Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים במבחנה באמצעות סינפטוזומים אנושיים

Published: August 18, 2022 doi: 10.3791/64323
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) לתאים דמויי מיקרוגליה לצורך ניסויים במבחנה . אנו כוללים גם הליך מפורט ליצירת סינפטוזומים אנושיים מנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC שיכולים לשמש כמצע למבחני פאגוציטוזה במבחנה באמצעות מערכות הדמיה של תאים חיים.

Abstract

מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים ממוצא מיאלואידי המקיימים הומאוסטזיס במיקרו-סביבה של המוח והפכו לשחקן מפתח במחלות נוירולוגיות מרובות. חקר המיקרוגליה האנושית בבריאות ובמחלות מהווה אתגר בשל האספקה המוגבלת ביותר של תאים אנושיים. ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם באנשים אנושיים כדי לעקוף מחסום זה. כאן, הוא מדגים כיצד להתמיין תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים אנושיים לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs) לצורך ניסויים במבחנה . iMGs אלה מציגים את התכונות הצפויות והפיזיולוגיות של מיקרוגליה, כולל מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה, ביטוי של סמנים תקינים ופאגוציטוזה פעילה. בנוסף, מסופק תיעוד לבידוד ותיוג של מצעי סינפטוזום שמקורם בנוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC אנושי (i3LMNs). בדיקת הדמיה אורכית של תאים חיים משמשת לניטור בליעה של סינפטוזומים אנושיים המסומנים בצבע רגיש ל-pH, ומאפשרת לחקור את היכולת הפאגוציטית של iMG. הפרוטוקולים המתוארים כאן ישימים באופן נרחב לתחומים שונים החוקרים את הביולוגיה של המיקרוגליה האנושית ואת תרומתה של המיקרוגליה למחלות.

Introduction

מיקרוגליה הם תאי מערכת החיסון המתגוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS) וממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. מיקרוגליה חשובה גם במוח הבוגר לשמירה על הומאוסטזיס ולתגובה פעילה לתהליכי טראומה ומחלות. ראיות מצטברות מראות כי מיקרוגליה הם תורמים מרכזיים לפתוגנזה של מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות מרובות 1,2. אף על פי שהידע הנוכחי על ביולוגיה של מיקרוגליה נגזר בעיקר ממודלים של עכברים, מחקרים אחרונים הבהירו הבדלים חשובים בין מורין למיקרוגליה אנושית, והדגישו את הצורך בפיתוח טכנולוגיות לחקר הגנטיקה והתפקודים הביולוגיים של המיקרוגליה האנושית 3,4. בידוד של מיקרוגליה מרקמה ראשונית מנותקת יכול לשנות באופן חמור את תכונות המיקרוגליה5, מה שעלול לבלבל תוצאות שנרכשו עם תאים כאלה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים ל-iMGs, ובכך לספק מערכת תרבית תאים לחקר מיקרוגליה אנושית בתנאים בסיסיים. יתר על כן, בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מערכת מודל אנושית מלאה נכללת כאן כאמצעי לחקור את הפונקציונליות של iMGs, הן כמדד בקרת איכות והן כדי להעריך תפקוד לקוי של iMG בהקשר של מחלה.

פרוטוקולים מרובים להתמיינות מיקרוגליה מ- iPSCs הופיעו לאחרונה בספרות 6,7,8,9,10. חסרונות פוטנציאליים של פרוטוקולים מסוימים כוללים תקופות ממושכות או ארוכות של הבחנה, תוספת של גורמי גדילה מרובים ו / או הליכים ניסיוניים מורכבים 6,9,10. כאן מודגמת שיטת התמיינות "ידידותית למשתמש", המשחזרת היבטים של מיקרוגליה אונטוגנית באמצעות התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים מקדימים המכונים מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)7,11. PMPs נוצרים כפי שתואר קודם לכן, עם כמה אופטימיזציות המוצגות כאן12. ה-PMPs מחקים מקרופאגים שמקורם בחלמון שאינו תלוי בחלמון, אשר מולידים מיקרוגליה במהלך ההתפתחות העוברית על ידי פלישה למוח לפני סגירת מחסום הדם-מוח13. כדי להבדיל באופן סופי בין PMPs ל-iMGs, השתמשנו בשיטת מונוקולטורה מהירה ופשוטה המבוססת על פרוטוקולים של Haenseler et al. ו-Brownjohn et al., עם כמה שינויים כדי ליצור שיטת בידול יעילה של מיקרוגליה, שבה iMGs מבטאים בחוזקה סמנים מועשרים במיקרוגליה 7,8. ניתן לשכפל שיטת בידול זו במעבדות עם מומחיות בתרבית של iPSCs ועם מטרות מחקר שמטרתן לחקור את הביולוגיה של מיקרוגליה באמצעות מערכת מודל אנושית.

מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC מהווה מקור רלוונטי ביולוגית של מיקרוגליה אנושית לניסויים במבחנה, והם כלי חשוב לחקר תפקודים קנוניים של מיקרוגליה, כולל פאגוציטוזה. מיקרוגליה הם הפאגוציטים המקצועיים של המוח ושל מערכת העצבים המרכזית, שם הם מנקים פסולת תאים, חלבונים מצטברים ומיאלין14 פגום. מיקרוגליה מתפקדת גם בשיפוץ סינפטי על ידי בליעת סינפסות ובהגנה מפני זיהומים חיצוניים באמצעות פאגוציטוזה של פתוגנים15,16. בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה על ידי iMGs מוערכת באמצעות סינפטוזומים אנושיים כחומר לבליעת iMG. לשם כך מתואר תיאור לבידוד סינפטוזומים הנגזרים מ-i3LMNs אנושיים. הסינפטוזומים האנושיים שמקורם ב-i3LMN מסומנים בצבע רגיש ל-pH המאפשר כימות של סינפטוזומים הממוקמים בתוך מדורים חומציים במהלך עיבוד פגוזומים והשפלה במבחנה. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים מוצגת לניטור התהליך הדינמי של בליעת מיקרוגליה בזמן אמת. בדיקה תפקודית זו קובעת בסיס לחקור פגמים אפשריים בפאגוציטוזה מיקרוגליאלית בבריאות ובמחלות באמצעות מערכת אנושית שלמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה חייבים להיות סטריליים, וכל השלבים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בתנאים סטריליים. כל קווי ה- iPSC, כמו גם מדיית התחזוקה וההבחנה, מתוארים בטבלת החומרים. שיטת ההבחנה במיקרוגליה המתוארת להלן מבוססת על פרוטוקולים 7,8,12 שפורסמו בעבר עם שינויים חדשים המתוארים כאן.

1. הבחנה במיקרוגליה

הערה: סקירה כללית של הפרוטוקול מסוכמת באיור 1.

