Summary
Un modèle imitant le scénario clinique des brûlures et des infections est nécessaire pour faire avancer la recherche sur les brûlures. Le présent protocole démontre un modèle simple et reproductible d’infection par brûlure chez le rat, comparable à celui de l’homme. Cela facilite l’étude des brûlures et des infections après brûlure pour le développement de nouveaux traitements antibiotiques topiques.
Abstract
Les méthodologies d’induction des brûlures ne sont pas décrites de manière cohérente dans les modèles de rats. Un modèle uniforme de brûlure, qui représente le scénario clinique, est nécessaire pour effectuer des recherches reproductibles sur les brûlures. Le présent protocole décrit une méthode simple et reproductible pour créer des brûlures de toute épaisseur de ~20% de la surface corporelle totale (TBSA) chez les rats. Ici, une tige de cuivre de 22,89 cm2 (5,4 cm de diamètre) chauffée à 97 °C dans un bain-marie a été appliquée sur la surface de la peau du rat pour provoquer la brûlure. Une tige de cuivre avec une conductivité thermique élevée a pu dissiper la chaleur plus profondément dans le tissu cutané pour créer une brûlure de pleine épaisseur. L’analyse histologique montre un épiderme atténué avec des dommages coagulatifs à toute l’épaisseur du derme et du tissu sous-cutané. De plus, ce modèle est représentatif des situations cliniques observées chez les patients hospitalisés souffrant de brûlures à la suite de brûlures telles qu’une dysrégulation immunitaire et des infections bactériennes. Le modèle peut récapituler l’infection bactérienne systémique par les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. En conclusion, cet article présente un modèle de brûlure de rat robuste et facile à apprendre qui imite les situations cliniques, y compris la dysrégulation immunitaire et les infections bactériennes, ce qui est d’une utilité considérable pour le développement de nouveaux antibiotiques topiques pour les brûlures et les infections.
Introduction
Les brûlures sont parmi les formes de traumatisme les plus dévastatrices, avec des taux de mortalité atteignant 12%, même dans les centres spécialisésdans les grands brûlés 1,2,3. Selon des rapports récemment publiés, ~ 486 000 patients brûlés nécessitent des soins médicaux chaque année aux États-Unis, avec près de 3 500 décès 1,2,3,4,5,6. Les brûlures constituent un défi majeur pour le système immunitaire des patients et créent une plaie ouverte importante, qui est lente à guérir, les laissant vulnérables à la colonisation cutanée, pulmonaire et systémique par des bactéries nosocomiales et opportunistes. La dérégulation immunitaire combinée à l’infection bactérienne est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les patients brûlés7.
Un modèle de brûlure et d’infection animale est essentiel pour étudier la pathogenèse des infections bactériennes à la suite de lésions cutanées et d’une suppression immunitaire associée à un traumatisme par brûlure. De tels modèles permettent la conception et l’évaluation de nouvelles méthodes de traitement des infections bactériennes chez les patients brûlés. Les rats et les humains partagent des caractéristiques physiologiques et pathologiques cutanées similaires qui ont été précédemment documentées8. De plus, les rats sont de plus petite taille, ce qui les rend plus faciles à manipuler, plus abordables et plus faciles à se procurer et à entretenir que les modèles animaux plus grands.
Ces caractéristiques font des rats un animal modèle idéal pour étudier les brûlures et les infections9. Malheureusement, la technique d’induction des brûlures est incohérente et souvent décrite de manière minimale10,11,12,13,14. Le présent protocole est conçu pour mettre au point une procédure simple, rentable et reproductible pour créer une brûlure constante sur toute l’épaisseur dans un modèle de rat qui simule le scénario clinique et peut être utilisé pour évaluer l’immunosuppression et l’infection bactérienne.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord et ont été menées conformément à ses lignes directrices établies. Des rats Sprague Dawley mâles et femelles (250-300 g) âgés de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour les expériences. Tous les animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 h:12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau ad libitum. Travaillez toujours avec votre vétérinaire institutionnel au sujet d’un plan analgésique avant le début de l’étude.
1. Préparer les rats à la brûlure
- Préparez les animaux aux brûlures 24 heures avant la brûlure.
- Anesthésier le rat avec 5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène dans une chambre d’induction pendant 5 min (débit: 2 L / min) jusqu’à ce que la respiration ait ralenti.
