Summary
En modell som etterligner det kliniske scenariet for brannskade og infeksjon er nødvendig for å fremme brannskadeforskning. Den nåværende protokollen demonstrerer en enkel og reproduserbar rottebrenninfeksjonsmodell som er sammenlignbar med den hos mennesker. Dette forenkler studiet av brannskader og infeksjoner etter brannskade for å utvikle nye aktuelle antibiotikabehandlinger.
Abstract
Brenninduksjonsmetoder er inkonsekvent beskrevet i rottemodeller. En enhetlig brannsårmodell, som representerer det kliniske scenariet, er nødvendig for å utføre reproduserbar brannskadeforskning. Den nåværende protokollen beskriver en enkel og reproduserbar metode for å skape ~ 20% total kroppsoverflate (TBSA) full tykkelse forbrenninger hos rotter. Her ble en kobberstang på 22,89 cm2 (5,4 cm diameter) oppvarmet ved 97 °C i et vannbad påført rottehudoverflaten for å indusere brannskaden. En kobberstang med høy varmeledningsevne var i stand til å spre varmen dypere i hudvevet for å skape en brenning i full tykkelse. Histologianalyse viser svekket epidermis med koagulativ skade på fulltykkelsesutbredelsen av dermis og subkutant vev. I tillegg er denne modellen representativ for de kliniske situasjonene observert hos sykehusinnlagte brannskadepasienter etter brannskade som immundysregulering og bakterielle infeksjoner. Modellen kan rekapitulere den systemiske bakterielle infeksjonen av både gram-positive og gramnegative bakterier. Avslutningsvis presenterer denne artikkelen en lettlært og robust rottebrenningsmodell som etterligner de kliniske situasjonene, inkludert immundysregulering og bakterielle infeksjoner, noe som er av betydelig nytte for utvikling av nye aktuelle antibiotika mot brannsår og infeksjoner.
Introduction
Brannskader er blant de mest ødeleggende former for traumer, med dødelighet som når 12% selv i spesialiserte brannskadesentre 1,2,3. Ifølge nylig publiserte rapporter krever ~ 486 000 brannskadepasienter medisinsk behandling årlig i USA, med nesten 3 500 dødsfall 1,2,3,4,5,6. Brannskade medfører en stor utfordring for pasientens immunsystem og skaper et betydelig åpent sår, som er sakte å helbrede, slik at de blir utsatt for kutan, lunge og systemisk kolonisering med nosokomiale, opportunistiske bakterier. Immundysregulering kombinert med bakterieinfeksjonen er assosiert med økt sykelighet og dødelighet hos brannskadepasienter7.
En dyreforbrennings- og infeksjonsmodell er avgjørende for å studere patogenesen av bakterielle infeksjoner etter hudskader og immunundertrykkelse forbundet med brannskader. Slike modeller gjør det mulig å designe og evaluere nye metoder for behandling av bakterielle infeksjoner hos brannskadepasienter. Rotter og mennesker deler lignende hudfysiologiske og patologiske egenskaper som tidligere er dokumentert8. I tillegg er rotter mindre i størrelse, noe som gjør dem enklere å håndtere, rimeligere og enklere å anskaffe og vedlikeholde enn større dyremodeller.
Disse egenskapene gjør rotter til et ideelt modelldyr for å studere brannskader og infeksjoner9. Dessverre er teknikken for brenninduksjon inkonsekvent og ofte minimalt beskrevet 10,11,12,13,14. Den nåværende protokollen er utformet for å utvikle en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar prosedyre for å skape en konsistent brannskade i full tykkelse i en rottemodell som simulerer det kliniske scenariet og kan brukes til å evaluere immunsuppresjon og bakteriell infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina og ble utført i samsvar med de etablerte retningslinjene. Mannlige og kvinnelige Sprague Dawley-rotter (250-300 g) i alderen 7-9 uker gamle ble brukt til forsøkene. Alle dyrene ble plassert i en 12 timer: 12 h lys-mørk syklus med fri tilgang til mat og vann ad libitum. Arbeid alltid med din institusjonelle veterinær om en smertestillende plan før studiestart.
1. Forbereder rotter for brannskaden
- Forbered dyrene på brannskade 24 timer før brenningen.