  1. תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC)
    הערה: פרטים נוספים המתארים טכניקות של תרבית iPSC ניתן למצוא במקום אחר17.
    1. הפשרה ותחזוקה
      1. הכינו מדיום iPSC, aliquot את המדיום, ואחסנו ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. הפשירו את האליקוטים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם עד שבוע. יש להשאיר את המדיה בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
      2. מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל של laminin 521 מדולל DPBS המכיל סידן ומגנזיום18. שומרים את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעתיים לפחות או עדיף למשך הלילה. לאחר דילול, לאחסן את laminin ב 4 °C במשך 3 חודשים.
      3. הכינו תמיסת מלאי של מעכב רו קינאז Y27632 (מעכב ROCK) של 10 mM על ידי דילול במים סטריליים. הכינו אליקוטים חד-פעמיים של תמיסת מעכבי ROCK ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
      4. הכן 0.5 mM EDTA על ידי דילול פתרון המלאי של 0.5 M EDTA ב- DPBS.
      5. כדי להפשיר בקבוקון של iPSCs קפואים, הניחו את הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מופשר ברובו. מיד להעביר את התוכן של הבקבוקון לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של מדיום iPSC. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך דקה אחת.
      6. שאפו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK 10 μM באיטיות על דופן הצינור כדי למנוע הפרעה למושבות.
      7. הוסיפו 1.5 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר לכל אחת מהבארות המצופות והעבירו את המושבות המחודשות טיפה אחר טיפה לבארות המכילות את המדיום.
        הערה: השתמש ב-5-7 טיפות משלב 1.1.1.6 לתחזוקת תרבית, אך התאם את צפיפות הזריעה האופטימלית עבור כל קו iPSC.
      8. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מניחים את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. למחרת, החלף לחלוטין את המדיום על ידי הוספת מדיום iPSC טרי ללא מעכב ROCK.
      9. לצורך תחזוקה, שנה את המדיום מדי יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
        הערה: ניתן לתחזק את התאים מבלי להחליף את המדיום למשך יומיים אם מדיום ה-iPSC שבו נעשה שימוש מאפשר לוח זמנים גמיש להזנה. מומלץ להגביל זאת לפעם אחת בכל מעבר ורק אם התאים פחות מ-50% נפגשים.
    2. פיצול
      1. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של DPBS (ללא סידן ומגנזיום).
      2. כדי לעקור את התאים, להוסיף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA ולדגור במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר עד קצוות מושבות התא להרים מפני השטח של הבאר. לשטוף את התאים שוב עם DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום iPSC.
      3. נתקו את מושבות התאים על ידי גירודן בעדינות באמצעות מרים תאים. יש לגרד כל אזור בבאר פעם אחת בלבד כדי לא להפריע למושבות.
        הערה: שיטות חלופיות לעקירת המושבות מהבאר ניתן למצוא במקומות אחרים17.
      4. באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל, לאסוף את התאים ולהעביר אותם טיפה אחר טיפה ביחס של 1:6 (תאים לבינוני) לבארות מצופות מראש (כפי שצוין בשלב 1.1.1.2) המכילות 1.5 מ"ל של מדיום iPSC.
  2. התמיינות iPSC לתאים דמויי מיקרוגליה (iMGs)
    הערה: המולקולות הקטנות וגורמי הגדילה מומסים באלבומין בסרום בקר 0.1% מסונן סטרילי ב-DPBS לריכוז מלאי גבוה פי 1,000 מהריכוז הסופי. מומלץ להבדיל בין iPSCs ל-iMGs במהלך מעברים מוקדמים. מומלץ לבצע קריוטיפ שגרתי של קווי iPSC.
    1. הכנת פתרון ציפוי סטנדרטי
      1. הפשרת תמיסת המלאי של מגיב ציפוי מטריצה חוץ-תאית על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      2. צינורות מיקרוצנטריפוגה Prechill וטיפים פיפטה מסנן ב 4 מעלות צלזיוס.
      3. Aliquot 250 μL של ריאגנט ציפוי מטריצה חוץ-תאית מרוכזת לתוך כל צינור ומיד להניח על קרח. אחסנו את האליקוטים ב-20°C-.
      4. כדי להכין את תמיסת הציפוי, הפשירו את אחד הריאגנטים לציפוי מטריצה חוץ-תאית על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      5. הוסף 50 מ"ל של DMEM-F12 קר כקרח הממוטב לגידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים ומושרים אנושיים (המכונים DMEM-F12) לצינור חרוטי מוכן מראש ושמור אותו על קרח.
      6. צנן קצה פיפטה של 1 מ"ל על ידי פיפטינג DMEM-F12 קר כקרח למעלה ולמטה מספר פעמים, ולאחר מכן השתמש מיד בקצה הפיפטה כדי להעביר 250 μL של מגיב ציפוי המטריצה החוץ-תאית לתוך הצינור החרוטי המכיל את המדיום DMEM-F12.
        הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הציפוי הסטנדרטית למשך שבועיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. היווצרות גוף עוברי (EB)
      1. הכינו EB בינוני שניתן לשמור עליו בטמפרטורה של 4°C למשך עד 4 ימים.
