Summary
Модель, имитирующая клинический сценарий ожоговой травмы и инфекции, необходима для дальнейших исследований ожогов. Настоящий протокол демонстрирует простую и воспроизводимую модель ожоговой инфекции крыс, сравнимую с таковой у людей. Это облегчает изучение ожогов и инфекций после ожога для разработки новых местных методов лечения антибиотиками.
Abstract
Методики индукции ожогов непоследовательно описаны в моделях на крысах. Однородная модель ожоговой раны, представляющая клинический сценарий, необходима для проведения воспроизводимых ожоговых исследований. Настоящий протокол описывает простой и воспроизводимый способ получения ожогов на всю толщину с общей площадью поверхности тела (TBSA) ~20% у крыс. Здесь медный стержень размером 22,89 см2 (диаметр 5,4 см), нагретый до 97 ° C на водяной бане, был нанесен на поверхность кожи крысы, чтобы вызвать ожоговую травму. Медный стержень с высокой теплопроводностью был способен рассеивать тепло глубже в тканях кожи, создавая ожог на всю толщину. Гистологический анализ показывает ослабленный эпидермис с коагуляционным повреждением на всю толщину дермы и подкожной клетчатки. Кроме того, эта модель репрезентативна для клинических ситуаций, наблюдаемых у госпитализированных пациентов с ожогами после ожоговой травмы, такой как иммунная дисрегуляция и бактериальные инфекции. Модель может повторять системную бактериальную инфекцию как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями. В заключение, в этой статье представлена простая в освоении и надежная модель ожога крыс, которая имитирует клинические ситуации, включая иммунную дисрегуляцию и бактериальные инфекции, что имеет большое значение для разработки новых местных антибиотиков для лечения ожоговых ран и инфекций.
Introduction
Ожоговые травмы являются одними из самых разрушительных форм травм, при этом смертность достигает 12% даже в специализированных ожоговых центрах 1,2,3. Согласно недавно опубликованным отчетам, ~ 486 000 пациентов с ожогами ежегодно нуждаются в медицинской помощи в Соединенных Штатах, при этом почти 3 500 смертей 1,2,3,4,5,6. Ожоговая травма представляет собой серьезную проблему для иммунной системы пациентов и создает значительную открытую рану, которая медленно заживает, делая их восприимчивыми к кожной, легочной и системной колонизации нозокомиальными, условно-патогенными бактериями. Иммунная дисрегуляция в сочетании с бактериальной инфекцией связана с повышенной заболеваемостью и смертностью у ожоговых больных7.
Модель ожогов и инфекций животных имеет важное значение для изучения патогенеза бактериальных инфекций после повреждения кожи и подавления иммунитета, связанного с ожоговой травмой. Такие модели позволяют разрабатывать и оценивать новые методы лечения бактериальных инфекций у ожоговых больных. Крысы и люди имеют сходные физиологические и патологические характеристики кожи, которые были задокументированыранее 8. Кроме того, крысы меньше по размеру, что делает их более легкими в обращении, более доступными и простыми в приобретении и обслуживании, чем более крупные модели животных.
Эти характеристики делают крыс идеальным модельным животным для изучения ожогов и инфекций9. К сожалению, техника индукции ожога непоследовательна и часто минимально описана 10,11,12,13,14. Настоящий протокол предназначен для разработки простой, экономически эффективной и воспроизводимой процедуры для создания последовательной ожоговой травмы на всю толщину в модели крысы, которая имитирует клинический сценарий и может быть использована для оценки иммуносупрессии и бактериальной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Северной Каролины и проводились в соответствии с установленными им руководящими принципами. Для экспериментов использовали самцов и самок крыс Sprague Dawley (250-300 г) в возрасте 7-9 недель. Все животные были размещены в 12-часовом цикле свет-темнота со свободным доступом к пище и воде ad libitum. Всегда работайте со своим ветеринарным врачом над планом обезболивания до начала исследования.
1. Подготовка крыс к ожоговой травме
- Подготовьте животных к ожогу за 24 часа до ожога.
