Summary
מודל המחקה את התרחיש הקליני של פגיעה בכוויות וזיהום נחוץ לקידום מחקר הכוויות. הפרוטוקול הנוכחי מדגים מודל פשוט וניתן לשחזור של זיהום כוויות חולדות הדומה לזה שבבני אדם. זה מקל על המחקר של כוויות וזיהומים לאחר כוויה לפיתוח טיפולים אנטיביוטיים מקומיים חדשים.
Abstract
מתודולוגיות השראת שריפה מתוארות באופן לא עקבי במודלים של חולדות. מודל אחיד של פצעי כוויה, המייצג את התרחיש הקליני, נחוץ לביצוע מחקר כוויות הניתן לשחזור. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה וניתנת לשחזור ליצירת ~20% כוויות בעובי מלא של שטח הגוף הכולל (TBSA) בחולדות. כאן, מוט נחושת בקוטר 22.89 ס"מ 2 (5.4ס" מ) שחומם ב 97 מעלות צלזיוס באמבט מים הוחל על פני העור של החולדה כדי לגרום לפציעת הכוויה. מוט נחושת בעל מוליכות תרמית גבוהה הצליח לפזר את החום עמוק יותר ברקמת העור וליצור כוויה בעובי מלא. ניתוח היסטולוגיה מראה אפידרמיס מוחלש עם נזק קוגולטיבי להיקף עובי מלא של הדרמיס והרקמה התת עורית. בנוסף, מודל זה מייצג את המצבים הקליניים שנצפו בחולי כוויות מאושפזים לאחר פגיעה בכוויות כגון חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים. המודל יכול לשחזר את הזיהום החיידקי המערכתי הן על ידי חיידקים גראם-חיוביים והן על ידי חיידקים גראם-שליליים. לסיכום, מאמר זה מציג מודל קל ללמידה וחזק של כוויות חולדות המחקה את המצבים הקליניים, כולל חוסר ויסות חיסוני וזיהומים חיידקיים, אשר מועיל רבות לפיתוח תרופות אנטיביוטיות מקומיות חדשות לפצעי כוויות וזיהומים.
Introduction
פציעות כוויות הן בין צורות הטראומה ההרסניות ביותר, כאשר שיעורי התמותה מגיעים ל -12% אפילו במרכזי כוויות מיוחדים 1,2,3. על פי דיווחים שפורסמו לאחרונה, ~ 486,000 חולי כוויות זקוקים לטיפול רפואי מדי שנה בארצות הברית, עם כמעט 3,500 מקרי מוות 1,2,3,4,5,6. פגיעת כוויות מציבה אתגר גדול למערכת החיסונית של החולים ויוצרת פצע פתוח משמעותי, אשר נרפא לאט, ומותיר אותם רגישים להתיישבות עורית, ריאתית וסיסטמית עם חיידקים נוסוקומיאליים ואופורטוניסטיים. חוסר ויסות חיסוני בשילוב עם זיהום חיידקי קשור לעלייה בתחלואה ותמותה בקרב חולי כוויות7.
מודל של כוויות וזיהומים בבעלי חיים חיוני לחקר הפתוגנזה של זיהומים חיידקיים בעקבות נזק לעור ודיכוי חיסוני הקשור לטראומה מכוויות. מודלים כאלה מאפשרים תכנון והערכה של שיטות חדשות לטיפול בזיהומים חיידקיים בחולי כוויות. חולדות ובני אדם חולקים מאפייני עור, פיזיולוגיים ופתולוגיים דומים שתועדו בעבר8. בנוסף, החולדות קטנות יותר בגודלן, מה שהופך אותן לקלות יותר לטיפול, זולות יותר וקלות יותר לרכישה ולתחזוקה מאשר מודלים גדולים יותר של בעלי חיים.