      2. לאחר שה- iPSCs הגיעו למפגש של 80%, נתקו את המושבות על ידי שטיפה עם 1 מ"ל של DPBS והוספת 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה למשך 2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. נתקו את המושבות באמצעות מרים תאים על ידי גירוד מספר פעמים כדי ליצור מתלה חד-תאי. לאסוף את התאים ולהעביר הכל לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של DPBS.
      3. צנטריפוגה של התאים ב 500 × גרם במשך דקה אחת, להסיר את supernatant, ו resuse את התאים ב 1 מ"ל של מדיום EB. קח 10 μL של תאים ולדלל 1:1 עם כחול טריפאן. ספרו את התאים בעזרת המציטומטר, ובהתבסס על ספירת התאים, דיללו את מלאי התאים לדילול סופי של 10,000 תאים לכל 100 μL. עבור ציפוי תאים, הוסף 100 μL של התאים המדוללים לכל באר לתוך דבק נמוך, תחתית עגולה, 96 באר.
        הערה: באופן כללי, ניתן לקבל 48 בארות של צלחת 96 בארות מכל באר מפגש של 80% של iPSCs.
      4. צנטריפוגה את הצלחת ב 125 × גרם במשך 3 דקות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך 4 ימים. בצע שינוי חצי-בינוני ביום השני על-ידי שימוש בפיפטה רב-ערוצית ואיסוף עדין של 50 μL של מדיום ישן, ולאחר מכן הוספת 50 μL של מדיום EB טרי.
        הערה: ביום הרביעי, iPSCs ייצרו מבנים תאיים כדוריים המכונים EBs כמתואר בסעיף התוצאות. ניתן להאריך את תהליך ההבחנה של EB עד 7 ימים, במידת הצורך.
    3. יצירת מבשרי מקרופאגים פרימיטיביים (PMPs)
      1. הכינו בסיס PMP בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
      2. מצפים את הבארות של צלחת 6 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת ציפוי Matrigel קרה כקרח ודגירה ב 37 °C ו 5% CO 2 לפחות2 שעות או עדיף לילה.
      3. ביום הרביעי של התמיינות EB, העבירו את ה-EBs לבארות המצופות במטריגל על ידי איסוף ה-EBs עם קצוות פיפטה של 1 מ"ל (באמצעות פיפטה). פיפטה למעלה ולמטה פעם או פעמיים כדי לנתק את ה- EBs מהבאר. החזק את צלחת 6 הבארות בזווית מוטה כדי לאפשר ל- EBs להתיישב בקצה הבאר.
        הערה: ניתן לצפות תשעה או עשרה EBs לכל ציפוי היטב.
      4. לאחר שכל ה- EBs התיישבו, פיפטה בעדינות והסר את המדיום הישן באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל תוך שמירה על ה- EBs בקצה הבאר. הוסיפו 3 מ"ל של PMP בינוני טרי לכל באר. פזרו באופן שווה את התאים בבארות על ידי ערבוב ידני של הצלחת מצד לצד ובחזרה לחזית. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
      5. אין להפריע לצלחת במשך 7 ימים כדי לאפשר ל- EBs להתחבר לתחתית הבאר. לאחר זמן זה, בצע שינוי חצי-בינוני באמצעות מדיום מלא PMP.
        הערה: בשלב זה, רוב ה- EBs צריכים להיות מחוברים לצלחת. ניתן להסיר כל EBs צפים.
      6. לאחר 5-7 ימים, בדוק את ה- EBs תחת מיקרוסקופ שדה אור בהגדלה של פי 4 כדי לוודא שהם מחוברים לתחתית הבארות. שנה את המדיום כמתואר ב- 1.2.3.5. ביום 21, בצע שינוי בינוני מלא עם 3 מ"ל של מדיום שלם PMP.
        הערה: אבות מיאלואידים שצפים בתווך עשויים להיות ניכרים בנקודה זו. תאים אלה צריכים להיות מושלכים במהלך השינוי הבינוני.
      7. ביום ה-28, חפשו תאים עגולים המכונים PMPs בסופר-נטנט ואספו את המדיום המכיל את ה-PMPs באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ופיפטור אוטומטי. היזהרו לא להפריע ל-EBs. העבר את ה- PMPs ואת המדיום לצינור חרוטי של 15 מ"ל והמשך כמתואר בשלב 1.2.4.
        הערה: בדרך כלל ניתן לאסוף PMPs מאותו קו iPSC מחמש בארות של צלחת 6 בארות ולאגד יחד בצינור חרוטי יחיד של 15 מ"ל.
      8. הוסף 3 מ"ל של PMP טרי בינוני שלם לתחזוקה נוספת של EBs. מכיוון ש-PMPs מגיחים ברציפות מ-EBs במשך יותר מ-3 חודשים, אספו אותם כל 4-7 ימים (אל תאפשרו למדיום לשנות את צבעו לגוון צהוב) כמתואר בשלבים 1.2.3.7 ו-1.2.3.8.
        הערה: למרות שניתן לאסוף PMPs במשך מספר חודשים, הם עשויים לשנות את הפנוטיפ שלהם עם הזמן.
    4. בידול ל-iMGs
      1. הכינו מדיום בסיס iMG (טבלת חומרים), סננו סטרילי ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
      2. לאחר שה-PMPs נאספו לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל, צנטריפוגה שלהם ב-200 × גרם למשך 4 דקות. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את ה-PMPs באמצעות 1-2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG. לספור את התאים באמצעות hemocytometer על ידי לקיחת aliquot קטן דילול 1:1 עם כחול טריפאן.
        הערה: 0.5-1.5 × 106 PMPs מתקבלים בדרך כלל מדי שבוע בהתאם לקו iPSC ולגיל של תרבות EB.
      3. צנטריפוגה של שאר התאים שוב ב 200 × גרם במשך 4 דקות. לדלל את ה-PMPs לריכוז הרצוי כך שהתאים מצופים בצפיפות של ~105/ס"מ2 על צלחות שטופלו בתרבית תאים באמצעות מדיום iMG שלם שהוכן טרי. בצעו החלפה חצי-בינונית באמצעות iMG Complete Medium טרי כל 3-4 ימים במשך 10-12 ימים כדי לאפשר בידול מסוף.
        הערה: בשלב זה, התאים צריכים לרכוש מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה. כדי לאשר את המחויבות של PMPs לגורל המיקרוגליה, ניתוח אימונופלואורסצנטי מבוצע כדי לאמת את הביטוי של סמנים מועשרים במיקרוגליה כגון קולטן פורינרגי P2RY12 וחלבון טרנסממברנה 119 (TMEM119)9.
      4. כדי לשמור על בריאות התאים ועל הכדאיות, בצע את כל הניסויים בין הימים 10 עד 12 של התמיינות iMG.

