igen.
- Lufttør RNA-pelleten i 5-10 minutter, og tilsæt derefter 30 μL RNase-frit vand for at opløse RNA-pelleten. Kontroller renheden (forholdet mellem absorbans ved 260 nm og 280 nm) og integriteten af RNA ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer (se Materialetabel).
- Syntetiser cDNA fra RNA'et ekstraheret i trin 6.3 ved hjælp af omvendt transkriptase med tilfældige primere (se Materialetabel).
- Tilsæt 1 μL tilfældige primere, 1 μL dNTP'er, 1 μg RNA og destilleret vand (total volumen til 12 μL) til et nukleasefrit rør. Blandingen opvarmes til 65 °C i 5 minutter og afkøles hurtigt på is.
- Der tilsættes 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNasehæmmer, 4 μL 5× førstestrengsbuffer og 1 μL M-MLV omvendt transkriptase (samlet volumen: 20 μL) til røret. Bland forsigtigt og inkuber røret ved 25 °C i 2 min. efterfulgt af 42 °C i 50 min. Inaktiver reaktionen ved opvarmning ved 70 °C i 15 min.
- Udfør PCR i realtid på et qPCR-system (se Materialetabel) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RT-qPCR-sæt (se Tabel over materialer) for at bestemme ekspressionen af målgenerne (IL-1β, IL-6 og TNF-α). Reaktionsblandingen (20 μL) indeholdt 10 μL SYBR grøn, 0,4 μL ROX-referencefarvestof, 0,8 μL hver af de fremadgående og omvendte primere, 6 μL ddH2O og 2 μL skabelon cDNA (1 μg). PCR-forstærkning udføres under betingelserne: 95 °C i 30 s, efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 5 s og 60 °C i 34 s og med et dissociationstrin på 95 °C i 15 s, 60 °C i 60 s og 95 °C i 15 s.
- Normaliser mRNA-niveauerne for målgenerne til et husholdningsgen, forlængelsesfaktor 1 α (Ef1α). Beregn ekspressionsniveauerne for hvert målgen ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden33. Primersekvenserne for hvert gen er beskrevet i tabel 2.
- Til bestemmelse af nitrogenoxid homogeniseres hoveddelen (opnået i trin 6.2) i 100 μL kold PBS ved hjælp af en vævskværn. Den resulterende PBS- og hoveddelsophæng centrifugeres ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Saml lysaterne og udfør nitritkoncentrationsassay34 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialetabel).
7. Zebrafisk lokomotiv adfærdsmæssig analyse
- Ved 24 timer efter LPS-hjernens ventrikulære injektion overføres zebrafisklarverne til brøndene i en 96-brønds firkantet mikroplade individuelt. Der tilsættes 300 μL E3-medium til hvert hul, og larverne inkuberes derefter i 4 timer for at akklimatisere sig til testpladen.
- Overfør den larvebelastede mikroplade til zebrafisksporingsboksen (se Materialetabel). Tænd for lyskilden, og inkuber derefter larverne i testboksen i 30 minutter for at akklimatisere miljøet.
- Overvåg og registrer zebrafiskens adfærd ved hjælp af et automatiseret videosporingssystem. Optag 12 sessioner (5 min hver, i alt 1 time) for hver zebrafisk. Definer den samlede afstand (består af inaktive, små og store afstande) som den afstand (i mm), som hver fisk bevægede sig i løbet af en 60 minutters sporingsperiode.
8. Statistisk analyse
- Udfør statistiske analyser ved hjælp af standardanalysesoftware (se Materialefortegnelse).
- Udfør statistisk analyse af forskelle mellem to grupper ved hjælp af almindelig envejs ANOVA. Beregn Pearsons korrelationskoefficient for at vurdere styrken af korrelationer. P < 0,05 blev anset for signifikant i alle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsgangen beskrevet her præsenterer en ny, hurtig og effektiv metode til at inducere LPS-medieret neuroinflammation og neurotoksicitet i zebrafisklarver. I denne beskrevne protokol blev 5 dpf zebrafisk injiceret med LPS (figur 1) i hjernens ventrikler ved hjælp af en mikroinjektor (figur 2A-C). Vellykket injektion i hjernens ventrikel blev verificeret ved hjælp af 1% Evans blå plet (figur 2D). Zebrafiskhovedet blev adskilt fra dets øjne og krop ved hjælp af sprøjter (figur 2E) for at udelukke enhver indflydelse af inflammatorisk cytokinekspression og frigivelse af nitrogenoxid i zebrafisklegemet på bestemmelsen af neuroinflammation og neurotoksicitet i hjernen.
