Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Mikroinjektion von Lipopolysaccharid in die ventrikuläre Hirnregion in einem Zebrafisch-Larvenmodell, um die resultierende neuroinflammatorische Reaktion und Neurotoxizität zu untersuchen.
Abstract
Neuroinflammation ist eine Schlüsselrolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, alternative in vivo Neuroinflammationsmodelle zu erforschen und zu entwickeln, um die Rolle der Neuroinflammation bei der Neurodegeneration zu verstehen. In dieser Studie wurde ein Larven-Zebrafisch-Modell der Neuroinflammation entwickelt und validiert, das durch ventrikuläre Mikroinjektion von Lipopolysaccharid (LPS) vermittelt wird, um eine Immunantwort und Neurotoxizität zu induzieren. Die transgenen Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden zur Echtzeit-Quantifizierung der Lebensfähigkeit von Gehirnneuronen durch Fluoreszenz-Live-Bildgebung mit Fluoreszenzintensitätsanalyse verwendet. Das Bewegungsverhalten von Zebrafischlarven wurde automatisch mit einem Video-Tracking-Rekorder aufgezeichnet. Der Gehalt an Stickstoffmonoxid (NO) und die mRNA-Expressionsniveaus von entzündlichen Zytokinen einschließlich Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β) und humanem Tumornekrosefaktor α (TNF-α) wurden untersucht, um die LPS-induzierte Immunantwort im Larvenkopf des Zebrafisches zu beurteilen. 24 h nach der hirnventrikulären Injektion von LPS wurden bei Zebrafischlarven Neuronenverlust und Bewegungsmangel beobachtet. Darüber hinaus erhöhte die LPS-induzierte Neuroinflammation die NO-Freisetzung und die mRNA-Expression von IL-6, IL-1β und TNF-α im Kopf von 6 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven und führte zur Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn. In dieser Studie wurde die Injektion von Zebrafischen mit LPS in einer Konzentration von 2,5-5 mg/ml bei 5 dpf als optimale Bedingung für diesen pharmakologischen Neuroinflammationstest bestimmt. Dieses Protokoll stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik für die Mikroinjektion von LPS in Hirnventrikeln vor, um LPS-vermittelte Neuroinflammation und Neurotoxizität in einer Zebrafischlarve zu induzieren, die für die Untersuchung von Neuroinflammation nützlich ist und auch als Hochdurchsatz-In-vivo-Drogenscreening-Assay verwendet werden könnte.
Introduction
Neuroinflammation wurde als entscheidender antineurogener Faktor beschrieben, der an der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt ist1. Nach pathologischen Beleidigungen kann eine Neuroinflammation zu verschiedenen nachteiligen Folgen führen, einschließlich der Hemmung der Neurogenese und der Induktion des neuronalen Zelltods 2,3. In dem Prozess, der der Reaktion auf die Entzündungsinduktion zugrunde liegt, werden mehrere entzündliche Zytokine (wie TNF-α, IL-1β und IL-6) in den extrazellulären Raum sezerniert und wirken als entscheidende Komponenten beim Neuronentod und der Unterdrückung der Neurogenese 4,5,6.
Die Mikroinjektion von Entzündungsmediatoren (wie IL-1β, L-Arginin und Endotoxine) in das Gehirn kann eine neuronale Zellreduktion und Neuroinflammation verursachen 7,8,9. Lipopolysaccharid (LPS, Abbildung 1), ein pathogenes Endotoxin, das in der Zellwand gramnegativer Bakterien vorhanden ist, kann Neuroinflammation induzieren, Neurodegeneration verschlimmern und die Neurogenese bei Tieren reduzieren10. LPS-Injektion direkt in das ZNS des Mausgehirns erhöhte den Gehalt an Stickstoffmonoxid, entzündungsfördernden Zytokinen und anderen Regulatoren11. Darüber hinaus kann die stereotaktische Injektion von LPS in die lokale Gehirnumgebung eine übermäßige Produktion neurotoxischer Moleküle induzieren, was zu einer Beeinträchtigung der neuronalen Funktion und der anschließenden Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen führt 10,12,13,14,15. Im Bereich der Neurowissenschaften sind Live- und Zeitverlaufsmikroskopische Beobachtungen zellulärer und biologischer Prozesse in lebenden Organismen entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die der Pathogenese und der pharmakologischen Wirkung zugrunde liegen16. Die Live-Bildgebung von Mausmodellen der Neuroinflammation und Neurotoxizität wird jedoch grundlegend durch die begrenzte optische Eindringtiefe der Mikroskopie eingeschränkt, was funktionelle Bildgebung und Live-Beobachtung von Entwicklungsprozessen ausschließt17,18,19. Daher ist die Entwicklung alternativer Neuroinflammationsmodelle von großem Interesse, um die Untersuchung der pathologischen Entwicklung und des Mechanismus, der Neuroinflammation und Neurodegeneration zugrunde liegt, durch Live-Bildgebung zu erleichtern.