2. בדיקת פאגוציטוזה באמצעות סינפטוזומים אנושיים שמקורם בנוירונים מוטוריים

  1. התמיינות בתיווך גורם שעתוק של נוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC (i3LMNs)
    הערה: קו WTC11 עם הכנסה יציבה של קלטת גורם השעתוק האינדוקטיבי hNIL המכילה את גורמי השעתוק של הנוירוגנין-2 (NGN2), האיון-1 (ISL1) והומיאובוקס 3 (LHX3) של LIM לתוך לוקוס נמל מבטחים CLYBL שימש לתהליך ההתמיינות כפי שתואר קודם לכן17. קו ה-iPSC נשמר כמתואר בשלב 1.1.1 אך עם תנאי הציפוי המתוארים בשלב 1.2.1. כל מגיב ציפוי מטריצה חוץ-תאית יכול לשמש לגידול iPSCs שישמשו להתמיינות עצבית מכיוון שאין צורך בלמינין 521. כל אמצעי התקשורת מאוזנים לטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש.
    1. צלחת מעיל 10 ס"מ עם 5 מ"ל של תמיסת ציפוי סטנדרטית כמתואר בשלב 1.2.1.
      הערה: כאן, 3-4 מנות 10 ס"מ שימשו לכל הבחנה.
    2. הכינו בסיס אינדוקציה בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
    3. הכינו נוירון בינוני, מסנן סטרילי, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
    4. הכינו את חיץ הבוראט על ידי ערבוב של 100 mM חומצה בורית, 25 mM נתרן טטרבורט ו-75 mM נתרן כלורי במים סטריליים. התאם את ה-pH ל-8.5 וסנן אותו בצורה סטרילית.
    5. לאחר שה-iPSCs הגיעו למפגש של 80%, שטפו את התאים עם DPBS ונתקו את המושבות על ידי הוספת 0.5 mM EDTA.
      הערה: שתי בארות מספיקות בדרך כלל לכל צלחת בקוטר 10 ס"מ.
    6. דגירה של התאים במשך 4-5 דקות בטמפרטורת הסביבה. הסר את EDTA והוסף 3 מ"ל של DMEM / F12 עם HEPES לכל באר.
    7. לגרד את התאים באמצעות מרים תאים ולהשתמש פיפטה 10 מ"ל כדי להסיר את התאים מתחתית הבאר על ידי pipetting בעדינות למעלה ולמטה 2-3x.
    8. לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 3 דקות.
    9. יש לתלות את התאים ב-3 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב ROCK של 10 מיקרומטר ולספור אותם באמצעות המציטומטר.
    10. צלחת 1.5 × 106 iPSCs בצלחת מצופה מראש 10 ס"מ עם 12 מ"ל של מדיום iPSC המכיל מעכב 10 μM ROCK.
    11. למחרת, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS. הוסף 12 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה שהוכן טרי כדי לגרום לביטוי של גורמי השעתוק.
    12. ביום השני, מצפים כלים בקוטר 10 ס"מ עם תמיסת ציפוי נוירונים של 5 מ"ל שהוכנה בנפחים שווים של 0.1 מ"ג/מ"ל של פולי-D-ליזין ו-1 מ"ג/מ"ל של פולי-ל-אורניתין מדולל בחיץ בוראט. דגירה לילה ב 37 °C ו 5% CO2.
    13. ביום השלישי, שטפו את הכלים המצופים במים סטריליים פי 3, שאפו את המים לחלוטין, ותנו לכלים להתייבש על ידי הטיית הצלחות והשארתם חשופים חלקית בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך שעה לפחות בטמפרטורת הסביבה.
    14. לאחר שהמנות התייבשו לחלוטין, צפו אותן ב-6 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה בתוספת 15 מיקרוגרם/מ"ל של למינין ו-40 μM BrdU למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: טיפול BrdU מומלץ לחסל תאים פעילים מיטוטית ובכך לשפר את טוהר התרביות העצביות. ההשפעות של BrdU על בריאות הנוירונים הן מינימליות.
    15. טפל בתאים המתמיינים עם 3 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לכל צלחת 10 ס"מ ודגרה במשך 3-4 דקות בטמפרטורת הסביבה.
    16. הוסף 6 מ"ל של DPBS לצלחת מבלי להסיר את מגיב הדיסוציאציה ופיפט את התאים בתמיסה למעלה ולמטה 4-5x עם פיפטה של 10 מ"ל כדי לנתק את התאים.
    17. לאסוף את מתלה התא ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 μm לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום בסיס אינדוקציה כדי לשטוף את המסננת.
    18. צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את המדיום והחזירו את התאים ב-3 מ"ל של מדיום אינדוקציה מלאה המכיל 40 μM BrdU.
    19. לספור את התאים עם hemocytometer. צלחת כ 2.5 × 10 6 תאים לכל צלחת 10 ס"מ לתוך כלים מצופים מראש על ידי דילול התאיםב 6 מ "ל של מדיום אינדוקציה מלאה המכיל 40 μM BrdU מבלי להסיר את תמיסת הציפוי הוסיף בשלב 2.1.14.
    20. ביום הרביעי, שאפו את המדיום, שטפו את התאים פי 1 עם DPBS והוסיפו מדיום אינדוקציה מלא טרי המכיל 40 μM BrdU.
    21. ביום 6, שאפו את המדיום, שטפו את התאים פי 1 עם DPBS, והוסיפו מדיום נוירון בתוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל של למינין.
    22. ביום התשיעי, החליפו 1/3 מהמדיום על ידי החלפתו במדיום נוירון טרי בתוספת 1 מיקרוגרם/מ"ל של למינין.
    23. שמור על i 3 LMNs במשך 25 ימים נוספים על ידי ביצוע שינויים בינוניים למחצה עם נוירון בינוני בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל טרי של laminin כל3-4ימים.
      הערה: בנקודת זמן זו, i3LMNs צריך להציג מורפולוגיה עצבית עם תהליכים ארוכים. נוירונים גם נוטים ליצור גושים או אשכולות של תאים. תיאור מפורט יותר של איך לאמת את ההבחנה של i3LMNs ניתן למצוא במקום אחר17.
  2. טיהור ותיוג סינפטוזום
    הערה: שמור על תנאים סטריליים ובצע את כל השלבים בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. לשטוף i3 LMNs פעמיים עם DPBS.
    2. הוסיפו 2 מ"ל של מגיב תזה של תאים קרים כקרח לבידוד של סינפטוזומים, דגרו על קרח למשך 2 דקות, וגרדו היטב את הנוירונים.
    3. מעבירים את הליזאט למספר מיקרו-צינוריות של 2 מ"ל (~1.5 מ"ל ליזאט לכל צינור) וצנטריפוגה ב-1,200 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: שמור את הצינורות על קרח לאורך כל הליך זה.
    4. לאסוף את supernatant (להשליך את הכדור) צנטריפוגה ב 15,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור והשהה את הכדור המכיל את הסינפטוזומים בנפח דומה (כמו הליזאט המקורי) של 5% DMSO ב- DPBS.
      הערה: ניתן לסמן את הסינפטוזומים באופן מיידי עם פלואורופור או לאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
    5. בצע בדיקת חלבון של חומצה ביסינצ'ונית (BCA) עבור כל הצינורות כדי להעריך את התפוקה הכוללת של חלבון בתכשיר הסינפטוזום.
      הערה: ניתן להשתמש במבחנים אחרים למדידת ריכוז החלבון. תפוקת החלבון הכוללת המתקבלת מתכשירים שונים נכללה בטבלה 1 כהפניה. מומלץ לבצע ניתוח כתם מערבי של הכנת הסינפטוזום כדי לאשר את נוכחותם של חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. כאן נבחרו הסמן הקדם-סינפטי, סינפטופיזין (SYP), והסמן הפוסט-סינפטי, חלבון הצפיפות הפוסט-סינפטית 95 (PSD95) לניתוח כתמים מערביים כפי שתואר קודםלכן 19.
    6. הכינו תמיסה של 100 mM סודיום ביקרבונט במים, התאימו את ה-pH ל-8.5 ופילטר סטרילי.