מאפיינים אלה הופכים את החולדות לחיית מודל אידיאלית לחקר כוויות וזיהומים9. למרבה הצער, הטכניקה להשראת כוויות אינה עקבית ולעתים קרובות מתוארת באופן מינימלי 10,11,12,13,14. הפרוטוקול הנוכחי נועד לפתח הליך פשוט, חסכוני וניתן לשחזור ליצירת פגיעה עקבית בכוויות בעובי מלא במודל חולדה המדמה את התרחיש הקליני וניתן להשתמש בו להערכת דיכוי חיסוני וזיהום חיידקי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת צפון קרוליינה ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו שלה. זכרים ונקבות חולדות Sprague Dawley (250-300 גרם) בגילאי 7-9 שבועות שימשו לניסויים. כל בעלי החיים שוכנו במחזור אור-חושך של 12 שעות: 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים אד ליביטום. תמיד לעבוד עם הווטרינר המוסדי שלך על תוכנית משככי כאבים לפני תחילת המחקר.
1. הכנת חולדות לפציעת הכוויה
- הכינו את בעלי החיים לפציעת כוויה 24 שעות לפני הכוויה.
- מרדימים את החולדה עם 5% איזופלורן ב-100% חמצן בתא אינדוקציה למשך 5 דקות (קצב זרימה: 2 ליטר/דקה) עד להאטה בנשימה.
- ברגע שהחולדה מורדמת עמוקות (לא מגיבה לצביטה בבוהן בכל הגפיים), העבירו את החולדה לכרית חימום במצב נוטה והפחיתו את האיזופלורן ל-1.5% חמצן לתחזוקה דרך חרוט באף.
- כדי למנוע התייבשות הקרנית לאחר הרדמה ובמהלך ההליך, יש למרוח חומר סיכה לעיניים על הקרניות של שתי העיניים באמצעות מוליך צמר גפן.
- גלחו את האזור הגבי של החולדה באמצעות קוצץ חשמלי (ראו טבלת חומרים) והסירו כמה שיותר שיער במלבן גדול מהשכמות ועד לבסיס הזנב (איור 2A).
- נקו את האזור המגולח עם טישו ספוג במי מלח כדי לנגב את השערות הרופפות. יש למרוח תחליב להסרת שיער על האזור המגולח באמצעות אפליקטור עם קצוות כותנה ולהשאיר אותו למשך ~3 דקות.
הערה: מריחת תחליב הסרת השיער הנזכר במשך יותר מ -3 דקות תגרום לפריחה אדומה על העור. - נגבו את האזור עם ספוג גזה רטוב פעמיים כדי להסיר את הקרם ולמנוע גירוי בעור.
- כבו את האיזופלורן, הסירו את חרוט האף והכניסו את החולדה לכלוב ההתאוששות.
הערה: הכניסו כרית חימום לכלוב ההתאוששות. - העבירו את בעל החיים שהתאושש לכלוב דיור נקי להליך הכוויה למחרת (ייתכן שיחלפו ~10-15 דקות עד שהחולדה תתאושש מההרדמה).
2. גרימת פציעת כוויה בחולדות
- ביום הכוויה, כוונו את טמפרטורת אמבט המים ל -97 מעלות צלזיוס והניחו את כל ארבעת מוטות הנחושת (420 גרם כל אחד; איור 1) באמבט המים שעה לפני ניסוי הכוויה כדי לאפשר למוטות להתחמם באופן אחיד.
הערה: יש לטבול את המוטות במים. בדוק את הדיוק של תצוגת הטמפרטורה הדיגיטלית באמצעות מדחום לפני הניסוי. - להרדים את החולדה כאמור בסעיף 1.
- ברגע שהחולדה לא מגיבה לצביטה בבוהן בכל הגפיים, הניחו אותה על כרית חימום במצב נוטה עם 1.5% איזופלורן בחמצן לתחזוקה (איור 2A).
- הזריקו מורפיום (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) דרך המסלול התוך-צפקי (I.P.) לטיפול בכאב6.
- בדוק את טמפרטורת המים באמבט המים. הגדר את הטיימר ולבש את הכפפות העמידות בחום.
- הוציאו מוט נחושת מחומם אחד מאמבט המים וגעו בו באזור הגבי של החולדה למשך 7 שניות כדי לגרום לכוויה.
הערה: יש לשמור על מרחק מינימלי (10-15 ס"מ) בין אמבט המים לבין בעל החיים כדי למזער את איבוד החום, ואין להפעיל לחץ על המוטות בעת גרימת הכוויה (כלומר, המגע חייב להישמר על ידי כוח הכבידה). - הפעילו ארבע כוויות, באמצעות מוט אחד לכל אתר כוויה, אחת מיד אחרי השנייה כדי לייצר כ-20% כוויות TBSA במגע מלא (איור 2B).