- Une fois que le rat est profondément anesthésié (ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres), déplacez le rat vers un coussin chauffant en position couchée et réduisez l’isoflurane à 1,5% en oxygène pour le maintien par un cône nasal.
- Pour éviter le séchage de la cornée après l’anesthésie et pendant la procédure, appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les cornées des deux yeux à l’aide d’un applicateur à embout de coton.
- Rasez la région dorsale du rat à l’aide d’une tondeuse électrique (voir le tableau des matériaux) et enlevez autant de poils que possible dans un grand rectangle des omoplates jusqu’à la base de la queue (figure 2A).
- Nettoyez la zone rasée avec un mouchoir imbibé de solution saline pour essuyer les poils lâches. Appliquez la lotion dépilatoire sur la zone rasée à l’aide d’un applicateur à embout de coton et laissez-la agir pendant ~3 min.
REMARQUE: L’application de la lotion d’épilation référencée pendant plus de 3 minutes induira des éruptions cutanées rouges sur la peau. - Essuyez la zone avec une éponge de gaze humide deux fois pour enlever la lotion et prévenir l’irritation de la peau.
- Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat dans la cage de récupération.
REMARQUE: Placez un coussin chauffant dans la cage de récupération. - Transférez l’animal récupéré dans une cage de logement propre pour la procédure de brûlure du lendemain (cela peut prendre ~ 10-15 minutes pour que le rat se remette de l’anesthésie).
2. Provoquer la brûlure chez le rat
- Le jour de la combustion, régler la température du bain-marie à 97 °C et placer les quatre tiges de cuivre (420 g chacune; Graphique 1) Au bain-marie 1 h avant l’expérience de brûlure pour laisser les tiges se réchauffer uniformément.
NOTE: Les tiges doivent être immergées dans l’eau. Vérifiez la précision de l’affichage numérique de la température à l’aide d’un thermomètre avant l’expérience. - Anesthésiez le rat comme mentionné à la section 1.
- Une fois que le rat ne répond pas au pincement des orteils sur tous les membres, placez-le sur un coussin chauffant en position couchée avec 1,5 % d’isoflurane dans de l’oxygène pour l’entretien (figure 2A).
- Injecter de la morphine (20 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale (i.p.) pour la gestion de la douleur6.
- Vérifiez la température de l’eau dans le bain-marie. Réglez la minuterie et mettez les gants résistants à la chaleur.
- Retirez une tige de cuivre chauffée du bain-marie et touchez-la sur la région dorsale du rat pendant 7 s pour provoquer la brûlure.
REMARQUE : Gardez une distance minimale (10-15 cm) entre le bain-marie et l’animal pour minimiser les pertes de chaleur et ne mettez pas de pression sur les tiges tout en provoquant la brûlure (c.-à-d. que le contact doit être maintenu par gravité). - Appliquer quatre brûlures, en utilisant une tige par site de brûlure, l’une immédiatement après l’autre pour produire une brûlure TBSA de contact complet d’environ 20 % (figure 2B).
- Après la brûlure, réanimer l’animal par injection intraveineuse de solution de Ringer lactée (0,1 mL/g de poids corporel).
REMARQUE : Utilisez une solution de sonnerie lactée ajustée à la température corporelle pour réanimer les rats. - Éteignez l’isoflurane, retirez le cône nasal et placez le rat sur le tapis chauffant pour le récupérer.
3. Préparation de l’inoculum bactérien et de l’infection
- Étaler l’échantillon congelé de Pseudomonas aeruginosa PAO1 et Staphylococcus aureus ATCC25923 sur des plaques de gélose Muller Hinton (MHA), 2 jours avant l’expérience de brûlure.
- Le lendemain, choisissez une seule colonie de bactéries cultivées dans l’assiette et, à l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez-la légèrement de l’assiette. Ensuite, placez-le dans le tube de culture pour inoculer 10 ml de bouillon Muller Hinton (MHB) et cultivez-le pendant la nuit à 37 °C dans un agitateur d’incubateur.
- Le jour de la brûlure et de l’infection, centrifuger la culture à 4 000 × g pendant 5 min. Laver la pastille avec une solution saline normale (solution de NaCl à 0,9%).
- Resuspendre la pastille bactérienne dans une solution saline et diluer jusqu’à 0,1 OD 600nm (densité optique à600 nm ). Diluer l’inoculum bactérien en prenant 200 μL de cette suspension bactérienne et en le mélangeant avec 800 μL de solution saline pour obtenir l’inoculum bactérien désiré de 2 × 107 UFC/mL.