- Обезболивают крысу 5% изофлураном в 100% кислороде в индукционной камере в течение 5 мин (скорость потока: 2 л/мин) до тех пор, пока дыхание не замедлится.
- После того, как крыса будет глубоко анестезирована (не реагирует на защемление пальцев ног на всех конечностях), переместите крысу на грелку в положении лежа и уменьшите содержание изофлурана до 1,5% в кислороде для поддержания через носовой конус.
- Чтобы предотвратить высыхание роговицы после анестезии и во время процедуры, нанесите смазку для глаз на роговицу обоих глаз с помощью аппликатора с ватным наконечником.
- Побрейте спинную область крысы с помощью электрической машинки для стрижки (см. Таблицу материалов) и удалите как можно больше волос в большом прямоугольнике от лопаток до основания хвоста (рис. 2А).
- Очистите выбритый участок салфеткой, смоченной в физиологическом растворе, чтобы стереть выпавшие волоски. Нанесите лосьон для удаления волос на выбритый участок с помощью аппликатора с ватным наконечником и оставьте на ~ 3 минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение упомянутого лосьона для удаления волос более 3 минут вызовет красную сыпь на коже. - Дважды протрите область влажной марлевой губкой, чтобы удалить лосьон и предотвратить раздражение кожи.
- Выключите изофлуран, удалите носовой конус и поместите крысу в клетку для восстановления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите грелку в клетку для восстановления. - Переведите выздоровевшее животное в чистую клетку для ожоговой процедуры на следующий день (крысе может потребоваться ~ 10-15 минут, чтобы оправиться от анестезии).
2. Индуцирование ожоговой травмы у крыс
- В день ожога установите температуру водяной бани 97 °C и поместите все четыре медных стержня (по 420 г каждый; Рисунок 1) на водяной бане за 1 ч до обжига опыта, чтобы стержни равномерно прогрелись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удилища должны быть погружены в воду. Перед экспериментом проверьте точность цифрового отображения температуры с помощью термометра. - Обезболивайте крысу, как указано в разделе 1.
- Как только крыса перестает реагировать на ущипывание пальцев ног на всех конечностях, поместите ее на грелку в положении лежа с 1,5% изофлурана в кислороде для поддержания (рис. 2А).
- Вводят морфин (20 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно (внутривенно ) для обезболивания6.
- Проверьте температуру воды на водяной бане. Установите таймер и наденьте термостойкие перчатки.
- Выньте один нагретый медный стержень из водяной бани и прикоснитесь им к спинной области крысы в течение 7 с, чтобы вызвать ожог.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте минимальное расстояние (10-15 см) между водяной баней и животным, чтобы свести к минимуму потери тепла, и не давите на стержни, вызывая ожог (т. е. контакт должен поддерживаться силой тяжести). - Нанесите четыре ожога, используя по одному стержню на место ожога, один сразу за другим, чтобы получить примерно 20% полноконтактный ожог TBSA (рис. 2B).
- После ожога реанимировать животное путем внутривенного введения лактатного раствора Рингера (0,1 мл/г массы тела).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте раствор Рингера с регулируемой температурой тела, чтобы реанимировать крыс. - Выключите изофлуран, удалите носовой конус и поместите крысу на тепловой коврик для восстановления.
3. Подготовка бактериального посева и инфекции
- Проложите замороженный образец Pseudomonas aeruginosa PAO1 и Staphylococcus aureus ATCC25923 на планшетах Muller Hinton Agar (MHA) за 2 дня до эксперимента с ожогом.
- На следующий день выберите из тарелки одну колонию выросших бактерий и с помощью инокуляционной петли слегка соскребите ее с тарелки. Затем поместите его в культуральную пробирку, чтобы инокулировать 10 мл бульона Мюллера Хинтона (MHB) и культивировать в течение ночи при 37 ° C в шейкере инкубатора.
- В день ожога и инфицирования центрифугируют культуру при концентрации 4 000 × г в течение 5 мин. Промойте гранулы обычным физиологическим раствором (0,9% раствор NaCl).