- לאחר הכוויה, יש לבצע החייאה על ידי הזרקת תמיסת רינגר מניקה (0.1 מ"ל/גרם משקל גוף).
הערה: השתמש בתמיסת רינגר הנקה מותאמת לטמפרטורת הגוף כדי להחיות את החולדות. - כבו את האיזופלורן, הסירו את חרוט האף והניחו את החולדה על משטח החום להתאוששות.
3. הכנת חיסון חיידקי וזיהום
- פזרו את הדגימה הקפואה של Pseudomonas aeruginosa PAO1 ו-Staphylococcus aureus ATCC25923 על לוחות Muller Hinton Agar (MHA), יומיים לפני ניסוי הכוויה.
- למחרת, בחרו מושבה אחת של חיידקים בוגרים מהצלחת, ובעזרת לולאת חיסון, גרדו אותה מעט מהצלחת. לאחר מכן, הניחו אותו בצינור התרבית כדי לחסן 10 מ"ל של מרק מולר הינטון (MHB) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר אינקובטור.
- ביום השריפה וההדבקה, צנטריפוגה את התרבית ב 4,000 × גרם במשך 5 דקות. שטפו את הגלולה במי מלח רגילים (תמיסת NaCl 0.9%).
- להשהות מחדש את כדורית החיידקים במי מלח ולדלל עד 0.1 OD600nm (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). לדלל את החיסון החיידקי על ידי לקיחת 200 μL של תרחיף חיידקי זה וערבוב אותו עם 800 μL של מלוחים כדי לקבל את החיסון החיידקי הרצוי של 2 × 107 CFU/מ"ל.
- הזריקו 50 μL של P. aeruginosa או S. aureus inoculum שהוכן בשלב הקודם (מינון זיהום 1 × 106 CFU) לחולדה המורדמת 15 דקות לאחר הכוויה, באמצעות מחט 29 G תת עורית קרוב ככל האפשר לפצע הכוויה.
- לאחר הדבקת פצע הכוויה, הניחו את החולדה על כרית החימום להתאוששות. לאחר שהחיה מתאוששת (~ 15-20 דקות), אכסנו אותה בכלוב נקי.
הערה: לאחר פציעת הכוויה, אכלסו חולדה אחת בכל כלוב. השתמשו בכדורי מזון רטובים במים ללעיסה קלה והניחו אותם על רצפת הכלוב להגעה נוחה. - מלאו את בקבוקי המים בכלוב במים עם מורפיום (0.4 מ"ג/מ"ל) לטיפול בכאב.
הערה: מורפיום אוראלי משקף את המצב הקליני עם חולי כוויות אנושיים. מחקר זה השתמש במורפיום אוראלי כדי לשמור על ניסויים אלה דומים לחולי כוויות אנושיים לאחר התייעצות עם הצוות הווטרינרי בהזדמנויות רבות. יומני שתייה ומשקל נשמרו לאורך כל הניסוי. השתמש באותה מערכת שתייה במהלך כל ההליכים. משככי כאבים אחרים, כגון Buprenorphine, יכולים להינתן תת עורית / intraperitonely בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים. - מלאו את רשימת התיוג לניטור ועקבו מקרוב אחר בעלי החיים לאיתור מצוקה או מחלה במשך כל תקופת הניסוי.
4. הערכת פציעת הכוויה
- יש להעריך את הפגיעה בכוויה בעור מבחינה מורפולוגית מבחינת צבע ושוליים מיד לאחר הפציעה מכוויה.
- הכתימו את העור השרוף עם המטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי להמחיש את מבנה פצע הכוויה ואת פער האפיתל15 (ראו שלב 5.6 לעיבוד דגימה).
5. עיבוד לאחר דגימות חולדות וספירת חיידקים
- הרדימו את החולדה ב-24, 48 ו-72 שעות לאחר הכוויה עם מנת יתר של חומר הרדמה.
- הוציאו דגימות דם מהחולדות באמצעות ניקוב לב ואספו אותן בצינורית איסוף קטנה.