Det samme volumen PBS (som LPS) blev injiceret i zebrafiskhjernens ventrikulære område som en sham-opereret kontrol. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem kontrol- og sham-opererede grupper i neuronerne, især fra især den forreste gruppe af raphe-kerner (Ra) (figur 3A-C), fluorescensintegreret tæthed af hjerneneuronerne (figur 3D, E), zebrafiskens samlede bevægelsesafstand (figur 4A, B), NO-produktion og mRNA-ekspression af proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-6 og IL-1β) (figur 4A-D) og rekruttering af neutrofiler til larvezebrafiskhjernen (figur 6A, B). Disse resultater viste, at korrekt mikroinjektion ikke forårsager nogen neurotoksicitet og neuroinflammation hos zebrafisk.
Efter behandling i 24 timer, hjerne ventrikulær injektion af LPS induceret neurotoksicitet i zebrafisk. LPS (1-5 mg/ml) inducerede et betydeligt tab af Ra-neuroner i hjernen hos Tg(ETvmat2:GFP) larvezebrafisk sammenlignet med kontrol- og skingrupperne (figur 3A-C). Den transgene linje elav13: mCherry zebrafisk skitserer neuronale celler med det nukleare røde fluorescerende protein35. Som vist i figur 3D,E førte 2,5-5 mg/ml LPS til signifikante ændringer i fluorescensintegreret tæthed af hjerneneuronerne i denne larvezebrafisklinje. Imidlertid viste 1 mg / ml LPS-injektionsgruppen ingen effekt på fluorescensintegreret tæthed af hjerneneuronerne sammenlignet med kontrol- og skingrupperne. Endvidere fremkaldte 5 mg/ml LPS en bevægelsesmangel (figur 4A) og reducerede zebrafiskens samlede bevægelsesafstand over en 60 minutters sporingsperiode (figur 4B). Resultaterne viste, at 1-2,5 mg / ml LPS kunne fremkalde tab af neuroner, men ingen signifikant bevægelsesmangel.
Derudover kan hjernens ventrikulære injektion af LPS også aktivere det inflammatoriske respons i zebrafiskhjernen. NO-produktion (figur 5A) og mRNA-ekspression af proinflammatoriske cytokiner (TNF-α, IL-6 og IL-1β) (figur 5B-D) i hovedet af zebrafisklarver blev øget ved 2,5-5 mg / ml LPS-behandling sammenlignet med ekspressionen i kontrol- og skingrupperne. Efter 1-5 mg/ml LPS-injektion blev rekrutteringen af neutrofiler til larvezebrafiskhjernen observeret (figur 6A), hvilket resulterede i en signifikant stigning i antallet af neutrofiler i Tg(mpo:EGFP)-zebrafiskhjerneregionen (figur 6B).
| Skridt | Driftstid (sek.) | Varmeniveau | Handling |
| T1 | L> | H80-89 | P1L005 |
| T2 | 1.6-3 | H00 | |
| T3 | L> | H00 | P2L001c |
| T4 | 3 | H00 | KØLIG |
| T5 | 0 | H00 |
Tabel 1: Fem-trins protokol for træk af glaskapillarrør.
| Grundnavn | Sekvens | |
| IL-1β fremad | 5'-CATTTGCAGGCCGTCA-3' | |
| IL-1β omvendt | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 fremad | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 omvendt | 5'-TCTTTCTCTTTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α fremad | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α omvendt | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α fremad | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α omvendt | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Tabel 2: Primere brugt i realtid qPCR.