- Bedøv rotta med 5 % isofluran i 100 % oksygen i et induksjonskammer i 5 minutter (strømningshastighet: 2 l/min) til pusten har avtatt.
- Når rotta er dypt bedøvet (reagerer ikke på tåklemme på alle lemmer), flytt rotta over til en varmepute i utsatt stilling og reduser isofluran til 1,5% i oksygen for vedlikehold gjennom en nesekegle.
- For å forhindre hornhindetørking etter anestesi og under prosedyren, bruk øyesmøremiddel på hornhinnene i begge øynene ved hjelp av en bomullstippet applikator.
- Barber ryggområdet på rotta med en elektrisk klipper (se materialfortegnelsen) og fjern så mye hår som mulig i et stort rektangel fra skulderbladene ned til halebunnen (figur 2A).
- Rengjør det barberte området med et vev dynket i saltvann for å tørke ut de løse hårene. Påfør hårfjerningskrem på det barberte området ved hjelp av en bomullstippet applikator og la den være på i ~ 3 min.
MERK: Påføring av den refererte hårfjerningskremen i mer enn 3 minutter vil indusere røde utslett på huden. - Tørk området med en våt gasbindsvamp to ganger for å fjerne lotionen og forhindre hudirritasjon.
- Slå av isofluran, fjern nesekjeglen og plasser rotta i oppvåkningsburet.
NOTAT: Sett en varmepute i oppvåkningsburet. - Overfør det gjenopprettede dyret til et rent bur for neste dags brennprosedyre (det kan ta ~ 10-15 min for rotta å komme seg fra anestesien).
2. Indusere brannskade hos rotter
- På brennedagen setter du temperaturen på vannbadet til 97 °C og plasserer alle fire kobberstengene (420 g hver; Figur 1) i vannbadet 1 time før brenneksperimentet for å la stengene varme opp jevnt.
MERK: Stengene må senkes ned i vannet. Kontroller nøyaktigheten til den digitale temperaturvisningen ved hjelp av et termometer før eksperimentet. - Bedøv rotta som nevnt i § 1.
- Når rotta ikke reagerer på tåklemme på alle lemmer, plasser den på en varmepute i mageleie med 1,5 % isofluran i oksygen for vedlikehold (figur 2A).
- Injiser morfin (20 mg/kg kroppsvekt) intraperitoneal (i.p.) for smertebehandling6.
- Kontroller temperaturen på vannet i vannbadet. Sett opp timeren og sett på de varmebestandige hanskene.
- Ta ut en oppvarmet kobberstang fra vannbadet og berør den på rottens dorsumområde i 7 s for å indusere brenningen.
MERK: Hold en minimumsavstand (10-15 cm) mellom vannbadet og dyret for å minimere varmetap, og ikke legg press på stengene mens du induserer brenningen (dvs. kontakt må opprettholdes av tyngdekraften). - Påfør fire brannsår, bruk en stang per brennsted, den ene umiddelbart etter den andre for å produsere en ca. 20% TBSA fullkontaktforbrenning (figur 2B).
- Etter brenningen gjenopplives dyret med i.p. injeksjon av laktert Ringer-oppløsning (0,1 ml/g kroppsvekt).
MERK: Bruk en kroppstemperaturjustert laktert ringerløsning for å gjenopplive rottene. - Slå av isofluran, fjern nesekjeglen og legg rotta på varmematten for restitusjon.
3. Fremstilling av bakteriell inokulum og infeksjon
- Strek den frosne prøven av Pseudomonas aeruginosa PAO1 og Staphylococcus aureus ATCC25923 på Muller Hinton Agar (MHA) plater, 2 dager før brenneksperimentet.
- På neste dag, velg en enkelt koloni av dyrkede bakterier fra platen, og skrap den litt av platen ved hjelp av en inokulasjonssløyfe. Deretter legger du den i dyrkningsrøret for å inokulere 10 ml Muller Hinton Broth (MHB) og kultur over natten ved 37 °C i en inkubatorrister.
- På dagen for brenning og infeksjon, sentrifuge kulturen ved 4.000 × g i 5 minutter. Vask pelleten med vanlig saltvann (0,9% NaCl oppløsning).