    7. יש להפוך 1 מ"ג של אבקה ליופילית של הצבע הרגיש ל-pH לשימוש ב-150 מיקרוגרם של DMSO. הכינו אליקוטים חד-פעמיים ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    8. צנטריפוגה הסינפטוזומים ב 15,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    9. יש לדלל עד 1 מ"ג של סינפטוזומים ב-100 μL של תמיסת סודיום ביקרבונט של 100 mM.
    10. כדי לסמן את הסינפטוזומים, יש להוסיף 1 μL של הצבע הרגיש ל-pH המשוחזר לכל 1 מ"ג של סינפטוזומים ולכסות את התגובה ברדיד אלומיניום כדי להימנע מחשיפה לאור. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך שעתיים באמצעות שייקר צינור.
    11. הוסף 1 מ"ל של DPBS לצינור וצנטריפוגה את הסינפטוזומים המסומנים ב 15,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C.
    12. יש להסיר את הסופר-נטנט ולבצע ארבע כביסות נוספות כמתואר בשלב 2.2.11.
    13. לאחר השטיפה והסיבוב הסופיים, הסר את הסופרנטנט ככל האפשר מבלי להפריע לכדור ושלח מחדש את הסינפטוזומים המסומנים עם 5% DMSO ב- DPBS בנפח לריכוז הרצוי (0.7 מיקרוגרם / μL המשמש כאן). מכינים אליקוטים חד-פעמיים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הקפידו להימנע מחשיפה לאור לסינפטוזומים המסומנים.
  3. בדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים
    1. צלחת 20-30 × 104 PMPs לתוך 96-באר צלחות ב 100 μL של iMG מדיום שלם ולעקוב אחר תהליך ההבחנה במשך 10 ימים כפי שמצוין בשלב 1.2.4.
    2. ביום הבדיקה, הכינו את תמיסת הצביעה הגרעינית על ידי הוספת טיפה אחת של כתם גרעיני לתאים חיים ל-2 מ"ל של מדיום בסיסי iMG.
    3. הסר 40 μL של בינוני לכל באר של צלחת 96 באר ולהוסיף 10 μL של תמיסת צביעה גרעינית באמצעות פיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 37 °C ו 5% CO 2 במשך2 שעות.
    4. הפשירו את הסינפטוזומים המסומנים על הקרח וסוניקו בעדינות באמצעות סוניק מים למשך דקה אחת. מעבירים מיד את הסינפטוזומים בחזרה לקרח. לדלל את הסינפטוזומים המסומנים בתווך שלם iMG ביחס של 1 μL של סינפטוזומים לכל 50 μL של מדיום.
      הערה: ריכוז הסינפטוזום תלוי בבדיקה ועשוי לדרוש אופטימיזציה. כדי לשמור על אחוז נמוך יחסית (כלומר, 0.1% או פחות) של DMSO במדיום, מומלץ לא להוסיף יותר מ -2 μL של סינפטוזומים לכל באר.
    5. כבקרה שלילית, יש לטפל בחלק מהבארות עם ציטוכלזין D כדי לעכב פילמור אקטין ובכך פאגוציטוזה. הכן פתרון של 60 μM ציטוכלזין D במדיום שלם iMG. הוסף 10 μL של תמיסה זו לכל באר לריכוז סופי של 10 μM ודגירה ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 30 דקות.
    6. הסר את הצלחת מהאינקובטור ודגירה ב 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמרו את הצלחת על קרח והוסיפו 50 μL של מדיום המכיל סינפטוזומים שהוכנו כמתואר בשלב 2.3.4.
    7. צנטריפוגה של הצלחת ב 270 × גרם במשך 3 דקות ב 10 מעלות צלזיוס ולשמור את הצלחת על קרח עד רכישת הדמיה.
  4. רכישה וניתוח הדמיה
    1. הכנס את הצלחת לקורא הדמיה של תאים חיים ובחר את הבארות לניתוח.
    2. בחר עדשה אובייקטיבית של 20x .
    3. כוונן את המיקוד, עוצמת הדיודה פולטת האור (LED), זמן האינטגרציה והרווח של ערוצי השדה הבהיר והכחול (4',6-diamidino-2-פנילינדול [DAPI]). הפלואורסצנציה הסינפטוזומית צריכה להיות זניחה בנקודת הזמן הראשונית. כדי להתמקד בערוץ האדום (RFP), השתמש בערוץ שדה בהיר כהפניה. זמן האינטגרציה והרווח יכולים להשתנות בין ניסויים; השתמש בהגדרות ראשוניות אלה עבור הערוץ האדום: LED: 4, זמן אינטגרציה: 250, ורווח: 5.
    4. בחר את מספר האריחים הבודדים שיירכשו במונטאז' לכל באר (רכשו 16 אריחים במרכז הבאר, ובכך הדמיינו כ-5% משטח הבאר הכולל). הגדר את הטמפרטורה ל- 37 °C ואת מרווח הזמן הרצוי להדמיה.
      הערה: תמונות נרכשו כל 1 - 2 שעות במשך עד 16 שעות במחקר זה.
    5. פתח את תוכנת הניתוח.
      1. פתח את הניסוי המכיל את התמונות. לחץ על סמל הפחתת נתונים.
      2. בתפריט, בחר תפירת הדמיה תחת עיבוד הדמיה כדי ליצור תמונה מלאה מהאריחים הבודדים בגודל 4 x 4 במונטאז' עם הפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
      3. לאחר יצירת התמונות התפורות, הגדר סף עוצמה באמצעות ערוצי DAPI ו- RFP עבור תמונות אלה. פתח תמונה ולחץ על נתח; תחת ניתוח, בחר ניתוח סלולארי, ותחת ערוץ זיהוי, בחר תמונה תפורה בערוצי DAPI או RFP. עבור אל הכרטיסייה מסיכה ראשית וספירה וקבע ערך סף וערכי גודל אובייקט שבוחרים כראוי את גרעיני התא בערוץ DAPI או את אות הסינפטוזום בערוץ RFP. חזור על התהליך עם תמונות שונות עד למיטוב פרמטרים שניתן להחיל על הניסוי כולו.
        הערה: ניתן למצוא ערכים מוצעים בטבלה 2.
      4. כדי לספור את מספר הגרעינים, עבור אל תפריט הפחתת נתונים , ותחת ניתוח תמונה, בחר ניתוח סלולארי. עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה ותחת ערוץ, בחר את התמונות התפורות של DAPI והשתמש בפרמטרים המתוארים בטבלה 2.
      5. עבור אל הכרטיסיה מדדים מחושבים ובחר ספירת תאים. כדי לקבל את האזור של אות הסינפטוזום, עבור אל תפריט הפחתת נתונים ותחת ניתוח, בחר ניתוח סלולרי.
      6. עבור אל הכרטיסיה מסיכה ראשית וספירה ותחת ערוץ, בחר תמונות תפורות RFP והשתמש בפרמטרים המפורטים בטבלה 2.
      7. עבור אל הכרטיסיה מדדים מחושבים ובחר אזור סכום אובייקט. בכרטיסייה הפחתת נתונים , לחץ על אישור ואפשר לתוכנה לנתח את כל התמונות שנרכשו.
      8. יצא את הערכים ' סכום אובייקטים ' ו'ספירת תאים' עבור כל נקודת זמן. חלק את האזור 'סכום אובייקט ' בספירת התאים כדי לחשב את האזור המנורמל לכל נקודת זמן. אם משווים מספר טיפולים או גנוטיפים, חשבו את מדד הפאגוציטוזה באמצעות משוואה (1):
        Equation 1 (1)
      9. שמור את התוצאות ושלב את הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי ליצור iMGs באמצעות פרוטוקול זה, חשוב להתחיל עם iPSCs לא מובחנים שמראים מורפולוגיה של מושבה קומפקטית עם קצוות מוגדרים היטב (איור 2A). iPSCs מנותקים המוחזקים כמתואר בסעיף היווצרות EB ייצרו אגרגטים כדוריים, המכונים EBs, אשר יגדלו בגודלם עד ליום 4 של ההתמיינות (איור 2B). לאחר שה-EBs נאספים ומצופים בתנאים המתאימים ליצירת PMP, הם מתחברים ללוחות המצופים במטריגל, ושכבת תאים תתפשט ותקיף את האגרגטים הכדוריים (איור 2C). EBs לא בריאים יתנתקו מהצלחת ויש לחסל אותם. מהיום ה-14 עד ה-21 של יצירת PMP, סוגי תאים שונים יכולים לצוץ ולצוף בתווך; תאים אלה יש להשליך במהלך שינויים מדיה12. ביום ה-28, תאים עגולים עם יחס גדול בין ציטופלסמה לגרעין יופיעו בתרחיף (איור 2D), המכונים PMPs. תאים אלה מיוצרים ברציפות וניתן לקצור אותם מדי שבוע במהלך שינויים בינוניים עד 3 חודשים. מספר ה-PMPs שנקטפים מדי שבוע משתנה ותלוי בקו ה-iPSC ובגיל התרבית; התשואה בדרך כלל יורדת עם הזמן. מומלץ מאוד לתרבת תאי גזע פלוריפוטנטיים בלוחות מצופים למינין 521 במקום במטריגל, מכיוון שתפוקת ה-PMP גבוהה יותר כאשר תאי גזע פלוריפוטנטיים מוחזקים בתנאים הקודמים כפי שדווח בעבר ובמחקר זה (איור 2E)18.