- נתח ספירות דם מלאות מדגימות הדם כדי לקבוע את ההשפעה של השראת כוויות על המערכת החיסונית המארחת.
- יש לקצור עור, רקמות תת עוריות, שרירים, ריאות וטחול בזמן המתת חסד.
הערה: יש לשמור חלק אחד (~ 1 ס"מ × 1 ס"מ; במשקל ~ 200-300 מ"ג) של העור לצביעת H&E וחלק אחר לספירה חיידקית. - אספו את הרקמות בצינור איסוף של 10 מ"ל והניחו אותן במי מלח רגילים על קרח לצורך ספירת חיידקים.
- לנרמל את משקל הרקמה עם מלוחים רגילים והומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר רקמות (ראה טבלת חומרים).
- לדלל באופן סדרתי את ההומוגנאטים של הרקמה במי מלח רגילים.
- צלחת 100 μL של הומוגנאט לא מדולל וכל הדילולים של כל דגימת רקמה על צלחות אגר cetrimide עבור דגימות שנאספו מחולדות נגועות P. aeruginosa.
הערה: השתמש בצלחות אגר מניטול לציפוי דגימות שנאספו מחולדות נגועות ב- S. aureus. - לדגור את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 16-18 שעות.
- למחרת, ספרו את מושבות החיידקים על הלוחות, הכפילו ביחס הדילול כדי לקבל את ספירת CFU/mL, ונרמלו עם משקל הרקמה כדי לחשב את רקמת CFU/g.
- השתמש בתוכנה לניתוח נתונים כדי לשרטט את ספירת החיידקים באיברים שונים בנקודות זמן הדגימה השונות.
- בצע צביעת H&E של עור שרוף כדי להמחיש את מבנה הפצע ואת פער האפיתל.
- בעזרת מספריים ומלקחיים חותכים טלאי עור בגודל 1X1 ס"מ מאזור הכוויה וטובלים אותו בקיבוע (פורמלין חוצץ ניטרלי 10%, NBF) למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר.
הערה: סובבו את המיכל כדי לוודא שכל הרקמות שקועות לחלוטין בקיבוע, כאשר נפח הקיבוע גדול פי 30 מנפח הרקמה. - יש לייבש את רקמת העור באתנול 70% (v/v) למשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.
- מעבדים את הדגימות המיובשות בגושי פרפין כדי לחתוך את החלקים ולהכתים עם H&E15.
- צייר באופן דיגיטלי את השקופיות המוכתמות בסורק שקופיות (ראה טבלת חומרים) באמצעות מטרה של 40x.
- נתח את התמונה הסרוקה באמצעות תוכנה (ראה קובץ משלים 1 לעיבוד התמונה לניתוח; ראה טבלת חומרים).
- בדוק את כל שדות העור המוכתם כדי להעריך את מצב האפידרמיס, הדרמיס, הרקמה התת עורית ושרירי השלד.
- בעזרת מספריים ומלקחיים חותכים טלאי עור בגודל 1X1 ס"מ מאזור הכוויה וטובלים אותו בקיבוע (פורמלין חוצץ ניטרלי 10%, NBF) למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור רב והביא לפציעת כוויה מדרגה שלישית בעובי מלא בחולדות. פצע הכוויה נראה לבן שעווה לאחר השראת הכוויה (איור 2B). צבע פציעת הכוויה השתנה מלבן לחום במהלך 72 שעות לאחר הכוויה (איור 2B-E).
ניתוח היסטולוגי אישר כוויה בעובי מלא (עומק >2.61 מ"מ ב-24 שעות לאחר הכוויה; איור 3B). בהשוואה לעור שלם שלא נכווה, דגימות עור מחיות שנכוויות הראו עדויות לפציעה בכל השכבות לאחר 24, 48 ו-72 שעות לאחר הפציעה (איור 3). נוסף על כך, ניתוח היסטולוגי הראה הרס מוחלט של שכבת האפידרמיס ופגיעה בעובי המלא של הדרמיס עם מעורבות של שומן תת עורי ושרירי שלד (איור 3B).