- Resuspender bakteriell pellet i saltvann og fortynn opp til 0,1 OD 600 nm (optisk tetthet ved600 nm ). Fortynn det bakterielle inokulumet ved å ta 200 μL av denne bakterielle suspensjonen og bland den med 800 μL saltvann for å få ønsket bakteriell inokulum på 2 × 107 CFU / ml.
- Injiser 50 μL P. aeruginosa eller S. aureus inoculum fremstilt i forrige trinn (infeksjonsdose 1 × 106 CFU) i den bedøvede rotten 15 minutter etter brenningen, ved å bruke en 29 G kanyle subkutant så nær brannsåret som mulig.
- Etter å ha infisert brannsåret, legg rotta på varmeputen for gjenoppretting. Når dyret gjenoppretter (~ 15-20 min), hus det i et rent bur.
MERK: Etter brannskaden, hus en rotte per bur. Bruk vannvåte matpellets for enkel tygging og legg dem på burgulvet for enkel rekkevidde. - Fyll vannflaskene i buret med morfin-spiked vann (0,4 mg / ml) for smertebehandling.
MERK: Oral morfin speiler den kliniske situasjonen hos brannskadepasienter. Denne studien benyttet oral morfin for å holde disse forsøkene sammenlignbare med menneskelige brannskadepasienter etter samråd med veterinærpersonalet ved flere anledninger. Drikke- og vektlogger ble opprettholdt gjennom hele forsøket. Bruk det samme drikkesystemet under alle prosedyrene. Andre analgetika, som buprenorfin, kan administreres subkutant/intraperitonealt i henhold til institusjonelle retningslinjer for dyrepleie. - Fyll ut sjekklisten for overvåking og overvåk dyrene nøye for nød eller sykdom i hele forsøkets varighet.
4. Vurdering av brannskaden
- Vurder hudforbrenningsskaden morfologisk når det gjelder farge og margin umiddelbart etter brannskaden.
- Flekk den brente huden med hematoksylin og eosin (H&E) for å visualisere brannsårstrukturen og epitelgapet15 (se trinn 5.6 for prøvebehandling).
5. Etterbehandling av rotteprøver og bakterietelling
- Avlive rotta ved 24, 48 og 72 timer etter forbrenning med en overdose av anestesi.
- Trekk blodprøver fra rottene via hjertepunktering og samle dem i et minioppsamlingsrør.
- Analyser fullstendige blodtellinger fra blodprøver for å bestemme effekten av brenninduksjon på vertsimmunsystemet.
- Høst hud, underhud, muskel, lunge og milt ved eutanasi.
MERK: Hold en del (~ 1 cm × 1 cm; veier ~ 200-300 mg) av huden for H &E farging og en annen del for bakteriell oppregning. - Samle vevene i et 10 ml oppsamlingsrør og legg dem i vanlig saltvann på is for bakteriell oppregning.
- Normaliser vevvekten med vanlig saltvann og homogeniser prøvene ved hjelp av en vevshomogenisator (se materialfortegnelsen).
- Serielt fortynne vevshomogenatene i vanlig saltvann.
- Plate 100 μL ufortynnet homogenat og alle fortynninger av hver vevsprøve på cetrimid agarplater for prøver samlet fra rotter infisert med P. aeruginosa.
MERK: Bruk mannitol agar plater for plating prøver samlet fra rotter infisert med S. aureus. - Inkuber platene ved 37 ° C i en inkubator i 16-18 timer.
- Neste dag, telle bakteriekoloniene på platene, multipliser med fortynningsforholdet for å få CFU / ml-tellingen, og normaliser med vevets vekt for å beregne CFU / g-vevet.
- Bruk dataanalyseprogramvare for å plotte bakterietall i forskjellige organer på de forskjellige prøvetakingstidspunktene.
- Utfør H&E-farging av brent hud for å visualisere sårstrukturen og epitelgapet.
- Bruk saks og tanntang til å klippe et hudplaster på 1 cm x 1 cm fra brennområdet og senk det ned i et fikseringsmiddel (10 % nøytral bufret formalin, NBF) i 48 timer ved romtemperatur.
MERK: Virvle beholderen for å sikre at alt vev er helt nedsenket i fiksativet, med volumet av fikseringsmiddelet 30x vevsvolumet. - Dehydrer hudvevet med 70 % (v/v) etanol i 72 timer ved romtemperatur.