- Ресуспендировать бактериальную гранулу в физиологическом растворе и разбавить до 0,1 OD 600 нм (оптическая плотность при600 нм ). Разбавьте бактериальный посевной материал, взяв 200 мкл этой бактериальной суспензии и смешав ее с 800 мкл физиологического раствора, чтобы получить желаемый бактериальный инокулят 2 × 107 КОЕ / мл.
- Через 15 минут после ожога введите 50 мкл инокулята P. aeruginosa или S. aureu, приготовленного на предыдущем этапе (доза инфекции 1 × 106 КОЕ), крысе, находящейся под наркозом, используя иглу 29 г подкожно как можно ближе к ожоговой ране.
- После инфицирования ожоговой раны поместите крысу на грелку для восстановления. Как только животное выздоровеет (~15-20 мин), поместите его в чистую клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: После ожога держите одну крысу в клетке. Используйте влажные гранулы корма для легкого жевания и положите их на пол клетки для легкого доступа. - Наполните бутылки с водой в клетке водой с морфином (0,4 мг / мл) для обезболивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пероральный морфин отражает клиническую ситуацию с пациентами с ожогами человека. В этом исследовании использовался пероральный морфин, чтобы эти эксперименты были сопоставимы с пациентами с человеческими ожогами после многочисленных консультаций с ветеринарным персоналом. Журналы питья и веса велись на протяжении всего эксперимента. Используйте одну и ту же питьевую систему во время всех процедур. Другие анальгетики, такие как бупренорфин, можно вводить подкожно/внутрибрюшинно в соответствии с рекомендациями по уходу за животными. - Заполните контрольный список мониторинга и внимательно следите за животными на предмет стресса или болезни в течение всего эксперимента.
4. Оценка ожоговой травмы
- Оцените ожоговую травму кожи морфологически с точки зрения цвета и края сразу после ожоговой травмы.
- Окрашивание обожженной кожи гематоксилином и эозином (H&E) для визуализации структуры ожоговой раны и эпителиального промежутка15 (см. шаг 5.6 для обработки образца).
5. Постобработка образцов крыс и перепись бактерий
- Усыпляют крысу через 24, 48 и 72 ч после ожога при передозировке анестезии.
- Возьмите образцы крови у крыс с помощью пункции сердца и соберите их в мини-пробирку.
- Проанализируйте общий анализ крови из образцов крови, чтобы определить влияние индукции ожога на иммунную систему хозяина.
- Собирайте кожу, подкожную клетчатку, мышцы, легкие и селезенку во время эвтаназии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте одну часть (~ 1 см × 1 см; вес ~ 200-300 мг) кожи для окрашивания H&E, а другую часть - для бактериального подсчета. - Соберите ткани в пробирку для сбора объемом 10 мл и поместите их в обычный физиологический раствор на льду для подсчета бактерий.
- Нормализуют массу ткани физиологическим раствором и гомогенизируют образцы с помощью тканевого гомогенизатора (см. Таблицу материалов).
- Последовательно разводят тканевые гомогенаты в физиологическом растворе.
- Планшет 100 мкл неразбавленного гомогената и все разведения каждого образца ткани на цетримидных агаровых пластинах для образцов, собранных у крыс, инфицированных P. aeruginosa.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины с маннитовым агаром для покрытия образцов, собранных у крыс, инфицированных S. aureus. - Инкубировать планшеты при 37 °C в инкубаторе в течение 16-18 ч.
- На следующий день подсчитайте бактериальные колонии на планшетах, умножьте на коэффициент разведения, чтобы получить количество КОЕ/мл, и нормализуйте с весом ткани, чтобы рассчитать КОЕ/г ткани.
- Используйте программное обеспечение для анализа данных, чтобы построить график количества бактерий в разных органах в разные моменты времени.
- Выполните окрашивание обожженной кожи H&E, чтобы визуализировать структуру раны и эпителиальный промежуток.
- С помощью ножниц и зубчатых щипцов отрежьте участок кожи размером 1 см х 1 см от области ожога и погрузите его в фиксатор (10% нейтральный буферный формалин, NBF) на 48 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкрутите контейнер, чтобы убедиться, что все ткани полностью погружены в фиксатор, при этом объем фиксатора в 30 раз превышает объем ткани. - Обезвоживание кожных тканей 70% (об./об.) этанола в течение 72 ч при комнатной температуре.