כדי להעריך את פינוי החיידקים, רקמות שונות נקצרו לאחר 24, 48 ו-72 שעות לאחר זיהום ב-P. aeruginosa וב-S. aureus. חיידקים נמצאו מאתר ההדבקה של כל החולדות שנפגעו מכוויות (איור 4A,B). יתר על כן, מספר החיידקים שהתאוששו מעורן של חולדות כוויות היה נמוך מהחיסון הראשוני עבור P. aeruginosa 24 שעות לאחר ההדבקה, בעוד שדגימות רקמה שהתקבלו ב-48 ו-72 שעות לאחר הכוויה והזיהום הראו עלייה בעומס החיידקים (איור 4A). לעומת זאת, בכל נקודות הזמן נצפתה עלייה של 2 לוג10 עבור S. aureus בעור בהשוואה לחיסון הראשוני (איור 4B). זה מצביע על כך ש- S. aureus הצליח ליצור זיהום בגלל השכפול הפעיל שלו ברקמות ולא רק בגלל דיכוי חיסוני שנגרם על ידי פציעת הכוויה.
כמו כן נותחו שכבות שונות של העור (כלומר רקמות תת-עוריות, שרירים ואיברים דיסטליים) כדי לבחון את התפזרות החיידקים. הרקמה התת עורית והשרירים הראו עומס חיידקי גבוה יותר מאשר הריאה והטחול. יחד, הנתונים האלה מראים שחולדות כוויות מפתחות זיהום מערכתי 24 שעות או 48 שעות לאחר חיסון הפצע עם P. aeruginosa (איור 4A) או S. aureus, בהתאמה (איור 4B). ספירות דם מלאות התקבלו גם באמצעות מנתח המטולוגי (ראה טבלת חומרים) בתחילת המחקר ו-72 שעות לאחר פגיעת כוויה. ספירת תאי הדם הלבנים הכוללת ירדה עם הזמן, מה שמצביע על דיכוי חיסוני. ספירת הנויטרופילים ירדה לאחר הכוויה אך עלתה בעקבות זיהום לאחר 72 שעות בהשוואה לקו הבסיס (טבלה 1). עם זאת, נצפו עליות בספירת תאי הדם האדומים והטסיות לאחר כוויות וזיהום, דבר המצביע על דלקת מערכתית.
איור 1: מוט נחושת המשמש להשראת כוויה. משקל המוט בהתאמה אישית הוא 420 גרם בקוטר 5.4 ס"מ וגובה 6.4 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מבט מקרוסקופי על הצד הגבי של החולדה לפני ואחרי השראת הכוויה. (A) דורסום חולדה לאחר גילוח, (B) מיד לאחר פגיעת כוויה, (C) 24 שעות לאחר הכוויה, (D) 48 שעות לאחר הכוויה, ו-(E) 72 שעות לאחר הכוויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות של חתכי H&E מוכתמים עבור כל רמה של חומרת כוויה. (A) ההיסטולוגיה של עור חולדה דמה מראה הבחנה ברורה בין אפידרמיס, דרמיס ושכבות רקמה תת-עורית. (B) היסטולוגיה של העור 24 שעות לאחר הכוויה מראה אפידרמיס מוחלש עם נזק קוגולטיבי לעובי המלא של הדרמיס והרקמה התת עורית עם עומק כוויה מרבי של >2.61 מ"מ. (C) ב-48 שעות לאחר הכוויה, עומק הכוויה המרבי היה 2.35 מ"מ, ו-(D) ב-72 שעות לאחר הכוויה, עומק הכוויה המרבי היה 2.20 מ"מ. התמונות נסרקו בהגדלה של פי 40. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר (A-D). קיצור: H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כימות עומס חיידקים באיברים שונים לאחר זיהום של פצע כוויה. חולדות נדבקו ב-6 לוג CFU של החיידק באמצעות זריקות תת עוריות 15 דקות לאחר פציעת הכוויה. עור, רקמות תת עוריות, שרירים, ריאות וטחול נאספו 24, 48 ו -72 שעות לאחר ההדבקה כדי לקבוע את התקדמות המחלה המערכתית. בכל נקודת זמן נעשה שימוש בשלוש חולדות. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01 , (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. קיצור: CFU = יחידות יוצרות מושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| סוג תא | תוכנית בסיסית (ממוצע ± SD) | 72 שעות לא נגוע (ממוצע ± SD) | 72 h-נגוע (ממוצע ± SD) |