Figur 1: Generel struktur af lipopolysaccharid (LPS). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikroinjektionsopsætning, kropsholdning og placering af zebrafisk og adskillelse af hoveddel . (A) Valg af glasnål: Brug en pincet til at skære spidsen af en fortrukket nål under mikroskopet for at opnå en nål med en lignende åbning som vist på figuren. (B) Juster mikroskopets brændvidde, så zebrafisklarvernes hjerneventrikulære område kan observeres ved høj forstørrelse (skitseret med sort). Lyseblå cirkler angiver injektionsstedet. (C) De monterede larver skal orienteres med hjernesiden opad for at få adgang til nålen (hjernetectum angivet med rød cirkel). (D) Påvisning af vellykket ventrikulær injektion med Evans blå i zebrafisklarver hjerne. (E) Zebrafisk hoved del uden øjet og æggeblomme sac regioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hjernens ventrikulære injektion af LPS ablaterer neuroner efter 24 timer i zebrafisklarver. (A) (Øverst) Repræsentative fluorescensmikroskopibilleder af vmat2: GFP zebrafisk efter behandling med forskellige koncentrationer af LPS (røde parenteser angiver raphe kerner [Ra] neuroner; skala bar = 265,2 μm). (Nederst) Ra neuronal region blev forstørret for at forbedre den morfologiske visualisering. (B,C) Gennemsnitlig fluorescensintensitet og længde af Ra-neuronområdet i vmat2: GFP zebrafisklarver. (D,E) Repræsentativ morfologi (skalabar = 265,2 μm) og gennemsnitlig fluorescensintensitet af Tg(elavl3:mCherry) zebrafiskhjerneneuroner. Data udtrykkes som en procentdel af kontrolgruppen. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hjernens ventrikulære injektion af LPS inducerer bevægelsesmangel efter 24 timer i zebrafisklarver . (A) Repræsentative mønstre af zebrafiskbevægelsesspor. På det digitale sporingskort er højhastighedsbevægelse repræsenteret af røde linjer (> 6,6 mm / s); mellemhastighedsbevægelse er afbildet af grønne linjer (3,3-6,6 mm / s); Lavhastighedsbevægelse er afbildet af sorte linjer (< 3,3 mm / s). (B) Kvantitativ analyse af zebrafiskens gennemsnitlige samlede tilbagelagte afstand i 60 min. *P < 0,05 versus kontrolgruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hjernens ventrikulære injektion af LPS øger proinflammatoriske mediatorer. (A) Nitrogenoxidniveauer blev målt ved hjælp af Griess-reagens. (B-D) Genekspressionsniveauerne af interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α) i zebrafiskhovedet blev undersøgt af qPCR. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: LPS-hjernens ventrikulære mikroinjektion fører til rekruttering af neutrofiler i zebrafiskhjernen efter 24 timer. (A) Migration af neutrofiler (område inde i den røde cirkel) ind i larvernes hoved efter LPS-hjerneventrikulær injektion (skalabar = 851,1 μm). (B) Antallet af neutrofiler i larvehoveder efter LPS-hjerneventrikulær injektion. *P < 0,05 og **P < 0,01 versus kontrolgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Rådata Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stigende mængde epidemiologiske og eksperimentelle data implicerer kroniske bakterielle og virale infektioner som mulige risikofaktorer for neurodegenerative sygdomme36. Infektionen udløser aktivering af inflammatoriske processer og er vært for immunrespons37. Selvom responsen fungerer som en forsvarsmekanisme, er overaktiveret betændelse skadelig for neurogenese, og det inflammatoriske miljø tillader ikke overlevelse af nyfødte neuroner38. Som følge heraf forårsager det skade på værtsneuronale funktioner og levedygtighed. Undersøgelser tyder på, at inflammation spiller en væsentlig rolle i patofysiologien af neurodegeneration39.
Som et hyppigt undersøgt patogent endotoksin har LPS været impliceret i hæmning af neurogenese og neurodegeneration. LPS-aktivering af inflammatoriske processer forringer signifikant neurogenese, delvist gennem produktion af NO, TNF-α, IL-6 og IL-1β40. En voksende mængde beviser viser, at LPS forårsager adfærdsunderskud og neuronalt tab og påvirker neurogeneseprogression, når det injiceres centralt i neurodegenerative gnavermodeller10,38. Zebrafiskmodeller er blevet brugt i vid udstrækning som alternative eksperimentelle modeller til at studere immunresponser41 og screene nye antiinflammatoriske lægemidler. Zebrafiskens medfødte og adaptive immunsystem ligner pattedyrs42. Desuden har nogle undersøgelser identificeret flere inflammatoriske cytokiner og receptorer til stede hos pattedyr i zebrafisken CNS43. Tidligere undersøgelser tyder på, at nedsænkning af zebrafiskembryoner / larver i LPS eller injektion af LPS i æggeblommen af zebrafisklarver kan inducere immunresponset og øge proinflammatoriske faktorer forbundet med inflammation44,45. Imidlertid er den specifikke virkning af LPS på zebrafisk nervevæv og på induktion af neuroinflammation endnu ikke kendt.