- Обработайте обезвоженные образцы в парафиновых блоках, чтобы разрезать срезы и окрасить H&E15.
- Оцифруйте окрашенные слайды в цифровом виде на сканере слайдов (см. Таблицу материалов) с помощью 40-кратного объектива.
- Проанализируйте отсканированное изображение с помощью программного обеспечения (см. Дополнительный файл 1 для обработки изображения для анализа; см. Таблицу материалов).
- Исследуйте все области окрашенного участка кожи, чтобы оценить состояние эпидермиса, дермы, подкожной клетчатки и скелетных мышц.
- С помощью ножниц и зубчатых щипцов отрежьте участок кожи размером 1 см х 1 см от области ожога и погрузите его в фиксатор (10% нейтральный буферный формалин, NBF) на 48 ч при комнатной температуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол обладает высокой воспроизводимостью и привел к ожоговой травме третьей степени на всю толщину у крыс. Ожоговая рана выглядит восково-белой после индукции ожога (рис. 2B). Цвет ожоговой травмы изменился с белого на коричневый в течение 72 часов после ожога (рис. 2B-E).
Гистологический анализ подтвердил ожог полной толщины (глубина >2,61 мм через 24 ч после ожога; Рисунок 3В). По сравнению с неповрежденной неожоговой кожей образцы кожи ожоговых животных показали признаки повреждения всех слоев через 24, 48 и 72 часа после ожоговой травмы (рис. 3). Кроме того, гистологический анализ показал полное разрушение эпидермального слоя и повреждение всей толщины дермы с вовлечением подкожно-жировой клетчатки и скелетных мышц (рис. 3Б).
Для оценки бактериального клиренса различные ткани собирали через 24, 48 и 72 часа после заражения P. aeruginosa и S. aureus. Бактерии были извлечены из места заражения для всех крыс с ожоговой травмой (рис. 4A, B). Кроме того, количество бактерий, извлеченных из кожи ожоговых крыс, было меньше, чем первоначальный инокулят для P. aeruginosa через 24 часа после заражения, тогда как образцы тканей, полученные через 48 и 72 часа после ожога и инфекции, показали увеличение бактериальной нагрузки (рис. 4A). Напротив, увеличение S. aureus в коже на 2 log10 наблюдалось во все моменты времени по сравнению с исходным инокулятом (рис. 4B). Это говорит о том, что S. aureus смог установить инфекцию из-за ее активной репликации в тканях, а не только из-за иммуносупрессии, вызванной ожоговой травмой.
Различные слои кожи (т.е. подкожная клетчатка, мышцы и дистальные органы) также были проанализированы для изучения распространения бактерий. Подкожная клетчатка и мышцы показали более высокую бактериальную нагрузку, чем легкие и селезенка. Взятые вместе, эти данные показывают, что у ожоговых крыс развивается системная инфекция через 24 или 48 часов после инокуляции раны P. aeruginosa (рис. 4A) или S. aureus соответственно (рис. 4B). Общий анализ крови также был получен с использованием гематологического анализатора (см. Таблицу материалов) на исходном уровне и через 72 часа после ожоговой травмы. Общее количество лейкоцитов со временем уменьшилось, что указывает на подавление иммунитета. Количество нейтрофилов снизилось после ожога, но увеличилось после инфекции через 72 часа по сравнению с исходным уровнем (таблица 1). Тем не менее, увеличение количества эритроцитов и тромбоцитов наблюдалось после ожога и инфекции, что указывает на системное воспаление.