| תאי דם לבנים (109/L) | 19.8 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| נויטרופילים (109/L); (%) | 4.0 ± 1.1; (39.1 ± 2.8) | 1.4 ± 0.4; (32.5 ± 5.7) | 1.88 ± 1.0; (36.3 ± 12.4) |
| לימפוציטים (109/L); (%) | 11.6 ± 4.1; (100.2 ± 1.7) | 4.8 ± 1.7; (106.9 ± 7.6) | 3.54 ± 3.9; (74.7 ± 17.0) |
| מונוציטים (109/L); (%) | 0.9 ± 0.3; (5.4 ± 1.5) | 0.8 ± 0.2; (11.5 ± 1.6) | 1.0 ± 0.6; (17.9 ± 5.5) |
| תאי דם אדומים (1012/L) | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| המוגלובין (g/dL) | 19.9 ± 0.7 | 13.5 ± 1.0 | 19.6 ± 2.0 |
| טסיות דם (109/L) | 723.3 ± 353.1 | 942.7 ± 43.1 | 1359.0 ± 228.5 |
| HCT (%) | 43.4 ± 3.0 | 64.2 ± 3.7 | 59.7 ± 8.2 |
טבלה 1: פרמטרים המטולוגיים לפני ואחרי גרימת כוויות וזיהום. קיצור: HCT = המטוקריט.
קובץ משלים 1: שלבים לניתוח תמונות H&E ב- Aperio ImageScope. קיצור: H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר מודלים של כוויות הוצגו כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של פגיעה בכוויות 8,12,16,17. במחקר הנוכחי, השתמשנו במודל של חולדות כדי לפתח פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור כדי לגרום לכוויה בעובי מלא ואחריה זיהום חיידקי כדי לדמות טראומה מכוויה נגועה בחולים. הבחירה בחולדה כמודל החייתי לחיקוי התנאים האנושיים מבוססת על איזון של עלות, קלות שימוש, יכולת שחזור ואמינות הנתונים. למודל החולדות המשמש כאן יתרונות רבים על פני אחרים: הוא קל לטיפול והוא מודל הכוויה הנפוץ ביותר, המאפשר השוואה בין הספרות. למרות שהחולדה נמצאת בשימוש נרחב במסגרת הניסוי, החולדה והאינטגמנטים האנושיים אינם זהים מבחינה היסטולוגית18,19. הכסות של החולדה מורכבת מהעור, שכבה שומנית המכונה panniculus adiposus, ומתחתיה מעטה של רקמת חיבור רופפת הקשורה לרקמת שומן לבנה ושריר חלק היוצר שכבה המכונה panniculus carnosus. השכבה האחרונה נעדרת ברוב הכסות האנושית. יש לכך משמעות, שכן תאי השריר החלק שלו מקדמים התכווצות פצע מהירה ומספקת20. בנוסף, יש לציין כי מנגנוני ריפוי הפצעים של חולדות שונים באופן מהותי מאלה של בני אדם8. לפיכך, על החוקרים לזכור זאת כאשר הם מפרשים את תוצאות הפרוטוקול המתואר במאמר זה. עם זאת, התועלת של מודל החולדות לחקר פציעות כוויות מקומיות ואלח דם לאחר כוויות אינה מוטלת בספק והניבה נתונים רבים שהם אמינים מבחינה קלינית וניתנים להעברה21. בנוסף, לחולדות יש שטח פנים גדול יותר בהשוואה לבעלי חיים קטנים אחרים, מה שמאפשר השראת פצעי כוויות גדולים יחסית, מה שהופך אותו למודל טוב למחקרי כוויות רלוונטיים מבחינה קלינית.