- Injecter 50 μL d’inoculum de P. aeruginosa ou de S. aureupréparé à l’étape précédente (dose d’infection 1 × 106 UFC) dans le rat anesthésié 15 min après la brûlure, à l’aide d’une aiguille de 29 G par voie sous-cutanée aussi près que possible de la plaie brûlée.
- Après avoir infecté la brûlure, placez le rat sur le coussin chauffant pour la récupération. Une fois que l’animal a récupéré (~15-20 min), logez-le dans une cage propre.
REMARQUE: Après la brûlure, logez un rat par cage. Utilisez des granulés de nourriture humide à l’eau pour faciliter la mastication et placez-les sur le sol de la cage pour une portée facile. - Remplissez les bouteilles d’eau dans la cage avec de l’eau enrichie de morphine (0,4 mg/mL) pour la gestion de la douleur.
REMARQUE: La morphine orale reflète la situation clinique chez les patients brûlés humains. Cette étude a utilisé de la morphine orale pour garder ces expériences comparables aux patients brûlés humains après avoir consulté le personnel vétérinaire à de nombreuses reprises. Les journaux de consommation d’alcool et de poids ont été maintenus tout au long de l’expérience. Utilisez le même système de consommation pendant toutes les procédures. D’autres analgésiques, comme la buprénorphine, peuvent être administrés par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale, conformément aux lignes directrices institutionnelles en matière de soins aux animaux. - Remplissez la liste de contrôle de surveillance et surveillez étroitement les animaux pour détecter toute détresse ou maladie pendant toute la durée de l’expérience.
4. Évaluation de la brûlure
- Évaluez morphologiquement la brûlure cutanée en termes de couleur et de marge immédiatement après la brûlure.
- Colorer la peau brûlée avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) pour visualiser la structure de la plaie de brûlure et l’espace épithélial15 (voir l’étape 5.6 pour le traitement des échantillons).
5. Post-traitement des échantillons de rats et dénombrement des bactéries
- Euthanasier le rat à 24, 48 et 72 h après la brûlure avec une surdose d’anesthésie.
- Prélever des échantillons de sang sur les rats par ponction cardiaque et les recueillir dans un mini tube de prélèvement.
- Analyser la numération globulaire complète des échantillons de sang pour déterminer l’effet de l’induction de brûlures sur le système immunitaire de l’hôte.
- Prélever la peau, le tissu sous-cutané, les muscles, les poumons et la rate au moment de l’euthanasie.
REMARQUE: Conservez une partie (~ 1 cm × 1 cm; pesant ~ 200-300 mg) de la peau pour la coloration H & E et une autre partie pour le dénombrement bactérien. - Prélever les tissus dans un tube de prélèvement de 10 ml et les placer dans une solution saline normale sur de la glace pour le dénombrement bactérien.
- Normaliser le poids des tissus avec une solution saline normale et homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire (voir le tableau des matériaux).
- Diluer en série les homogénats tissulaires dans une solution saline normale.
- Plaque 100 μL d’homogénat non dilué et toutes les dilutions de chaque échantillon de tissu sur des plaques de gélose au cétrimide pour les échantillons prélevés sur des rats infectés par P. aeruginosa.
REMARQUE : Utiliser des plaques de gélose au mannitol pour plaquer des échantillons prélevés sur des rats infectés par S. aureus. - Incuber les plaques à 37 °C dans un incubateur pendant 16-18 h.
- Le lendemain, comptez les colonies bactériennes sur les plaques, multipliez par le taux de dilution pour obtenir le nombre d’UFC/mL et normalisez avec le poids du tissu pour calculer le tissu UFC/g.
- Utiliser un logiciel d’analyse de données pour tracer le nombre de bactéries dans différents organes aux différents points de temps d’échantillonnage.
- Effectuer une coloration H & E de la peau brûlée pour visualiser la structure de la plaie et l’espace épithélial.
- À l’aide de ciseaux et de pinces dentées, couper un patch cutané de 1 cm x 1 cm de la zone brûlée et l’immerger dans un fixateur (formol tamponné neutre à 10 %, FBN) pendant 48 h à température ambiante.
REMARQUE: Remuez le récipient pour vous assurer que tous les tissus sont complètement immergés dans le fixateur, le volume du fixateur étant 30 fois supérieur au volume tissulaire. - Déshydrater le tissu cutané avec de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 72 h à température ambiante.