Рисунок 1: Медный стержень, используемый для индукции ожога. Вес изготовленного по индивидуальному заказу удилища составляет 420 г при диаметре 5,4 см и высоте 6,4 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Макроскопический вид спинной стороны крысы до и после индукции ожога. (A) спина крысы после бритья, (B) сразу после ожога, (C) через 24 часа после ожога, (D) через 48 часов после ожога и (E) через 72 часа после ожога. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения поперечных сечений, окрашенных H&E, для каждого уровня тяжести ожога. (A) Гистология кожи фиктивной крысы показывает четкое различие между слоями эпидермиса, дермы и подкожной клетчатки. (B) Гистология кожи через 24 часа после ожога показывает ослабленный эпидермис с коагуляционным повреждением всей толщины дермы и подкожной клетчатки с максимальной глубиной ожога >2,61 мм. (C) Через 48 часов после ожога максимальная глубина ожога составила 2,35 мм, а (D) через 72 часа после ожога максимальная глубина ожога составила 2,20 мм. Изображения были отсканированы с 40-кратным увеличением. Масштабные линейки = 500 мкм (A-D). Аббревиатура: H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественная оценка бактериальной нагрузки в различных органах после инфицирования ожоговой раны. Крысы были инфицированы 6 log КОЕ бактерий путем подкожных инъекций через 15 мин после ожоговой травмы. Кожа, подкожная клетчатка, мышцы, легкие и селезенка были собраны через 24, 48 и 72 часа после заражения, чтобы определить прогрессирование системного заболевания. В каждый момент времени использовались три крысы. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Аббревиатура: КОЕ = колониеобразующие единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тип ячейки | Исходный уровень (среднее значение ± SD) | 72 ч Неинфицированные (в среднем ± SD) | 72 ч-Инфицированные (в среднем ± SD) |
| Лейкоциты (109/л) | 16.9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| Нейтрофилы (109/л); (%) | 4,0 ± 1,1; (24.3 ± 2.8) | 1,4 ± 0,4; (20.2 ± 5.7) | 1,88 ± 1,0; (35.0 ± 12.4) |
| Лимфоциты (109/л); (%) | 11,6 ± 4,1; (68.5 ± 1.7) | 4,8 ± 1,7; (66.5 ± 7.6) | 3,54 ± 3,9; (46.4 ± 17.0) |
| Моноциты (109/л); (%) | 0,9 ± 0,3; (5.4 ± 1.5) | 0,8 ± 0,2; (11.5 ± 1.6) | 1,0 ± 0,6; (17.3 ± 5.5) |
| Эритроциты (1012/л) | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| Гемоглобин (г/дл) | 14.3 ± 0.7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| Тромбоциты (109/л) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45.6 ± 3.0 | 39,9 ± 3,7 | 55.7 ± 8.2 |
Таблица 1: Гематологические показатели до и после нанесения ожога и инфекции. Аббревиатура: HCT = гематокрит.
Дополнительный файл 1: Шаги по анализу изображений H&E в Aperio ImageScope. Аббревиатура: H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изучения патофизиологии ожоговой травмыбыло представлено несколько моделей ожогов 8,12,16,17. В настоящем исследовании мы использовали модель крысы для разработки простого и воспроизводимого протокола, чтобы вызвать ожог на всю толщину с последующей бактериальной инфекцией, чтобы имитировать инфицированную ожоговую травму у пациентов. Выбор крысы в качестве модели животного для имитации условий жизни человека основан на балансе стоимости, простоты использования, воспроизводимости и надежности данных. Модель крысы, используемая здесь, имеет много преимуществ по сравнению с другими: она проста в обращении и является наиболее часто используемой моделью ожога, что позволяет проводить сравнения в литературе. Несмотря на то, что крыса широко используется в экспериментальных условиях, кожные покровы крысы и человека гистологически не идентичны18,19. Покровы крысы состоят из кожи, жирового слоя, известного как panniculus adiposus, а под этим слоем находится оболочка из рыхлой соединительной ткани, связанной с белой жировой тканью и гладкими мышцами, образующими слой, известный как panniculus carnosus. Последний слой отсутствует в большей части кожных покровов человека. Это важно, так как его гладкомышечные клетки способствуют быстрому и обильному сокращению раны20. Кроме того, следует отметить, что механизмы заживления ран у крыс существенно отличаются от механизмов заживления ран у людей8. Следовательно, исследователи должны иметь это в виду при интерпретации результатов протокола, описанного в этой статье. Тем не менее, полезность модели крыс для изучения локализованных ожоговых травм и послеожогового сепсиса неоспорима и дала обильные данные, которые являются клинически надежными и передаваемыми21. Кроме того, крысы имеют большую площадь поверхности по сравнению с другими мелкими животными, что позволяет индукция относительно больших ожоговых ран, что делает его хорошей моделью для клинически значимых ожоговых исследований.