- Behandle de dehydrerte prøvene i parafinblokker for å kutte seksjonene og beise med H&E15.
- Avbilde de fargede lysbildene digitalt i en lysbildeskanner (se materialfortegnelsen) ved hjelp av et 40x-mål.
- Analyser det skannede bildet ved hjelp av programvare (se tilleggsfil 1 for behandling av bildet for analyse; se materialfortegnelsen).
- Undersøk alle felt i den fargede hudseksjonen for å evaluere tilstanden til epidermis, dermis, subkutant vev og skjelettmuskulatur.
- Bruk saks og tanntang til å klippe et hudplaster på 1 cm x 1 cm fra brennområdet og senk det ned i et fikseringsmiddel (10 % nøytral bufret formalin, NBF) i 48 timer ved romtemperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her er svært reproduserbar og resulterte i en tredjegrads brannskade i full tykkelse hos rotter. Brannsåret fremstår voksaktig hvitt etter brannskadeinduksjon (figur 2B). Fargen på brannskaden endret seg fra hvit til brun i løpet av 72 timer etter forbrenning (figur 2B-E).
Histologisk analyse bekreftet en brenning i full tykkelse (dybde >2,61 mm ved 24 timer etter brenning; Figur 3B). Sammenlignet med intakt ikke-brennende hud viste hudprøver fra brannskadede dyr tegn på skade på tvers av alle lag ved 24, 48 og 72 timer etter brannskade (figur 3). I tillegg viste histologisk analyse fullstendig destruksjon av epidermalt lag og skade på full tykkelse av dermis med involvering av subkutant fett og skjelettmuskulatur (figur 3B).
For å evaluere bakteriell clearance ble forskjellige vev høstet ved 24, 48 og 72 timer etter infeksjon med P. aeruginosa og S. aureus. Det ble funnet bakterier fra infeksjonsstedet for alle brannskaderotter (figur 4A,B). Videre var antallet bakterier gjenfunnet fra huden hos brannrotter mindre enn det opprinnelige inokulumet for P. aeruginosa ved 24 timer etter infeksjon, mens vevsprøver tatt ved 48 og 72 timer etter forbrenning og infeksjon viste en økning i bakteriebyrden (figur 4A). Derimot ble det observert en økning på 2 log10 ved alle tidspunkter for S. aureus i huden sammenlignet med initial inokulum (figur 4B). Dette antyder at S. aureus var i stand til å etablere infeksjon på grunn av sin aktive replikasjon i vevet og ikke bare på grunn av immunsuppresjon indusert av brannskaden.
Ulike lag av huden (dvs. subkutant vev, muskler og distale organer) ble også analysert for å undersøke bakteriell spredning. Underhuden og musklene viste høyere bakteriemengde enn lunge og milt. Samlet viser disse dataene at brannskaderotter utvikler en systemisk infeksjon 24 timer eller 48 timer etter sårinokulasjon med henholdsvis P. aeruginosa (figur 4A) eller S. aureus (figur 4B). Fullstendige blodtellinger ble også utført ved hjelp av en hematologisk analysator (se materialfortegnelsen) ved baseline og 72 timer etter brannskade. Totalt antall hvite blodlegemer ble redusert over tid, noe som indikerer immunsuppresjon. Nøytrofiltallet avtok etter forbrenning, men økte etter infeksjon ved 72 timer sammenlignet med baseline (tabell 1). Økning i antall røde blodlegemer og blodplater ble imidlertid observert etter forbrenning og infeksjon, noe som indikerer systemisk inflammasjon.