פורסמו שיטות שונות להשראת כוויה, ביניהן מים רותחים16, מוט פליז מחומם 22, תבנית אלומיניום מחוממת17, פלטת חום בטמפרטורה קבועה המונחת מעל מוטות נירוסטה23, וצריבה מעל 45% משטח הגוף24. פרוטוקול ניסויי אידיאלי יהיה בעל יכולת להשיג פצעי כוויות עקביים בגודל ובעומק. במחקר הנוכחי, 420 גרם מוטות נחושת שחוממו במים בטמפרטורה של 97 מעלות צלזיוס שימשו להעברת החום באמצעות מוליכות ישירה כדי לגרום לכוויה. במהלך השראת הכוויה, מוטות נגעו ישירות על פני העור מבלי להפעיל לחץ חיצוני, שכן מוליכות האנרגיה התרמית ממבנה מוצק למשטח העור אינה תלויה בלחץ המופעל אלא בשיפוע הטמפרטורה 25 והמרחק בין המבנה המוצק לעור17,25. הגורמים שקבעו את בחירת המתכת כללו מוליכות תרמית ויכולת עמידות בפני חלודה וקורוזיה.
נחושת היא בעלת מוליכות תרמית גבוהה (398 W/mK; כאשר W הוא חום בוואט, m הוא שטח במטרים, K הוא טמפרטורה בקלבין) בהשוואה לפלדת אל-חלד, אלומיניום או פליז עם 16 W/mK, 225 W/mK ו-109 W/mK, בהתאמה9. מוטות מתכת בעלי מוליכות תרמית גבוהה יפזרו אנרגיית חום מהר יותר לרקמות העור מאשר מוטות מוליכות תרמית נמוכה ויגרמו לרמה עמוקה יותר של כוויה באותו משך חשיפה. בנוסף, גודלו ומשקלו של המוט הוגדלו באופן אלומטרי ממודל הכוויה בעכברים 7,26,27 וגורם לכוויה של כ-20% TBSA. מוט בקוטר 1.9 ס"מ (שטח הכוויה הכולל הוא 11.3 ס"מ 2 בעכבר לאחר ארבעה יישומים) הוגדל לקוטר 5.4 ס"מ (שטח הכוויה הכולל הוא 91.6 ס"מ 2 בחולדה לאחר ארבעה יישומים) כדי לגרום לכוויה דומה ~20%-30% TBSA בחולדה (TBSA של חולדה 220 גרם הוא 356.0 ס"מ2)28, בהתחשב בכך שה-TBSA של חולדה גדול פי 6 מהעכבר (TBSA של עכבר של 20 גרם הוא 61.2 ס"מ2)29. התוצאות מראות בבירור ששיטה זו גרמה לכוויה בעובי מלא, וניתוח היסטולוגי הצביע על ניגוד מצוין בין רקמות עור רגילות ושרויות בנקודות זמן שונות לאחר הכוויה (איור 3). מודל זה הצליח גם ללכוד דיכוי חיסוני, אשר נצפה בחולים לאחר פציעה מכוויה30,31 (טבלה 1).
זיהומים חיידקיים הם איום חשוב הפוגע בתהליך הריפוי של חולי כוויות ולעיתים קרובות הם הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה לאחר פציעות כוויות. כדי לדמות מצבים דומים, החולדה נדבקה בעקבות פציעת כוויה עם P. aeruginosa או S. aureus. בתחילה ניסינו מריחה מקומית של החיידקים, אך המראה השעווה של משטח הכוויה עיכב את ספיגת החיסון החיידקי. מודל זה היה מסוגל גם לשחזר התקדמות מחלה מערכתית לאחר זיהום חיידקי של אתר הכוויה כפי שניתן לראות עם עומס חיידקי שהוחזר מהריאה והטחול (איור 4). לסיכום, הדגמנו שיטה פשוטה וניתנת לשחזור ליצירת כוויות בעובי מלא המציגות רבות מהתכונות שנצפו בפציעות כוויות אנושיות. פרוטוקול זה יכול לסייע בלימוד מגוון רחב של טיפולים אקטואליים חדשניים לטיפול בפצעי כוויות מזוהמים. מודל זה יכול לשמש גם כמודל חסכוני להערכת חבישות פצעים שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים למחלקה לרפואה השוואתית באוניברסיטת צפון קרוליינה על מתן וטיפול בבעלי חיים. אנו מודים ללורן ראלף ולמיה אוונג'ליסטה בליבת שירותי הפתולוגיה על סיוע טכני מומחה בהיסטופתולוגיה/פתולוגיה דיגיטלית, כולל חתך רקמות והדמיה. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר ממשרד ההגנה (פרס מספר W81XWH-20-1-0500, GR ו- TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