Были опубликованы различные методы индукции горения, включая кипящую воду16, нагретый латунный стержень 22, нагретый алюминиевый шаблон17, горячую плиту с постоянной температурой, размещенную над стержнями23 из нержавеющей стали, и ошпаривание более 45% поверхности24 тела. Идеальный экспериментальный протокол был бы способен получить ожоговые раны, которые одинаковы по размеру и глубине. В настоящем исследовании 420 г медных стержней, нагретых в воде при 97 ° C, использовали для передачи тепла через прямую проводимость, чтобы вызвать ожог. Во время индукции ожога стержни непосредственно касались поверхности кожи без какого-либо внешнего давления, так как проводимость тепловой энергии от твердой структуры к поверхности кожи зависит не от применяемого давления, а скорее от температурного градиента 25 и расстояния между твердой структурой и кожей17,25. К факторам, определившим выбор металла, относились теплопроводность и способность противостоять ржавчине и коррозии.
Медь обладает высокой теплопроводностью (398 Вт/мК; где W — тепло в ваттах, m — площадь в метрах, K — температура в кельвинах) по сравнению с нержавеющей сталью, алюминием или латунью с 16 Вт/мК, 225 Вт/мК и 109 Вт/мК соответственно9. Металлические стержни с высокой теплопроводностью будут быстрее рассеивать тепловую энергию к тканям кожи, чем стержни с низкой теплопроводностью, и вызывать более глубокий уровень ожога в течение той же продолжительности воздействия. Кроме того, размер и вес стержня были аллометрически масштабированы по модели ожога у мышей 7,26,27 и вызывают примерно 20% ожог TBSA. Стержень диаметром 1,9 см (общая площадь ожога составляет 11,3 см2 у мыши после четырех применений) был масштабирован до диаметра 5,4 см (общая площадь ожога составляет 91,6 см2 у крысы после четырех применений), чтобы вызвать аналогичный ожог ~ 20% -30% TBSA у крысы (TBSA крысы весом 220 г составляет 356,0 см 2)28, учитывая, что TBSA крысы в 6 раз больше, чем мыши (TBSA мыши весом 20 г составляет 61,2 см2)29. Результаты ясно показывают, что этот метод вызывал ожог на всю толщину, а гистологический анализ показал отличный контраст между нормальными и обожженными тканями кожи в разные моменты времени после ожога (рис. 3). Эта модель также смогла зафиксировать иммуносупрессию, которая наблюдается у пациентов после ожоговой травмы30,31 (табл. 1).
Бактериальные инфекции представляют собой серьезную угрозу, которая ставит под угрозу процесс заживления ожоговых пациентов и часто является основной причиной заболеваемости и смертности после ожоговых травм. Чтобы имитировать подобные условия, крыса была инфицирована после ожога P. aeruginosa или S. aureus. Первоначально мы пробовали местное применение бактерий, но восковой вид поверхности ожога препятствовал поглощению бактериального инокулята. Эта модель также смогла повторить системное прогрессирование заболевания после бактериальной инфекции места ожога, как видно из бактериальной нагрузки, извлеченной из легких и селезенки (рис. 4). В заключение мы продемонстрировали простой и воспроизводимый метод создания ожогов на всю толщину, которые проявляют многие особенности, наблюдаемые при ожоговых травмах человека. Этот протокол может помочь в изучении широкого спектра новых местных терапевтических средств для лечения инфицированных ожоговых ран. Эта модель также может быть использована в качестве экономически эффективной модели для оценки различных раневых повязок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Отдел сравнительной медицины Университета Северной Каролины за предоставление и уход за животными. Мы благодарим Лорен Ральф и Мию Евангелисту из Pathology Services Core за экспертную техническую помощь в области гистопатологии / цифровой патологии, включая срезы тканей и визуализацию. Это исследование было поддержано исследовательским грантом Министерства обороны (номер награды W81XWH-20-1-0500, GR и TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