Zebrafisch (Danio rerio) hat sich aufgrund seines evolutionär konservierten angeborenen Immunsystems, der optischen Transparenz, der großen Embryonengelegegröße, der genetischen Traktierbarkeit und der Eignung für die In-vivo-Bildgebung als vielversprechendes Modell zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurodegeneration erwiesen 19,20,21,22,23 . Frühere Protokolle haben LPS entweder direkt in das Eigelb und den Hinterhirnventrikel von Zebrafischlarven ohne mechanistische Bewertung injiziert oder einfach LPS zu Fischwasser (Kulturmedium) hinzugefügt, um eine tödliche systemische Immunantwort zu induzieren24,25,26,27. Hier haben wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von LPS in die Hirnventrikel entwickelt, um eine angeborene Immunantwort oder Neurotoxizität in den 5 Tagen nach der Befruchtung (DPF) Zebrafischlarven auszulösen. Diese Reaktion wird durch neuronalen Zellverlust, ein Defizit des Bewegungsverhaltens, eine erhöhte Nitritoxidfreisetzung, die Aktivierung der entzündlichen Genexpression und die Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn 24 Stunden nach der Injektion nachgewiesen.
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Protocol
AB-Wildtyp-Zebrafische und transgene Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden vom Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS) bezogen. Die ethische Genehmigung (UMARE-030-2017) für die Tierversuche wurde von der Ethikkommission für Tierforschung der Universität Macau erteilt, und das Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Tierpflege.
1. Zebrafischembryonen- und Larvenhaltung
- Erzeugung von Zebrafischembryonen (200-300 Embryonen pro Paarung) durch natürliche paarweise Paarung, wie bereits berichtet28.
- Eiwasser (E3) Medium (60×) durch Auflösen von 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H2O und 9,78 g MgCl 2·6H2O inddH2Ozu einem Endvolumen von 2 L vorbereiten und denpH-Wert mit NaOH und HCl auf7,2 einstellen. Zur Herstellung der Arbeitskonzentration von E3-Medium (1×) wird die Brühe 60-mal in ddH2O verdünnt. Bei Nichtgebrauch bei 28,5 °C lagern.
- Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, um die Zebrafischembryonen in eine Schale mit E3-Medium zu übertragen. Ziehen Sie die Embryonen bei 28,5 °C in einem Inkubator auf und überwachen Sie ihre Entwicklung und Gesundheit. Entfernen Sie täglich tote Embryonen und ersetzen Sie unreines E3-Medium durch frisches Medium.
- Verwenden Sie für Zebrafisch-Bildgebungsexperimente eine Kunststofftransferpipette, um 0-2 h nach der Befruchtung (hpf) Embryonen (etwa 200 Eier) in etwa 15 ml 1× E3-Medium zu sammeln, das 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) enthält.
HINWEIS: PTU kann die Bildung von Melanophoren während der Embryogenesehemmen 29. Die Behandlung von Embryonen mit PTU während der Embryogenese kann die Signalerkennung in der Mikroskopie oder die Expression von Fluoreszenzverbessern 30. - Halten Sie die Zebrafischembryonen unter den oben genannten Bedingungen aufrecht, bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungslarvenstadium erreichen.
2. Vorbereitung für die Mikroinjektion
- Bereiten Sie sich auf die Injektion vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher ziehen (siehe Materialtabelle) und befolgen Sie das fünfstufige Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarrohren (Tabelle 1).
- Öffnen Sie die Nadelspitze (dünnwandige Glaskapillaren [3,5 Zoll] mit Filament, AD 1,14 mm) mit einer Pinzette in einem Winkel auf die entsprechende Größe (Abbildung 2A).
- Füllen Sie die Nadel mit 0,1 ml Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind.