- Traiter les échantillons déshydratés dans des blocs de paraffine pour couper les sections et colorer avec H&E15.
- Imagez numériquement les diapositives colorées dans un scanner de diapositives (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif 40x.
- Analysez l’image numérisée à l’aide d’un logiciel (voir le fichier supplémentaire 1 pour le traitement de l’image à analyser; voir le tableau des matériaux).
- Examinez tous les champs de la section de la peau tachée pour évaluer l’état de l’épiderme, du derme, du tissu sous-cutané et du muscle squelettique.
- À l’aide de ciseaux et de pinces dentées, couper un patch cutané de 1 cm x 1 cm de la zone brûlée et l’immerger dans un fixateur (formol tamponné neutre à 10 %, FBN) pendant 48 h à température ambiante.
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Representative Results
Le protocole présenté ici est hautement reproductible et a entraîné une brûlure au troisième degré de pleine épaisseur chez les rats. La plaie de brûlure apparaît blanc cireux après induction de la brûlure (Figure 2B). La couleur de la brûlure est passée du blanc au brun au cours des 72 heures suivant la brûlure (figure 2B-E).
L’analyse histologique a confirmé une combustion sur toute l’épaisseur (profondeur >2,61 mm à 24 heures après la combustion; Figure 3B). Par rapport à la peau intacte non brûlée, les échantillons de peau d’animaux brûlés ont montré des signes de blessures dans toutes les couches à 24, 48 et 72 heures après la brûlure (Figure 3). De plus, l’analyse histologique a montré une destruction complète de la couche épidermique et des dommages à toute l’épaisseur du derme avec implication de la graisse sous-cutanée et du muscle squelettique (Figure 3B).
Pour évaluer la clairance bactérienne, divers tissus ont été prélevés à 24, 48 et 72 heures après l’infection par P. aeruginosa et S. aureus. Des bactéries ont été récupérées au site d’infection pour tous les rats brûlés (figure 4A,B). De plus, le nombre de bactéries récupérées dans la peau de rats brûlés était inférieur à l’inoculum initial pour P. aeruginosa 24 heures après l’infection, tandis que les échantillons de tissus prélevés 48 et 72 heures après la brûlure et l’infection ont montré une augmentation de la charge bactérienne (figure 4A). En revanche, une augmentation de 2 log10 a été observée à tous les points temporels de S. aureus dans la peau par rapport à l’inoculum initial (figure 4B). Cela suggère que S. aureus a pu établir l’infection en raison de sa réplication active dans les tissus et pas seulement en raison de l’immunosuppression induite par la brûlure.
Différentes couches de la peau (c.-à-d. le tissu sous-cutané, les muscles et les organes distaux) ont également été analysées pour examiner la dissémination bactérienne. Le tissu sous-cutané et les muscles présentaient une charge bactérienne plus élevée que le poumon et la rate. Prises ensemble, ces données montrent que les rats brûlés développent une infection systémique 24 h ou 48 h après l’inoculation de la plaie avec P. aeruginosa (figure 4A) ou S. aureus, respectivement (figure 4B). Des numérations globulaires complètes ont également été obtenues à l’aide d’un analyseur hématologique (voir le tableau des matières) au départ et 72 heures après une brûlure. Le nombre total de globules blancs a diminué au fil du temps, ce qui indique une immunosuppression. Le nombre de neutrophiles a diminué après la brûlure, mais a augmenté après l’infection à 72 heures par rapport à la ligne de base (tableau 1). Cependant, une augmentation du nombre de globules rouges et de plaquettes a été observée après une brûlure et une infection, indiquant une inflammation systémique.