Figur 1 Kobberstang brukt for å påføre branninduksjon. Vekten på den skreddersydde stangen er 420 g med en diameter på 5,4 cm og en høyde på 6,4 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Makroskopisk bilde av rottens dorsale side før og etter brenninduksjon . (A) Rottedorsum etter barbering, (B) umiddelbart etter brannskade, (C) 24 timer etter brenning, (D) 48 timer etter brenning og (E) 72 timer etter brenning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av H&E-fargede tverrsnitt for hvert nivå av brennalvorlighetsgrad. (A) Histologien til humbug rottehud viser et klart skille mellom epidermis, dermis og subkutane vevslag. (B) Hudhistologi 24 timer etter brenning viser svekket epidermis med koagulativ skade på full tykkelse av dermis og underhudsvev med en maksimal brenndybde på >2,61 mm. (C) Ved 48 timer etter brenning var maksimal brenndybde 2,35 mm, og (D) ved 72 timer etter brenning var maksimal brenndybde 2,20 mm. Bildene ble skannet med 40x forstørrelse. Skalastenger = 500 μm (A-D). Forkortelse: H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Kvantifisering av bakteriemengde i ulike organer etter infeksjon i brannsår. Rotter ble infisert med 6 log CFU av bakterien via subkutane injeksjoner 15 min etter brannskaden. Hud, underhudsvev, muskel, lunge og milt ble samlet 24, 48 og 72 timer etter infeksjon for å bestemme utviklingen av systemisk sykdom. Tre rotter ble brukt på hvert tidspunkt. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Forkortelse: CFU = kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Celletype | Baseline (gjennomsnitt ± SD) | 72 timer Ikke-infisert (gjennomsnittlig ± SD) | 72 h-infiserte (gjennomsnitt ± SD) |
| Hvite blodlegemer (109/l) | 16,9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6,50 ± 5,5 |
| nøytrofil (109/l); (%) | 4,0 ± 1,1; (24,3 ± 2,8) | 1,4 ± 0,4; (20,2 ± 5,7) | 1,88 ± 1,0; (35,0 ± 12,4) |
| Lymfocytter (109/L); (%) | 11.6 ± 4.1; (68,5 ± 1,7) | 4,8 ± 1,7; (66,5 ± 7,6) | 3,54 ± 3,9; (46,4 ± 17,0) |
| Monocytter (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5.4 ± 1.5) | 0,8 ± 0,2; (11,5 ± 1,6) | 1,0 ± 0,6; (17,3 ± 5,5) |
| Røde blodlegemer (1012/L) | 7,5 ± 0,3 | 7,1 ± 0,8 | 10,0 ± 1.1 |
| Hemoglobin (g/dl) | 14,3 ± 0,7 | 13,4 ± 1.0 | 18,6 ± 2.0 |
| Blodplater (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3.0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tabell 1 Hematologiske parametere før og etter brannskade og infeksjon. Forkortelse: HCT = hematokrit.
Tilleggsfil 1: Trinn for å analysere H&E-bilder i Aperio ImageScope. Forkortelse: H&E = hematoksylin og eosin. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere brannskademodeller er presentert for å studere patofysiologien ved brannskade 8,12,16,17. I denne studien benyttet vi en rottemodell for å utvikle en enkel og reproduserbar protokoll for å indusere en full tykkelsesforbrenning etterfulgt av bakteriell infeksjon for å simulere et infisert brenntraume hos pasienter. Valget av rotte som dyremodell for å etterligne menneskelige forhold er basert på en balanse mellom kostnader, brukervennlighet, reproduserbarhet og pålitelighet av dataene. Rottemodellen som brukes her har mange fordeler i forhold til andre: den er enkel å håndtere og er den mest brukte brennemodellen, noe som gjør det mulig å sammenligne på tvers av litteraturen. Til tross for at rotta er mye brukt i eksperimentell setting, er rotte og menneskelige integrasjoner ikke histologisk identiske18,19. Integumentet til rotta består av huden, et fettlag kjent som panniculus adiposus, og under dette laget er en kappe av løs bindevev assosiert med hvitt fettvev og glatt muskulatur som danner et lag kjent som panniculus carnosus. Det sistnevnte laget er fraværende i det meste av det menneskelige integumentet. Dette er av betydning, siden de glatte muskelcellene fremmer rask og rikelig sårkontraksjon20. I tillegg må det bemerkes at sårhelingsmekanismene til rotter er vesentlig forskjellige fra menneskers8. Derfor bør forskere ha dette i bakhodet når de tolker resultatene av protokollen beskrevet i denne artikkelen. Likevel er nytten av rottemodellen for å studere lokaliserte brannskader og sepsis etter brann udiskutabel og har produsert rikelig med data som er klinisk pålitelige og overførbare21. I tillegg har rotter mer overflateareal sammenlignet med andre små dyr, noe som tillater induksjon av relativt større brannsår, noe som gjør det til en god modell for klinisk relevante brannskader.