- Entfernen Sie den Schraubverschluss der Stahlnadel der Mikroinjektionsvorrichtung. Richten Sie das Glasnadelloch mit der Stahlnadel aus und ziehen Sie dann den Schraubverschluss fest. Montieren Sie die beladene Nadelmikroinjektionsvorrichtung in einem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie die Position der Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass der Mikromanipulator die Apparatur flexibel unter dem Mikroskop bewegen kann. Entladen Sie eine bestimmte Menge Paraffinöl, damit die Stahlnadel in das Kapillarglasrohr eintritt.
- Tropfen Sie die Injektionslösung (z. B. 1× PBS oder 5 mg/ml LPS) auf einen mit 70% Ethanol sterilisierten Glasobjektträger und stellen Sie die Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass die Spitze in den Flüssigkeitstropfen eingeführt wird. Laden Sie ~ 2 μL Injektionslösung in die Nadel.
- Stellen Sie den Mikromanipulator (Feineinstellung von oben, unten, links und rechts) so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsapparates bei starker Vergrößerung im gleichen Sichtfeld wie die Larven befindet (Abbildung 2B).
3. Montage von Zebrafischen für Mikroinjektionen
HINWEIS: Die Entwicklung des Gehirns von Zebrafischen erfolgt innerhalb von 3 dpf und reift bei 5 dpf mit einem gut entwickelten zentralen Nervensystem31,32. Daher eignen sich bereits 5 dpf-Larven zur Untersuchung von LPS-vermittelten neuronalen Schäden sowie Verhaltens- und Entzündungsreaktionen.
- Injizieren Sie die Zebrafischlarven innerhalb von ca. 30 Minuten nach Erreichen des interessierenden Stadiums, um die Konsistenz des Injektionszeitpunkts zu erhalten.
- Um die Zebrafischlarven zu betäuben, kombinieren Sie Tricain mit sauberem Aquarienwasser (Endkonzentration von 0,02% w/v Tricain).
- Eine Lösung von 2% Agarose inddH2Owird mit einer Mikrowelle geschmolzen. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Die 2%ige Agarose-beschichtete Kunststoffschale kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um betäubte Larven in die Mitte der 2% agarosebeschichteten Kunststoffschale zu transportieren. Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Nadelzugang zu erhalten.
4. Injektion des Hirnventrikels
- Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die hirnventrikuläre Struktur von Zebrafischen im Sichtfeld deutlich dargestellt wird (Abbildung 2B).
- Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntectum (Abbildung 2C).
- Punktieren Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator.
- Drücken Sie das Fußpedal, um 1 nL 1x PBS oder unterschiedliche LPS-Konzentrationen (1,0, 2,5 und 5,0 mg/ml) auszustoßen (siehe Materialtabelle). Erfolgreiche Ventrikelinjektionsbilder, bei denen dem Hirnventrikel 1 nL 1% Evansblau-Farbstoff (verdünnt in PBS) injiziert wurde, sind als Beispiel gezeigt (Abbildung 2D). Die Larven werden unmittelbar nach der Injektion in ein sauberes E3-Medium überführt. Nach 24 h sammeln Sie die Larven für die mikroskopische Bildgebung, den Bewegungsverhaltenstest und die Bestimmung anderer Indikatoren.
5. Bildgebung
- Bereiten Sie 1,5% niedrigschmelzige Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitzen Sie sie in einer Mikrowelle, um eine klare Flüssigkeit zu bilden.
- Verwenden Sie eine saubere Kunststoff-Transferpipette, um die Larven zu einem Glasobjektträger zu transportieren und so viel Wasser wie möglich zu entfernen.
- Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um den Larven einen Tropfen 1,5% niedrig schmelzende Agarose hinzuzufügen.
HINWEIS: Kühlen Sie die niedrig schmelzende Agarose vor dem Hinzufügen eine Weile in der Pipette ab, um die Larven nicht zu verletzen. - Verwenden Sie eine 1-ml-Spritzennadel, um die Larven zu orientieren. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist und sich verfestigt, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.