Figure 1 : Tige de cuivre utilisée pour infliger l’induction de brûlures. Le poids de la tige sur mesure est de 420 g avec un diamètre de 5,4 cm et une hauteur de 6,4 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vue macroscopique de la face dorsale du rat avant et après induction de la brûlure. (A) Rat dorsum après rasage, (B) immédiatement après la brûlure, (C) 24 h après la brûlure, (D) 48 h après la brûlure, et (E) 72 h après la brûlure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives des coupes transversales colorées au H&E pour chaque niveau de gravité de la brûlure. (A) L’histologie de la peau de rat simulée montre une distinction claire entre l’épiderme, le derme et les couches de tissus sous-cutanés. (B) L’histologie de la peau 24 h après la brûlure montre un épiderme atténué avec des dommages coagulatifs sur toute l’épaisseur du derme et du tissu sous-cutané avec une profondeur de brûlure maximale de >2,61 mm. (C) À 48 heures après la combustion, la profondeur maximale de combustion était de 2,35 mm, et (D) à 72 h après la combustion, la profondeur maximale de combustion était de 2,20 mm. Les images ont été numérisées à un grossissement de 40x. Barres d’échelle = 500 μm (A-D). Abréviation : H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Quantification de la charge bactérienne dans différents organes après infection de la plaie brûlée. Les rats ont été infectés par 6 log UFC de la bactérie par injections sous-cutanées 15 minutes après la brûlure. La peau, les tissus sous-cutanés, les muscles, les poumons et la rate ont été prélevés 24, 48 et 72 heures après l’infection pour déterminer la progression de la maladie systémique. Trois rats ont été utilisés à chaque point temporel. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Abréviation : UFC = unités formant colonies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Type de cellule | Base de référence (moyenne ± écart-type) | 72 h Non infecté (moyenne ± écart-type) | 72 h infectés (moyenne ± écart-type) |
| Globules blancs (109/L) | 16,9 ± 4,9 | 7,1 ± 2,0 | 6,50 ± 5,5 |
| neutrophiles (109/L); (%) | 4,0 ± 1,1; (24,3 ± 2,8) | 1,4 ± 0,4; (20,2 ± 5,7) | 1,88 ± 1,0; (35,0 ± 12,4) |
| lymphocytes (109/L); (%) | 11,6 ± 4,1; (68,5 ± 1,7) | 4,8 ± 1,7; (66,5 ± 7,6) | 3,54 ± 3,9; (46,4 ± 17,0) |
| Monocytes (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5,4 ± 1,5) | 0,8 ± 0,2; (11,5 ± 1,6) | 1,0 ± 0,6; (17,3 ± 5,5) |
| Globules rouges (1012/L) | 7,5 ± 0,3 | 7,1 ± 0,8 | 10,0 ± 1,1 |
| Hémoglobine (g/dL) | 14,3 ± 0,7 | 13,4 ± 1,0 | 18,6 ± 2,0 |
| Plaquettes (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tableau 1 : Paramètres hématologiques avant et après l’infliction de brûlures et l’infection. Abréviation : HCT = hématocrite.
Fichier supplémentaire 1 : Étapes d’analyse des images H&E dans Aperio ImageScope. Abréviation : H&E = hématoxyline et éosine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Plusieurs modèles de brûlures ont été présentés pour étudier la physiopathologie des brûlures 8,12,16,17. Dans la présente étude, nous avons utilisé un modèle de rat pour développer un protocole simple et reproductible pour induire une brûlure de pleine épaisseur suivie d’une infection bactérienne pour simuler un traumatisme de brûlure infecté chez les patients. Le choix du rat comme modèle animal pour imiter les conditions humaines est basé sur un équilibre entre le coût, la facilité d’utilisation, la reproductibilité et la fiabilité des données. Le modèle de rat utilisé ici présente de nombreux avantages par rapport aux autres : il est facile à manipuler et est le modèle de brûlure le plus couramment utilisé, ce qui permet des comparaisons dans la littérature. Bien que le rat soit largement utilisé dans le cadre expérimental, les téguments du rat et de l’homme ne sont pas histologiquement identiques18,19. Le tégument du rat est composé de la peau, une couche graisseuse connue sous le nom de panniculus adiposus, et sous cette couche se trouve une gaine de tissu conjonctif lâche associée à du tissu adipeux blanc et à un muscle lisse formant une couche connue sous le nom de panniculus carnosus. Cette dernière couche est absente dans la majeure partie du tégument humain. Ceci est important, car ses cellules musculaires lisses favorisent une contraction rapide et ample de la plaie20. De plus, il faut noter que les mécanismes de cicatrisation des plaies des rats sont sensiblement différents de ceux des humains8. Par conséquent, les chercheurs devraient garder cela à l’esprit lorsqu’ils interprètent les résultats du protocole décrit dans cet article. Néanmoins, l’utilité du modèle du rat pour étudier les brûlures localisées et la septicémie post-brûlure est incontestable et a produit de nombreuses données cliniquement fiables et transférables21. De plus, les rats ont plus de surface que les autres petits animaux, ce qui permet l’induction de brûlures relativement plus grandes, ce qui en fait un bon modèle pour les études de brûlures cliniquement pertinentes.