Ulike metoder for brenninduksjon har blitt publisert, inkludert kokende vann16, oppvarmet messingstang 22, oppvarmet aluminiumsmal17, en varmeplate med konstant temperatur plassert over rustfrie stålstenger23 og skålding over 45% av kroppsoverflaten24. En ideell eksperimentell protokoll ville ha kapasitet til å oppnå brannsår som er konsistente i størrelse og dybde. I denne studien ble 420 g kobberstenger oppvarmet i vann ved 97 °C brukt til å overføre varmen gjennom direkte konduktans for å indusere forbrenningen. Under brenninduksjon ble stengene direkte berørt hudoverflaten uten å påføre noe eksternt trykk, da den termiske energikonduktansen fra en solid struktur til en hudoverflate ikke avhenger av trykket som brukes, men heller av temperaturgradienten 25 og avstanden mellom den faste strukturen og huden17,25. Faktorene som bestemte valget av metall inkluderte termisk ledningsevne og evnen til å motstå rust og korrosjon.
Kobber har høy varmeledningsevne (398 W / mK; hvor W er varme i watt, m er areal i meter, K er temperatur i kelvin) sammenlignet med rustfritt stål, aluminium eller messing med henholdsvis 16 W / mK, 225 W / mK og 109 W / mK, henholdsvis9. Metallstenger med høy varmeledningsevne vil spre varmeenergi raskere til hudvevet enn stenger med lav varmeledningsevne og indusere et dypere brennnivå innen samme eksponeringsvarighet. I tillegg ble størrelsen og vekten av stangen allometrisk skalert fra brennmodellen hos mus 7,26,27 og induserer en ca. 20% TBSA-forbrenning. En stang med diameter på 1,9 cm (totalt brennareal er 11,3 cm 2 i en mus etter fire påføringer) ble skalert til 5,4 cm diameter (totalt brennareal er 91,6 cm 2 hos en rotte etter fire påføringer) for å indusere en lignende ~ 20% -30% TBSA-forbrenning hos rotte (TBSA på en 220 g rotte er 356,0 cm2) 28, vurderer at TBSA av rotte er 6x større enn musen (TBSA av en 20 g mus er 61,2 cm2) 29. Resultatene viser tydelig at denne metoden induserte fullhudsforbrenning, og histologisk analyse indikerte utmerket kontrast mellom normalt og brent hudvev ved ulike tidspunkter etter forbrenning (figur 3). Denne modellen var også i stand til å fange opp immunsuppresjon, som observeres hos pasienter etter brannskade30,31 (tab 1).
Bakterielle infeksjoner er en viktig trussel som kompromitterer helbredelsesprosessen til brannskadepasienter og er ofte den ledende årsaken til sykelighet og dødelighet etter brannskader. For å simulere lignende forhold ble rotta smittet etter en brannskade med enten P. aeruginosa eller S. aureus. I utgangspunktet prøvde vi aktuell påføring av bakteriene, men det voksagtige utseendet på brennoverflaten hemmet absorpsjonen av bakteriell inokulum. Denne modellen var også i stand til å rekapitulere systemisk sykdomsprogresjon etter bakteriell infeksjon i brannskadestedet sett med bakteriebyrde gjenfunnet fra lunge og milt (figur 4). Avslutningsvis har vi demonstrert en enkel og reproduserbar metode for å lage brannskader i full tykkelse som viser mange av funksjonene observert i menneskelige brannskader. Denne protokollen kan hjelpe til med å studere et bredt spekter av nye aktuelle terapier for behandling av infiserte brannsår. Denne modellen kan også brukes som en kostnadseffektiv modell for evaluering av ulike sårbandasjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker divisjonen for komparativ medisin ved University of North Carolina for levering og omsorg for dyr. Vi takker Lauren Ralph og Mia Evangelista i Pathology Services Core for ekspert teknisk assistanse med histopatologi / digital patologi, inkludert vevsseksjonering og bildebehandling. Denne forskningen ble støttet av et forskningsstipend fra Forsvarsdepartementet (Award number W81XWH-20-1-0500, GR og TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