- Beobachten und fotografieren Sie die Neuronenregion im gesamten Gehirn von Tg(ETvmat2:EGFP) und Tg(elavl3:mCherry) Zebrafischen sowie die Rekrutierung von Neutrophilen im Tg(mpo:EGFP)-Zebrafischgehirn unter einem Fluoreszenzstereomikroskop (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Einstellungen des Fluoreszenzmikroskops, die für die Bildgebung verwendet werden, sind unten aufgeführt. Tg(ETvmat2:EGFP) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 450-490 nm, Emissionswellenlänge: 500-550 nm, visuelle Vergrößerung: 100x); Tg(elavl3:mCherry) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 541-551 nm, Emissionswellenlänge: 590 nm, visuelle Vergrößerung: 100x); Tg(mpo:EFGP) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 450-490 nm, Emissionswellenlänge: 500-550 nm, visuelle Vergrößerung: 63x). - Messen und analysieren Sie die Fluoreszenzintensität und -länge der Ra-Neuronenregion im Tg(ETvmat2:EGFP)-Zebrafisch und die Fluoreszenzintensität von Tg(elavl3:mCherry)-Zebrafisch-Gehirnneuronen mit der ImageJ-Software. Zählen Sie manuell die Neutrophilen in der Gehirnregion von Tg (mpo: EFGP) Zebrafisch.
6. Bestimmung von Genexpressionsmarkern
- Fahren Sie 24 h nach der ventrikulären LPS-Hirninjektion mit der Bestimmung der Genexpressionsmarker fort. Betäuben Sie dazu Zebrafischlarven mit 0,02% Tricain (wie in Schritt 3.2 erwähnt).
- Verwenden Sie zwei 1-ml-Spritzen, um die Kopfteile der Larven (40 Larven pro Gruppe) ohne Augen- und Dottersackregionen zu trennen (Abbildung 2E).
- Extrahieren Sie RNA aus den Larvenkopfabschnitten.
- Für die RNA-Extraktion homogenisieren Sie den Kopfteil mit 200 μL RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle) mit einem Gewebeschleifer (siehe Materialtabelle) bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 11.000 U/min für 5 s.
- Führen Sie die RNA-Extraktion mit der Chloroform-Isopropanol-Methode durch. Dazu 40 μL Chloroform zugeben, die Röhrchen kräftig schütteln und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Die wässrige Phase wird in ein frisches Röhrchen (ca. 100 μL) überführt und 100 μL Isopropanol zugegeben. 10 min inkubieren und dann bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 200 μL 75% Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen. Die Proben kurz vortex und dann bei 7500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet erneut.
- Trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft für 5-10 min, dann fügen Sie 30 μL RNase-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen. Überprüfen Sie die Reinheit (Absorptionsverhältnis bei 260 nm und 280 nm) und Integrität der RNA mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
- Synthetisieren Sie cDNA aus der in Schritt 6.3 extrahierten RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase mit zufälligen Primern (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 1 μL zufällige Primer, 1 μL dNTPs, 1 μg RNA und destilliertes Wasser (Gesamtvolumen bis 12 μL) in ein nukleasefreies Röhrchen. Die Mischung 5 min auf 65 °C erhitzen und auf Eis schnell kalt stellen.
- Geben Sie 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-Inhibitor, 4 μL 5× Erststrangpuffer und 1 μL M-MLV-Reverse-Transkriptase (Gesamtvolumen: 20 μL) in die Röhre. Mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie das Röhrchen bei 25 °C für 2 min, gefolgt von 42 °C für 50 min. Inaktivieren Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 15 min.
- Durchführung einer Echtzeit-PCR an einem qPCR-System (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RT-qPCR-Kits (siehe Materialtabelle), um die Expression der Zielgene (IL-1β, IL-6 und TNF-α) zu bestimmen. Das Reaktionsgemisch (20 μL) enthielt 10 μL SYBR-Grün, 0,4 μL ROX-Referenzfarbstoff, je 0,8 μL der Forward- und Reverse-Primer, 6 μLddH2Ound 2 μL Template-cDNA (1 μg). Die PCR-Amplifikation wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 5 s und 60 °C für 34 s und mit einer Dissoziationsstufe von 95 °C für 15 s, 60 °C für 60 s und 95 °C für 15 s.
- Normalisieren Sie die mRNA-Spiegel der Zielgene auf die eines Housekeeping-Gens, Elongationsfaktor 1 α (Ef1α). Die Expressionsniveaus für jedes Zielgen werden mit der 2−ΔΔCT-Methode33 berechnet. Die Primersequenzen jedes Gens sind in Tabelle 2 beschrieben.
- Zur Bestimmung von Stickstoffmonoxid homogenisieren Sie den Kopfteil (erhalten in Schritt 6.2) in 100 μL kaltem PBS mit einem Gewebeschleifer. Zentrifugieren Sie die resultierende PBS- und Kopfteilsuspension bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Sammeln Sie die Lysate und führen Sie den Nitritkonzentrationstest34 mit einem handelsüblichen Kit durch (siehe Materialtabelle).