לאחר ש-PMPs נחשפו למדיום iMG במשך 10-12 ימים, התאים רוכשים מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה עם ציטופלסמה קטנה ונוכחות של תהליכים מוארכים (איור 3A). כדי לאמת את זהות המיקרוגליה, ביצענו צביעה אימונופלואורסצנטית עם נוגדנים כנגד הסמן המיאלואידי מולקולת מתאם סידן מיונן 1 (IBA1) והסמנים המועשרים במיקרוגליה קולטן פורינרגי P2RY12 וחלבון טרנסממברנה 119 (TMEM119) כפי שתואר קודםלכן 20 (ראו גם את טבלת החומרים). בדרך כלל, >95% מהתאים מבטאים IBA1 וכ-90% מהתאים מבטאים P2RY12 ו-TMEM119 (איור 3B).

כדי להעריך את הקיבולת הפאגוציטית של iMGs,נעשה שימוש בסינפטוזומים אנושיים שמקורם ב-LMN המסומנים בצבע רגיש ל-pH. כדי לוודא שהתכשיר הסינפטוזום שומר על תכונות מבניות קנוניות, העשרת הסמן הקדם-סינפטי, הסינפטופיזין (SYP) והסמן הפוסט-סינפטי, חלבון הצפיפות הפוסט-סינפטית 95 (PSD95)19 אושרו על ידי ניתוח כתמים מערביים (איור 4) שבוצע כמתואר לפני20 (ראו גם את טבלת החומרים ). סינפטוזומים המסומנים בצבע רגיש ל-pH הופכים לפלואורסצנטיים לאחר שהם נבלעים על-ידי iMGs וברגע שהם ממוקמים בתוך תאים חומציים תוך-תאיים (כלומר, בעלי pH נמוך).

בנקודת הזמן הראשונית, האות הפלואורסצנטי האדום היה מינימלי, מכיוון שרוב הסינפטוזומים עדיין לא היו פאגוציטוזומים. לאחר 30 דקות, אות פלואורסצנטי אדום זוהה ועלה עוד יותר עם הזמן. עד 10 שעות, האות הפלואורסצנטי האדום היה חזק, מכיוון שרוב הסינפטוזומים נבלעו והתמקמו לתאים תוך-תאיים חומציים בתהליך של פאגוציטוזה (איור 5A). Cytochalasin D הוא מעכב פולימריזציה אקטין בשימוש נרחב כדי לחסום phagocytosis. כצפוי, ראינו הפחתה חזקה של האות הפלואורסצנטי האדום ב-iMGs שטופלו ב-D, מה שמצביע על כך שהאות שזוהה נובע מאירועים פאגוציטיים. שמנו לב גם ש- iMGs מראים שינויים במורפולוגיה לאחר 10 שעות של פאגוציטוזה שלא זוהו ב- iMGs שטופלו ב- Cytochalasin D, אולי בגלל היעדר שיפוץ אקטין ב- iMGs שטופלו ב- Cytochalasin D. שינויים במורפולוגיה של מיקרוגליה קשורים בדרך כלל למצב הפעלה2.

על ידי שימוש בשיטת הכימות האוטומטית המתוארת, מדדנו את השטח הכולל של האות האדום בכל נקודת זמן ונרמלנו אותו למספר התא המתקבל על ידי ספירת הגרעינים. התוצאות מצביעות על כך שאזור הסינפטוזומים הנבלעים גדל עם הזמן עד שהגיע לרמה של 16 שעות. כצפוי, אזור האות האדום מתאי ציטוכלזין D שטופלו לא גדל עם הזמן, מאחר שפאגוציטוזה עוכבה (איור 5B). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ש-iMGs מסוגלים לפאגוציטוזה של חומר רלוונטי למחלות מוח ומתאימים למחקרים פונקציונליים.

Figure 1
איור 1: סכמת הפרוטוקול להתמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים לתאים דמויי מיקרוגליה. ביום 0, לאחר שה-iPSCs מגיעים ל-80% מפגש, המושבות מפורקות לתאים בודדים ומתורבתות במדיום EB כדי לגרום להיווצרות EB. ביום הרביעי, EBs נאספים ומצופים במדיום PMP כדי לגרום ליצירת PMP. לאחר 28 יום, PMPs נאספים ומובחנים באופן סופי ל-iMGs באמצעות מדיום iMG. ניתן לאסוף PMPs מדי שבוע למשך עד 3 חודשים. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; iMGs = תאים דמויי מיקרוגליה; EB = גוף העובר; PMP = מבשר מקרופאגים פרימיטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה של תאים המוערכת על-ידי מיקרוסקופיית אור בשלבי ההתמיינות מ-iPSCs ל-PMPs. (A) iPSCs נשמרים במדיום iPSC עד למפגש של 80%. (B) גוף עובר לאחר 4 ימים של התמיינות במדיום EB. (C) EBs המחוברים ללוחות מצופים ו-(D) PMPs היוצאים בהשעיה מ-EBs לאחר 28 ימים של תרבית במדיום PMP. (E) מספר PMPs שנאספו מ~48 EBs בשבוע 1 (לאחר 28 ימים של התמיינות PMP) ובשבוע 12. תרשימי עמודות מציגים את הממוצע של שש הבחנות בלתי תלויות (נקודות נתונים) משני קווי iPSC שונים. הנתונים הסטטיסטיים התקבלו על ידי מבחן ההשוואות המרובות של ANOVA ו-Šídák. סרגלי קנה מידה = 1,000 מיקרומטר (A), 400 מיקרומטר (B-D). קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; iMGs = תאים דמויי מיקרוגליה; EB = גוף העובר; PMP = מבשר מקרופאגים פרימיטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: iMGs המובחנים על-ידי פרוטוקול זה מציגים מאפייני מיקרוגליה בתום לב לאחר 10 ימים של התמיינות מסוף. (A) תמונה מייצגת של iMGs המציגים מורפולוגיה דמוית מיקרוגליה. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (B) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של iMGs המבטאות את סמני המיאלואידים/מיקרוגליה IBA1, P2RY12 ו- TMEM119. סרגלי קנה מידה = 400 מיקרומטר (A), 50 מיקרומטר (B). קיצורים: iMGs = תאים דמויי מיקרוגליה; IBA1 = מולקולת מתאם סידן מיונן 1; P2RY12 = קולטן פורינרגי P2RY12; TMEM119 = חלבון טרנסממברנה 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: i3סינפטוזומים אנושיים שמקורם ב-LMN ביטאו סמנים סינפטיים על-ידי ניתוח כתמים מערביים. ניתוח כתם מערבי מייצג של תכשיר סינפטוזום אנושי שמקורו ב-i3LMN לאחר 28 ימים של תרבית שנחקר עם הסמן הפוסט-סינפטי, PSD95, הסמן הקדם-סינפטי, SYP ו-β-טובולין. קיצורים: i3LMN = נוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב- iPSC; PSD95 = חלבון צפיפות פוסט-סינפטית 95; SYP = סינפטופיזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: בדיקת פאגוציטוזה של iMGs באמצעות סינפטוזומים אנושיים המסומנים בצבע רגיש ל-pH ומנוטרים על-ידי הדמיה אורכית של תאים חיים. (A) מונטאז'ים מייצגים של שדות בהירים ופלואורסצנטיים של iMGs עם צביעה גרעינית (ערוץ כחול) החשופים לסינפטוזומים אנושיים מסומנים (ערוץ אדום) עם ובלי טיפול ב-cytoD בנקודות הזמן שצוינו. המונטאז'ים נוצרו על ידי עיבוד לאחר עיבוד של 16 אריחים שנרכשו במחיר של פי 20. פסי קנה מידה= 400 מיקרומטר. (B) כימות האזור של אות הפלואורסצנט הסינפטוזום המנורמל למספר התא. נקודות נתונים מציינות את ± SEM הממוצע של שלושה שכפולים טכניים. כל עקומה מציגה את הכימות עבור שתי הבחנות בלתי תלויות (iMGs 1 ו-2) מקו iPSC אחד עם ובלי טיפול cytoD. קיצורים: iMGs = תאים דמויי מיקרוגליה; cytoD = cytochalasin D. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מספר מנות 10 ס"מ של DIF28 i3LMN סה"כ חלבון (מיקרוגרם)
2 143.2
2 34.9
5 613.8
7 1,159