Selvom gnavermodeller har mange fordele i forhold til andre dyremodeller, er deres begrænsninger med hensyn til realtids in vivo-billeddannelse og lægemiddelscreening indlysende. In vivo-billeddannelse bruges i vid udstrækning til at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for nervesystemets udvikling og patologiske hjerneændringer som et kraftfuldt og ikke-invasivt værktøj46,47. På grund af den optiske gennemsigtighed af zebrafiskembryoner og larver er de velegnede til levende billeddannelseseksperimenter med hjerneobservation48,49. Især zebrafiskens lille størrelse og deres evne til at producere tusindvis af embryoner betyder, at lægemiddelscreening med høj kapacitet kan udføres ved hjælp af zebrafiskembryoner eller larver50,51. Desuden kan robotmikroinjektioner med udviklingen inden for videnskab og teknologi leveres præcist og effektivt og kan bruges til at injicere store mængder embryoner eller larver52,53. Anvendelsen af det mikrorobotiske injektionssystem til neuronal forskning til rettidig injektion af materialer i et stort antal embryoner eller larver vil lette storskala screening af biomolekyler og lægemiddelforbindelser.
I denne undersøgelse blev zebrafisk ved 5 dpf injiceret med LPS i en koncentration på 2,5-5 mg / ml; Dette blev bestemt som den optimale betingelse for udvikling af neuroinflammationsmodeller. Så vidt vi ved, er denne metode ikke beskrevet i litteraturen. Derfor var hjernens ventrikulære mikroinjektion af LPS i zebrafisklarver i stand til at forårsage tab af neuroner og bevægelsesmangel. Desuden viste vores resultater, at LPS-induceret neuroinflammation øger niveauerne af proinflammatoriske mediatorer som NO, TNF-α, IL-6 og IL-1β og fører til rekruttering af neutrofiler i larvezebrafiskhjernen ved 24 timer efter injektion. I andre dyremodeller kan LPS-injektion også fremme udviklingen af betændelse og forårsage neuropatologiske ændringer i hjernen13,54. Resultaterne fra denne undersøgelse fremmer vores forståelse af neuroinflammatoriske veje. I denne metode skal det bemærkes, at åbningen af nåle til mikroinjektion ikke bør være for stor for at undgå hjerneskade forårsaget af mekanisk drift, og der skal anvendes en rimelig mængde kraft for at undgå at beskadige larverne. Derudover er det vigtigt at adskille hovedet fra zebrafiskens øjne og krop til bestemmelse af inflammatoriske faktorer og nitrogenoxid, da dette vil hjælpe med at opnå retningsbestemte resultater, der specifikt afspejler neuroinflammation induceret af LPS-hjernens ventrikulære injektion.
En lille ulempe ved denne metode er, at på grund af den lille størrelse af zebrafisklarver er mængderne af biomolekyler, såsom total mRNA opnået ved homogenisering og ekstraktion, lavere end for musemodellen. Zebrafisk er dog i stand til at gyde ofte med flere hundrede æg hver uge. Forøgelse af antallet af zebrafisklarver, der anvendes i hver gruppe, kan give tilstrækkelige mængder ekstraherede biomolekyler til forskellige biokemiske assays. Afslutningsvis inducerer denne metode neurotoksicitet og et immunrespons i larvezebrafiskhjernen. På grund af zebrafiskens gennemsigtighed kan ændringer i larvens levende zebrafiskhjerne bedre forstås via in vivo-billeddannelse . Teknikken beskrevet her er et glimrende værktøj til hurtigt og effektivt at evaluere mulige anti-neuroinflammatoriske lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Science and Technology Development Fund (FDCT) i Macao SAR (Ref. Nr. FDCT0058/2019/A1 og 0016/2019/AKP), Forskningsudvalg, University of Macau (MYRG2020-00183-ICMS og CPG2022-00023-ICMS) og National Natural Science Foundation of China (nr. 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
References
- Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
- Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
- Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
- Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
- Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
- Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
- Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
- Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
- Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
- Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
- Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
- Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
- Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
- Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
- Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
- Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
- Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
- Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
- Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
- Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
- Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
- He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
- Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
- Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
- De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
- Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
- Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
- Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
- Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
- Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
- Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
- Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
- Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
- Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
- Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
- Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
- Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
- Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
- Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).