7. Verhaltenstest der Zebrafisch-Lokomotive
- 24 h nach LPS-Hirnventrikelinjektion werden die Zebrafischlarven einzeln in die Vertiefungen einer quadratischen 96-Well-Mikroplatte überführt. Geben Sie 300 μL E3-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie dann die Larven für 4 Stunden, um sich an die Testplatte zu gewöhnen.
- Die mit Larven beladene Mikroplatte wird in die Zebrafisch-Trackingbox überführt (siehe Materialtabelle). Schalten Sie die Lichtquelle ein und inkubieren Sie dann die Larven in der Testbox für 30 Minuten, um die Umgebung zu akklimatisieren.
- Überwachen und zeichnen Sie das Verhalten des Zebrafischs mit einem automatisierten Video-Tracking-System auf. Nehmen Sie 12 Sitzungen (jeweils 5 Minuten, insgesamt 1 h) für jeden Zebrafisch auf. Definieren Sie die Gesamtdistanz (bestehend aus inaktiven, kleinen und großen Entfernungen) als die Entfernung (in mm), die jeder Fisch während eines 60-minütigen Tracking-Zeitraums zurückgelegt hat.
8. Statistische Auswertung
- Führen Sie statistische Analysen mit Standard-Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine statistische Analyse der Unterschiede zwischen zwei Gruppen mit gewöhnlicher Einweg-ANOVA durch. Berechnen Sie den Korrelationskoeffizienten von Pearson, um die Stärke von Korrelationen zu bewerten. P < 0,05 wurde in allen Analysen als signifikant angesehen.
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Representative Results
Der hier beschriebene Workflow stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik zur Induktion von LPS-vermittelter Neuroinflammation und Neurotoxizität in Zebrafischlarven dar. In diesem beschriebenen Protokoll wurden 5 dpf Zebrafische mit LPS (Abbildung 1) in Hirnventrikel mit einem Mikroinjektor injiziert (Abbildung 2A-C). Die erfolgreiche Injektion in die Hirnventrikelstelle wurde anhand von 1% Evansblau-Färbung überprüft (Abbildung 2D). Der Zebrafischkopf wurde mit Spritzen von Augen und Körper getrennt (Abbildung 2E), um jeglichen Einfluss der entzündlichen Zytokinexpression und der Stickoxidfreisetzung im Zebrafischkörper auf die Bestimmung der Neuroinflammation und Neurotoxizität im Gehirn auszuschließen.
Die gleiche Menge PBS (wie LPS) wurde als scheinoperierte Kontrolle in den ventrikulären Bereich des Zebrafischhirns injiziert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll- und scheinoperierten Gruppe in den Neuronen beobachtet, insbesondere aus der vorderen Gruppe der Raphe-Kerne (Ra) (Abbildung 3A-C), der fluoreszenzintegrierten Dichte der Gehirnneuronen (Abbildung 3D,E), der Gesamtbewegungsdistanz des Zebrafisches (Abbildung 4A,B), der NO-Produktion und der mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-6 und IL-1β) (Abbildung 4A-D) und Rekrutierung von Neutrophilen in das Larvenhirn von Zebrafischen (Abbildung 6A,B). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine ordnungsgemäße Mikroinjektion keine Neurotoxizität und Neuroinflammation bei Zebrafischen verursacht.
Nach der Behandlung für 24 h induzierte die hirnventrikuläre Injektion von LPS Neurotoxizität bei Zebrafischen. LPS (1-5 mg/ml) induzierte einen signifikanten Verlust von Ra-Neuronen im Gehirn von Tg(ETvmat2:GFP)-Larven im Vergleich zu den Kontroll- und Scheingruppen (Abbildung 3A-C). Die transgene Linie elav13:mCherry Zebrafisch umreißt die neuronalen Zellen mit dem nuklearen rot fluoreszierenden Protein35. Wie in Abbildung 3D,E gezeigt, führten 2,5-5 mg/ml LPS zu signifikanten Veränderungen der fluoreszenzintegrierten Dichte der Gehirnneuronen in dieser Larven-Zebrafischlinie. Die 1 mg/ml LPS-Injektionsgruppe zeigte jedoch keinen Einfluss auf die fluoreszenzintegrierte Dichte der Gehirnneuronen im Vergleich zu den Kontroll- und Scheingruppen. Darüber hinaus induzierten 5 mg/ml LPS einen Fortbewegungsmangel (Abbildung 4A) und verringerten die Gesamtentfernung der Bewegung von Zebrafischen über einen 60-minütigen Tracking-Zeitraum (Abbildung 4B). Die Ergebnisse zeigten, dass 1-2,5 mg / ml LPS den Verlust von Neuronen induzieren könnten, aber keinen signifikanten Fortbewegungsmangel.
Darüber hinaus kann die hirnventrikuläre Injektion von LPS auch die Entzündungsreaktion im Zebrafischgehirn aktivieren. Die NO-Produktion (Abbildung 5A) und die mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine (TNF-α, IL-6 und IL-1β) (Abbildung 5B-D) im Kopf von Zebrafischlarven waren bei einer Behandlung mit 2,5-5 mg/ml LPS im Vergleich zur Expression in der Kontroll- und Scheingruppe erhöht. Nach 1-5 mg/ml LPS-Injektion wurde die Rekrutierung von Neutrophilen in das Larvenhirn des Zebrafisches beobachtet (Abbildung 6A), was zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl der Neutrophilen in der Tg(mpo:EGFP)-Zebrafischhirnregion führte (Abbildung 6B).
| Schritt | Betriebszeit (Sek.) | Wärmeniveau | Aktion |
| T1 | L> | H80-89 | P1L005 |
| T2 | 1.6-3 | H00 | |
| T3 | L> | H00 | P2L001c |
| T4 | 3 | H00 | KÜHL |
| T5 | 0 | H00 |
Tabelle 1: Fünfstufiges Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarrohren.
| Name der Grundierung | Reihenfolge | |
| IL-1β vorwärts | 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3' | |
| IL-1β Rückseite | 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3' | |
| IL-6 vorwärts | 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3' | |
| IL-6 Rückwärtsgang | 5'-TCTTTCCCTCTTTTCCTCCTG-3' | |
| TNF-α vorwärts | 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3' | |
| TNF-α Rückseite | 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3' | |
| Ef1α vorwärts | 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3' | |
| Ef1α umgekehrt | 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3' | |
Tabelle 2: Primer in Echtzeit qPCR.
Abbildung 1: Allgemeine Struktur des Lipopolysaccharids (LPS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikroinjektionsaufbau, Körperhaltung und Position des Zebrafisches und Trennung des Kopfteils. (A) Auswahl der Glasnadel: Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze einer vorgezogenen Nadel unter dem Mikroskop zu schneiden, um eine Nadel mit einer ähnlichen Öffnung wie in der Abbildung gezeigt zu erhalten. (B) Stellen Sie die Brennweite des Mikroskops so ein, dass der hirnventrikuläre Bereich von Zebrafischlarven bei hoher Vergrößerung (schwarz umrandet) beobachtet werden kann. Hellblaue Kreise zeigen die Injektionsstelle an. (C) Die montierten Larven müssen für den Nadelzugang mit der Gehirnseite nach oben ausgerichtet werden (Hirntektum durch roten Kreis angezeigt). (D) Nachweis einer erfolgreichen ventrikulären Injektion mit Evans-Blau im Gehirn von Zebrafischlarven. (E) Zebrafischkopfteil ohne Augen- und Dottersackregionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die hirnventrikuläre Injektion von LPS trägt Neuronen nach 24 h in Zebrafischlarven ab. (A) (oben) Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von vmat2:GFP-Zebrafisch nach Behandlung mit unterschiedlichen LPS-Konzentrationen (rote Klammern zeigen Raphe-Kerne [Ra]-Neuronen; Skalenbalken = 265,2 μm). (Unten) Die neuronale Region Ra wurde vergrößert, um die morphologische Visualisierung zu verbessern. (B,C) Mittlere Fluoreszenzintensität und Länge der Ra-Neuronenregion in vmat2:GFP-Zebrafischlarven. (D,E) Repräsentative Morphologie (Maßstabsbalken = 265,2 μm) und mittlere Fluoreszenzintensität von Tg(elavl3:mCherry) Zebrafisch-Gehirnneuronen. Die Daten werden als Prozentsatz der Kontrollgruppe ausgedrückt. *P < 0,05 und **P < 0,01 versus Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Hirnventrikuläre Injektion von LPS induziert Lokomotionsmangel nach 24 h bei Zebrafischlarven . (A) Repräsentative Muster von Fortbewegungsspuren von Zebrafischen. In der digitalen Tracking-Karte wird die Hochgeschwindigkeitsbewegung durch rote Linien dargestellt (> 6,6 mm / s); mittelschnelle Bewegungen werden durch grüne Linien dargestellt (3,3−6,6 mm/s); Bewegungen mit niedriger Geschwindigkeit werden durch schwarze Linien (< 3,3 mm/s) dargestellt. (B) Quantitative Analyse der durchschnittlichen Gesamtstrecke, die der Zebrafisch in 60 Minuten zurückgelegt hat. *P < 0,05 gegenüber der Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Hirnventrikuläre Injektion von LPS erhöht entzündungsfördernde Mediatoren. (A) Die Stickoxidwerte wurden mit Griess-Reagenz gemessen. (B-D) Die Genexpressionsniveaus von Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) im Zebrafischkopf wurden mittels qPCR untersucht. *P < 0,05 und **P < 0,01 versus Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: LPS-Hirnventrikel-Mikroinjektion führt nach 24 h zur Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn. (A) Migration von Neutrophilen (Bereich innerhalb des roten Kreises) in den Kopf von Larven nach LPS-Hirnventrikelinjektion (Maßstabsbalken = 851,1 μm). (B) Die Anzahl der Neutrophilen in Larvenköpfen nach LPS-Hirnventrikelinjektion. *P < 0,05 und **P < 0,01 versus Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusatzdatei 1: Rohdaten Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Immer mehr epidemiologische und experimentelle Daten implizieren chronische bakterielle und virale Infektionen als mögliche Risikofaktoren für neurodegenerative Erkrankungen36. Die Infektion löst die Aktivierung von Entzündungsprozessen und Immunantworten des Wirts aus37. Selbst wenn die Reaktion als Abwehrmechanismus wirkt, ist eine überaktivierte Entzündung schädlich für die Neurogenese, und die entzündliche Umgebung ermöglicht nicht das Überleben neugeborener Neuronen38. Infolgedessen schädigt es die neuronalen Funktionen und die Lebensfähigkeit des Wirts. Studien deuten darauf hin, dass Entzündungen eine bedeutende Rolle in der Pathophysiologie der Neurodegenerationspielen 39.
Als häufig untersuchtes pathogenes Endotoxin wurde LPS mit der Hemmung der Neurogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht. Die LPS-Aktivierung von Entzündungsprozessen beeinträchtigt signifikant die Neurogenese, teilweise durch die Produktion von NO, TNF-α, IL-6 und IL-1β40. Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass LPS Verhaltensdefizite und neuronalen Verlust verursacht und die Neurogeneseprogression beeinflusst, wenn es zentral in neurodegenerative Nagetiermodelle injiziert wird10,38. Zebrafischmodelle wurden häufig als alternative experimentelle Modelle verwendet, um Immunantworten zu untersuchen41 und neue entzündungshemmende Medikamente zu screenen. Das angeborene und adaptive Immunsystem von Zebrafischen ähnelt dem von Säugetieren42. Darüber hinaus haben einige Studien mehrere entzündliche Zytokine und Rezeptoren identifiziert, die in Säugetieren im Zebrafisch ZNS43 vorhanden sind. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das Eintauchen von Zebrafischembryonen/-larven in LPS oder die Injektion von LPS in das Eigelb von Zebrafischlarven die Immunantwort induzieren und entzündungsfördernde Faktoren im Zusammenhang mit Entzündungen erhöhen kann44,45. Die spezifische Wirkung von LPS auf das Nervengewebe von Zebrafischen und auf die Induktion von Neuroinflammation ist jedoch noch nicht bekannt.
Obwohl Nagetiermodelle viele Vorteile gegenüber anderen Tiermodellen haben, sind ihre Grenzen in Bezug auf Echtzeit-In-vivo-Bildgebung und Drogenscreening offensichtlich. Die In-vivo-Bildgebung wird häufig verwendet, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Entwicklung des Nervensystems und pathologischen Gehirnveränderungen zugrunde liegen, als leistungsfähiges und nichtinvasives Werkzeug46,47. Aufgrund der optischen Transparenz von Zebrafischembryonen und -larven eignen sie sich gut für Live-Bildgebungsexperimente der Hirnbeobachtung48,49. Insbesondere die geringe Größe der Zebrafische und ihre Fähigkeit, Tausende von Embryonen zu produzieren, bedeuten, dass ein Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening mit Zebrafischembryonen oder -larven durchgeführt werden kann50,51. Darüber hinaus können mit den Entwicklungen in Wissenschaft und Technologie robotische Mikroinjektionen präzise und effektiv durchgeführt und verwendet werden, um große Mengen von Embryonen oder Larven zu injizieren52,53. Die Anwendung des mikrorobotischen Injektionssystems in der neuronalen Forschung zur rechtzeitigen Injektion von Materialien in eine große Anzahl von Embryonen oder Larven wird ein groß angelegtes Screening von Biomolekülen und Arzneimittelverbindungen erleichtern.