טבלה 1: תפוקת החלבון הכוללת לאחר בידוד סינפטוזום מנוירונים בעלי מוטוריקה נמוכה שמקורם ב-iPSC ב-28 ימים של התמיינות. כמות החלבון הכוללת שהתקבלה מארבע התמיינות בלתי תלויות לאחר מיצוי סינפטוזומים. בכל הבחנה נקטפו מספר שונה של כלים בקוטר10ס"מ המכילים i 3 LMN. תפוקת החלבון נמדדה על ידי בדיקת חלבון BCA. קיצורים: iPSCs = תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים; i3LMN = נוירונים מוטוריים נמוכים שמקורם ב-iPSC; DIF28 = 28 ימים של הבחנה; BCA = חומצה ביסינצ'ונית.

פרמטרים ערך
ערוץ רישום שדה בהיר, DAPI ו- RFP
שיטת היתוך מיזוג ליניארי
חיתוך תמונה תפורה להסרת מלבנים שחורים בגבולות בדק
צמצום תמונה סופית בדק
פרמטרים ערך
סף נקבע על ידי המשתמש
רקע חשוך
פיצול אובייקטים נוגעים בדק
מילוי חורים במסיכות בדק
גודל אובייקט מינימלי 7 מיקרומטר
גודל אובייקט מרבי 30 מיקרומטר
הכללת אובייקטי קצה ראשיים בדק
ניתוח תמונה שלמה בדק
פרמטרים ערך
סף נקבע על ידי המשתמש
רקע חשוך
פיצול אובייקטים נוגעים בדק
מילוי חורים במסיכות בדק
גודל אובייקט מינימלי 5 מיקרומטר
גודל אובייקט מרבי 100 מיקרומטר
הכללת אובייקטי קצה ראשיים בדק
ניתוח תמונה שלמה בדק

טבלה 2: פרמטרים המשמשים לרכישת הדמיה וניתוח נתונים. פרמטרים מוצעים שיש לקחת בחשבון לרכישת הדמיה במהלך בדיקת phagocytosis ולניתוח של התמונות שנרכשו מפורטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה יעילה להשגת תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם ב-iPSC תוך ~6-8 שבועות בטוהר גבוה ובתפוקה מספקת לביצוע ניסויים אימונופלואורסצנטיים ומבחנים אחרים הדורשים מספר גבוה יותר של תאים. פרוטוקול זה הניב עד 1 × 106 iMGs בשבוע אחד, המאפשר מיצוי חלבונים ורנ"א וניתוחים תואמים במורד הזרם (למשל, RNASeq, qRT-PCR, כתם מערבי, ספקטרומטריית מסה). עם זאת, מגבלה של פרוטוקול זה היא שהתפוקה של iMGs עשויה להגביל יישומים מסוימים. ניתן ליישם שינויים נוספים כדי לצבור PMPs משבועות שונים ולשמור על תרבות הומוגנית בהשעיה עד שנאספים מספיק אבות כדי להמשיך בתהליך ההבחנה בבת אחת18. לחלופין, ניתן להגדיל את ההתמיינות של EBs על ידי שימוש בלוחות תרבית תאים בעלי שטח גבוה יותר כדי להגביר את הייצור של PMPs.

מומלץ להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מתורבתים בלוחות מצופים למינין 521 כדי להתחיל בתהליך ההתמיינות שלהם. ריאגנטים אחרים לציפוי יכולים להפחית את מספר ה-PMPs המיוצרים בהמשך התהליך18. באופן דומה, ציפוי הלוחות להידבקות EB במהלך יצירת PMP משפר את חיבור ה-EB, ובכך מאריך את חיי התרבית. תרבות EB נשמרת עד 4 חודשים, ואז מספר EBs מתנתקים ומתים. עם זאת, חוקרים אחרים מדווחים על גידול EBs עד שנה12. בידינו, iMGs שנוצרו מתרביות EB בנות 3 חודשים שומרים על תכונות פונקציונליות דומות לאלה של iMGs המובדלים מתרבויות צעירות; תרביות שגילן עולה על 3 חודשים לא שימשו לניסויים פונקציונליים.

כדי לייעל את השלב הסופי של התמיינות המיקרוגליה מהפרוטוקולים המקוריים שתוארו לעיל 7,8, כללנו 100 ng/mL של אינטרלוקין (IL)-34,7 5 ng/mL של גורם גירוי מושבה 1 (M-CSF)10, ו-50 ng/mL של גורם גדילה-בטא (TGF-β) במדיום iMG. IL-34 ו-M-CSF מעוררים מסלולים תלויי קולטן CSF1 החיוניים לשמירה על גורל המיקרוגליהוהישרדותה 8, בעוד ש-TGF-β תומך בהומאוסטזיס של מיקרוגליה9, ובכך מקדם סביבה פיזיולוגית יותר למחויבות PMP לגורל המיקרוגליה. יש לציין כי כל תהליך ההבחנה המתואר כאן מבוצע בתנאים נטולי סרום, מה שמונע השפעות אפשריות של סרום על התנהגות iMG ושינויים ביישומים במורד הזרם. עבור ניסויים פונקציונליים עם iMGs, מומלץ לערוך ניסויים בין 10 ל 12 ימים של התמיינות מסוף. iMGs עברו תרבית במשך עד 14 יום עם הפחתה צנועה של כדאיות התאים, ולאחר מכן, בריאות התאים נפגעת באופן משמעותי.