Différentes méthodes d’induction de combustion ont été publiées, y compris l’eau bouillante16, la barre de laiton chauffée 22, le gabarit en aluminium chauffé17, une plaque chauffante à température constante placée sur des tiges en acier inoxydable23 et l’échaudage sur 45% de la surface du corps24. Un protocole expérimental idéal aurait la capacité d’obtenir des brûlures de taille et de profondeur constantes. Dans la présente étude, 420 g de tiges de cuivre chauffées dans de l’eau à 97 °C ont été utilisées pour transférer la chaleur par conductance directe afin d’induire la brûlure. Lors de l’induction de la brûlure, les bâtonnets ont été directement touchés à la surface de la peau sans appliquer de pression externe, car la conductance d’énergie thermique d’une structure solide à une surface de peau ne dépend pas de la pression employée mais plutôt du gradient de température 25 et de la distance entre la structure solide et la peau17,25. Les facteurs qui ont déterminé le choix du métal comprenaient la conductivité thermique et la capacité de résister à la rouille et à la corrosion.
Le cuivre a une conductivité thermique élevée (398 W / mK; où W est la chaleur en watts, m est la surface en mètres, K est la température en kelvin) par rapport à l’acier inoxydable, l’aluminium ou le laiton avec 16 W / mK, 225 W / mK et 109 W / mK, respectivement9. Les tiges métalliques à haute conductivité thermique dissiperaient l’énergie thermique plus rapidement dans les tissus cutanés que les tiges à faible conductivité thermique et induiraient un niveau de brûlure plus profond dans la même durée d’exposition. De plus, la taille et le poids de la tige ont été mis à l’échelle allométriquement à partir du modèle de brûlure chez les souris 7,26,27 et induisent une combustion TBSA d’environ 20%. Une tige de 1,9 cm de diamètre (la surface de combustion totale est de 11,3 cm2 chez une souris après quatre applications) a été mise à l’échelle à 5,4 cm de diamètre (la surface de combustion totale est de 91,6 cm2 chez un rat après quatre applications) pour induire une combustion similaire de ~20%-30% TBSA chez le rat (TBSA d’un rat de 220 g est de 356,0 cm 2)28, considérant que le TBSA du rat est 6x plus grand que celui de la souris (TBSA d’une souris de 20 g mesure 61,2 cm2)29. Les résultats démontrent clairement que cette méthode induisait une brûlure sur toute l’épaisseur, et l’analyse histologique a indiqué un excellent contraste entre les tissus cutanés normaux et brûlés à différents moments après la brûlure (Figure 3). Ce modèle a également permis de capturer l’immunosuppression, ce qui est observé chez les patients après une brûlure30,31 (tableau 1).
Les infections bactériennes sont une menace importante qui compromet le processus de guérison des patients brûlés et sont souvent la principale cause de morbidité et de mortalité après des brûlures. Pour simuler des conditions similaires, le rat a été infecté à la suite d’une brûlure avec P. aeruginosa ou S. aureus. Initialement, nous avons essayé l’application topique de la bactérie, mais l’aspect cireux de la surface brûlée a inhibé l’absorption de l’inoculum bactérien. Ce modèle a également permis de récapituler la progression systémique de la maladie à la suite d’une infection bactérienne du site de la brûlure, comme on l’a vu avec la charge bactérienne récupérée dans les poumons et la rate (Figure 4). En conclusion, nous avons démontré une méthode simple et reproductible pour créer des brûlures de pleine épaisseur qui présentent bon nombre des caractéristiques observées dans les brûlures humaines. Ce protocole peut aider à étudier une grande variété de nouveaux traitements topiques pour le traitement des brûlures infectées. Ce modèle peut également être utilisé comme modèle rentable pour évaluer différents pansements.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient la Division de médecine comparée de l’Université de Caroline du Nord pour la fourniture et les soins des animaux. Nous remercions Lauren Ralph et Mia Evangelista du noyau des services de pathologie pour leur assistance technique spécialisée en histopathologie / pathologie numérique, y compris la coupe tissulaire et l’imagerie. Cette recherche a été financée par une subvention de recherche du ministère de la Défense (numéro d’attribution W81XWH-20-1-0500, GR et TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
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