In dieser Studie wurde Zebrafischen bei 5 dpf LPS in einer Konzentration von 2,5-5 mg/ml injiziert; Dies wurde als optimale Bedingung für die Entwicklung des Neuroinflammationsmodells bestimmt. Unseres Wissens wurde diese Methodik in der Literatur nicht beschrieben. Folglich konnte die hirnventrikuläre Mikroinjektion von LPS in Zebrafischlarven zu Neuronenverlust und Bewegungsmangel führen. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass LPS-induzierte Neuroinflammation die Spiegel proinflammatorischer Mediatoren wie NO, TNF-α, IL-6 und IL-1β erhöht und zur Rekrutierung von Neutrophilen im Larven-Zebrafischgehirn nach 24 Stunden nach der Injektion führt. In anderen Tiermodellen kann die LPS-Injektion auch die Entwicklung von Entzündungen fördern und neuropathologische Veränderungen im Gehirn verursachen 13,54. Die Ergebnisse dieser Studie erweitern unser Verständnis der neuroinflammatorischen Signalwege. Bei dieser Methode sollte beachtet werden, dass die Öffnung der Nadeln für die Mikroinjektion nicht zu groß sein sollte, um Hirnschäden durch mechanische Operation zu vermeiden, und es sollte eine angemessene Kraft angewendet werden, um eine Beschädigung der Larven zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, den Kopf von den Augen und dem Körper von Zebrafischen zu trennen, um Entzündungsfaktoren und Stickstoffmonoxid zu bestimmen, da dies dazu beiträgt, richtungsweisende Ergebnisse zu erhalten, die spezifisch die durch LPS-Hirnventrikelinjektion induzierte Neuroinflammation widerspiegeln.
Ein kleiner Nachteil dieser Methode ist, dass aufgrund der geringen Größe der Zebrafischlarven die Menge an Biomolekülen wie der gesamten mRNA, die durch Homogenisierung und Extraktion erhalten wird, geringer ist als die des Mausmodells. Zebrafische können jedoch häufig mit mehreren hundert Eiern pro Woche laichen. Die Erhöhung der Anzahl der in jeder Gruppe verwendeten Zebrafischlarven kann ausreichende Mengen extrahierter Biomoleküle für verschiedene biochemische Assays liefern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode Neurotoxizität und eine Immunantwort im Larvenhirn des Zebrafisches induziert. Aufgrund der Transparenz des Zebrafisches können Veränderungen im Gehirn der lebenden Zebrafischlarven durch in vivo Bildgebung besser verstanden werden. Die hier beschriebene Technik ist ein hervorragendes Werkzeug, um mögliche entzündungshemmende Medikamente schnell und effizient zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren erklären kein konkurrierendes finanzielles Interesse.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Science and Technology Development Fund (FDCT) der Sonderverwaltungszone Macau unterstützt (Ref. FDCT0058/2019/A1 und 0016/2019/AKP), Forschungsausschuss, Universität Macau (MYRG2020-00183-ICMS und CPG2022-00023-ICMS) und National Natural Science Foundation of China (Nr. 81803398).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6361 | |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-207 | |
| Fluorescence stereo microscopes | Leica | M205 FA | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | Ver. 7.04 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L3024 | |
| Manual micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Mx3005P qPCR system | Agilent Technologies | Mx3005P | |
| Nanovue plus spectrophotometer | Biochrom | 80-2140-46 | |
| Nitrite concentration assay kit | Beyotime Biotechnology | S0021M | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Programmable Horizontal Pipette Puller | World Precision Instruments | PMP-102 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Random primers | Takara | 3802 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | |
| SYBR Premix Ex Taq II kit | Accurate Biology | AG11701 | |
| The 3rd Gen Tgrinder | Tiangen | OSE-Y30 | |
| Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm | World Precision Instruments | TW150F-4 | |
| Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| TRNzol Universal reagent | Tiangen | DP424 | |
| Zebrafish tracking box | ViewPoint Behavior Technology |
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