מאחר שאחת הפונקציות הקנוניות של מיקרוגליה היא פאגוציטוזה, נכללה בפרוטוקול זה בדיקה לחקר הפעילות הפאגוציטית במבחנה . כדי לפתח מערכת מבוססת תאים אנושיים, נעשה שימוש בסינפטוזומים שמקורם ב-i3LMNs אנושיים. איכות הכנת הסינפטוזום הוערכה על ידי ניתוח כתמים מערביים של סמנים סינפטיים במחקר זה. בנוסף, תכונות מבניות ותפקודיות אחרות של הכנת הסינפטוזום יכולות להיחקר על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים או אימונוסטינינג לפני בדיקת הפאגוציטוזה. הפרוטוקול המתואר כאן להשגת סינפטוזומים אנושיים מסתמך במידה רבה על i3LMNs, המניבים מספר גבוה יחסית של נוירונים. עם זאת, סביר להניח שהתשואות העצביות יהיו נמוכות יותר כאשר משתמשים בשיטות התמיינות אחרות (כלומר, פרוטוקולים הדורשים קוקטיילים של מולקולות קטנות). יש לציין כי בדיקת הפאגוציטוזה יכולה להתבצע עם מצעים רבים אחרים כגון סינפטוזומים שמקורם במוח עכבר, חלבונים מצטברים או תאים מתים, אשר כולם יכולים להיות מסומנים בצבעים רגישים ל- pH כדי לנטר פאגוציטוזה באופן דומה. מוצע להשתמש בצבעים רגישים ל-pH מכיוון שהאות הפלואורסצנטי נפלט בעיקר כאשר הסינפטוזומים ממוקמים בתוך תאי חומצה במהלך עיבוד הפאגוזום והפירוק בליזוזומים21. מאפיין זה מפחית את אות הרקע מסינפטוזומים מחוץ לתאים ומקל על השימוש בשיטות אוטומטיות לכימות. בנוסף, צבעים רגישים ל-pH מאפשרים זיהוי של אירועי פאגוציטוזה אמיתיים, בניגוד להיצמדות המצע או עגינה על קרום התא.

בעוד שכאן מוצע להשתמש ב~35 מיקרוגרם של סינפטוזומים לכל באר, יש לייעל את הכמות הספציפית של סינפטוזומים אנושיים ומצעים אחרים, שכן התנאים האופטימליים תלויים בקו ה- iPSC ובתנאי הניסוי. טווח אידיאלי של סינפטוזומים אמור לגרום לתגובת מינון בבדיקת הפאגוציטוזה. יותר מדי סינפטוזומים יכולים להרוות את המערכת, מה שמקשה על זיהוי הבדלים משמעותיים כפונקציה של גנוטיפ או קבוצת טיפול. מעט מדי חומר יגרום לאות פלט חלש בבדיקה. מסיבה זו, מומלץ לבדוק ריכוזים מרובים של כל מצע כדי להקים מבחן עובד. בנוסף, חשוב לשמור על % ה-DMSO בטווח בטוח כדי לשמור על בריאות התאים.

בפרוטוקול זה, פאגוציטוזה הייתה מנוטרת באמצעות מערכת הדמיה של תאים חיים (Table of Materials) מכיוון שהיא מספקת מידע קינטי על יכולת ההצפה של התאים. מיקרוסקופים ומערכות הדמיה שיכולים לתמוך בהדמיה של תאים חיים ולשמור על טמפרטורה יציבה, לחות וריכוזי CO2 מתאימים גם הם לבדיקה זו. כל ניסויי הפאגוציטוזה שתוארו כאן צולמו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם לחות של 85%-95% ו-5% CO2. שיטות גילוי אחרות כגון הדמיה של תאים קבועים או ציטומטריה של זרימה יכולות לשמש גם להערכת פאגוציטוזה באמצעות אותם חומרים ופרוטוקולים של תרביות תאים (עד וכולל יצירת iMGs וסינפטוזומים מסומנים) כאשר הדמיה של תאים חיים אינה אפשרית או רצויה. באופן דומה, ניתן להשתמש בתוכנות קוד פתוח אחרות לניתוח נתונים כגון ImageJ או CellProfiler; זה האחרון יאפשר ניתוח אוטומטי דומה לתוכנה המשמשת כאן.

לסיכום, יישום פרוטוקול חזק להבדיל תאים דמויי מיקרוגליה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מודגם, ובכך להתגבר על המשאב המוגבל של מיקרוגליה אנושית. מיקרוגליה מובחנת יכולה לשמש למגוון יישומים בחקר מחלות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. יתר על כן, נכללת בדיקת פאגוציטוזה "אנושית" לחלוטין, אשר תסייע עוד יותר לחקר תפקוד המיקרוגליה ותפקוד לקוי בהקשר של התפתחות אנושית ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

המחברים מודים למייקל וורד על אספקת קו ה- iPSC של WTC11 hNIL להתמיינות נוירונים מוטוריים ולמעבדות ג'קסון על אספקת קו ה- KOLF2.1J WT clone B03 iPSC המשמש להבחנה במיקרוגליה. אנו מודים גם לדורותי שפר על תמיכתה במהלך יישום הפרוטוקולים, אנתוני גיאמפטרוצי וג'ון לנדרס על עזרתם במערכת ההדמיה של תאים חיים, כמו גם להיידן גאד על תרומתו הטכנית במהלך התיקונים ולג'ונתן יונג על שיתוף הפעולה שלו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי קרן דן ודיאן ריצ'יו למדעי המוח מבית הספר לרפואה UMASS Chan וקרן אנג'ל בע"מ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody Wako Chemical USA NC9288364 1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA014518 1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA051870 1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody Abcam ab6046 1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody Abclonal A6344 1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody Millipore MAB1596 1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM) Sigma B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (75 mM) Sigma  S7653
Sodium tetraborate (25 mM) Sigma 221732
Cell culture materials
6-well plates Greiner Bio-One 657160
40 μm Cell Strainers  Falcon 352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated CELLTREAT 229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile CELLTREAT 229305
low adherence round-bottom 96-well plate Corning 7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate Corning 353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate Corning 353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate Corning 353872
Cell dissociation reagents
Accutase  Corning 25058CI dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent Life Technologies 12-605-010 dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning™ 354230 Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521 STEMCELL Technology 77004 Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine Sigma P7405 Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine Sigma  P3655 Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus Kit STEMCELL Technology 100-0276 To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4 Fisher Scientific PHC9534 final concentration 50 ng/mL
iPSC media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 µM
SCF PeproTech 300-07 final concentration 20 ng/mL
VEGF PeproTech 100-20A final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15 Lonza 12001-988 final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-3 PeproTech 200-03 final concentration 25 ng/mL
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 100 ng/mL
PMP base media final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-34 PeproTech or Biologend 200-34 or 577904 final concentration 100 ng/mL
iMG base media final concentration 1x
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 5 ng/mL
TGF-β PeproTech 100-21 final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES Gibco 11330032 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E Calbiochem 565790 final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline Sigma D9891 final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401 final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03 The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific Pierce 23227
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 87793 Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent Invitrogen  R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester ThermoFisher Scientific  P36600 Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution AMRESCO INC K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 22144-77-0
BrdU Sigma B9285 Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D Sigma final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium Corning 21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12 Gibco 12660012 Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017015 Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge Eppendorf Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software Biotek version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake Benchmark refer as tube shaker
Water sonicator Elma Mode Transsonic 310

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Tags

מדעי המוח גיליון 186
תאים דמויי מיקרוגליה אנושית: התמיינות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ובדיקת פאגוציטוזה של תאים חיים <em>במבחנה</em> באמצעות סינפטוזומים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Funes, S., Bosco, D. A. Human… More

Funes, S., Bosco, D. A. Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (186), e64323, doi:10.3791/64323 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter