Summary
Um modelo que imite o cenário clínico de lesão por queimadura e infecção é necessário para promover a pesquisa de queimaduras. O presente protocolo demonstra um modelo de infecção por queimadura de rato simples e reprodutível, comparável ao de humanos. Isso facilita o estudo de queimaduras e infecções após a queimadura para o desenvolvimento de novos tratamentos tópicos com antibióticos.
Abstract
As metodologias de indução de queimaduras são descritas de forma inconsistente em modelos de ratos. Um modelo uniforme de queimadura, que represente o cenário clínico, é necessário para a realização de pesquisas de queimaduras reprodutíveis. O presente protocolo descreve um método simples e reprodutível para criar queimaduras de espessura total de ~20% da área total do corpo (TBSA) em ratos. Aqui, uma haste de cobrede 22,89 cm 2 (5,4 cm de diâmetro) aquecida a 97 °C em banho-maria foi aplicada na superfície da pele do rato para induzir a lesão por queimadura. Uma haste de cobre com uma alta condutividade térmica foi capaz de dissipar o calor mais profundamente no tecido da pele para criar uma queimadura de espessura total. A análise histológica mostra epiderme atenuada com dano coagulativo na extensão de toda a espessura da derme e do tecido subcutâneo. Além disso, esse modelo é representativo das situações clínicas observadas em pacientes queimados hospitalizados após lesão por queimadura, como desregulação imunológica e infecções bacterianas. O modelo pode recapitular a infecção bacteriana sistêmica por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em conclusão, este artigo apresenta um modelo de queimadura de rato robusto e de fácil aprendizado que imita as situações clínicas, incluindo desregulação imunológica e infecções bacterianas, o que é de considerável utilidade para o desenvolvimento de novos antibióticos tópicos para queimaduras e infecções.
Introduction
As queimaduras estão entre as formas mais devastadoras de trauma, com taxas de mortalidade chegando a 12%, mesmo em centros especializados em queimados 1,2,3. De acordo com relatórios publicados recentemente, ~ 486.000 pacientes queimados requerem cuidados médicos anualmente nos Estados Unidos, com quase 3.500 mortes 1,2,3,4,5,6. A lesão por queimadura impõe um grande desafio para o sistema imunológico dos pacientes e cria uma ferida aberta significativa, que é lenta para cicatrizar, deixando-os suscetíveis à colonização cutânea, pulmonar e sistêmica com bactérias nosocomiais e oportunistas. A desregulação imunológica combinada com a infecção bacteriana está associada ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes queimados7.
Um modelo de queimadura e infecção animal é essencial para estudar a patogênese de infecções bacterianas após danos à pele e imunossupressão associados ao trauma de queimadura. Tais modelos permitem o desenho e avaliação de novos métodos para o tratamento de infecções bacterianas em pacientes queimados. Ratos e humanos compartilham características fisiológicas e patológicas da pele semelhantes que foram previamente documentadas8. Além disso, os ratos são menores em tamanho, tornando-os mais fáceis de manusear, mais acessíveis e mais fáceis de adquirir e manter do que os modelos animais maiores.
Essas características fazem dos ratos um animal modelo ideal para o estudo de queimaduras e infecções9. Infelizmente, a técnica de indução de queimaduras é inconsistente e, muitas vezes, minimamente descrita 10,11,12,13,14. O presente protocolo foi projetado para desenvolver um procedimento simples, econômico e reprodutível para criar uma lesão por queimadura consistente de espessura total em um modelo de rato que simula o cenário clínico e pode ser usado para avaliar a imunossupressão e a infecção bacteriana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte e foram conduzidos de acordo com suas diretrizes estabelecidas. Ratos Sprague Dawley machos e fêmeas (250-300 g) com idades entre 7-9 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro-escuro de 12 h:12 h, com livre acesso a alimentos e água ad libitum. Sempre trabalhe com seu veterinário institucional sobre um plano analgésico antes do início do estudo.
1. Preparando ratos para a queimadura
- Prepare os animais para a queimadura 24 h antes da queimadura.
- Anestesiar o rato com isoflurano a 5% em oxigênio a 100% em uma câmara de indução por 5 min (vazão: 2 L/min) até que a respiração diminua.
- Uma vez que o rato esteja profundamente anestesiado (sem resposta à beliscão do dedo do pé em todos os membros), mova o rato para uma almofada de aquecimento em posição prona e reduza o isoflurano para 1,5% em oxigênio para manutenção através de um cone nasal.
- Para evitar a secagem da córnea após a anestesia e durante o procedimento, aplique lubrificante ocular nas córneas de ambos os olhos usando um aplicador com ponta de algodão.
- Raspe a área dorsal do rato usando um cortador elétrico (veja a Tabela de Materiais) e remova o máximo de pelos possível em um grande retângulo das omoplatas até a base da cauda (Figura 2A).
- Limpe a área raspada com um tecido embebido em solução salina para limpar os pelos soltos. Aplique loção de depilação na área raspada usando um aplicador com ponta de algodão e deixe-o por ~ 3 min.
NOTA: A aplicação da loção de depilação referenciada por mais de 3 minutos induzirá erupções vermelhas na pele. - Limpe a área com uma esponja de gaze molhada duas vezes para remover a loção e evitar a irritação da pele.
- Desligue o isoflurano, remova o cone do nariz e coloque o rato na gaiola de recuperação.
NOTA: Coloque uma almofada de aquecimento na gaiola de recuperação. - Transfira o animal recuperado para uma gaiola de alojamento limpa para o procedimento de queimadura do dia seguinte (pode levar ~ 10-15 minutos para o rato se recuperar da anestesia).
2. Induzindo a lesão por queimadura em ratos
- No dia da queimadura, ajuste a temperatura do banho-maria para 97 °C e coloque as quatro hastes de cobre (420 g cada; Figura 1) no banho-maria 1 h antes do experimento de queimadura para deixar as hastes aquecerem uniformemente.
NOTA: As hastes devem ser imersas na água. Verifique a precisão do visor de temperatura digital usando um termômetro antes do experimento. - Anestesiar o rato, tal como mencionado na secção 1.
- Quando o rato não responder à beliscão do dedo do pé em todos os membros, coloque-o em uma almofada de aquecimento em decúbito ventral com isoflurano a 1,5% em oxigênio para manutenção (Figura 2A).
- Injetar morfina (20 mg/kg de peso corporal) por via intraperitoneal (i.p.) para o tratamento da dor6.
- Verifique a temperatura da água no banho-maria. Configure o temporizador e coloque as luvas resistentes ao calor.
- Retire uma haste de cobre aquecida do banho-maria e toque-a na área do dorso do rato por 7 s para induzir a queimadura.
NOTA: Mantenha uma distância mínima (10-15 cm) entre o banho-maria e o animal para minimizar a perda de calor e não exerça pressão sobre as hastes enquanto induz a queimadura (ou seja, o contato deve ser mantido pela gravidade). - Aplicar quatro queimaduras, usando uma haste por local de queimadura, uma imediatamente após a outra para produzir uma queimadura de contato total de aproximadamente 20% de TBSA (Figura 2B).
- Após a queimadura, ressuscitar o animal por injeção i.p. de solução de Ringer lactato (0,1 mL/g de peso corporal).
NOTA: Use uma solução de campainha de lactato ajustada à temperatura corporal para ressuscitar os ratos. - Desligue o isoflurano, remova o cone do nariz e coloque o rato no tapete de calor para recuperação.
3. Preparação de inóculo bacteriano e infecção
- Estice a amostra congelada de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Staphylococcus aureus ATCC25923 em placas de ágar Muller Hinton (MHA), 2 dias antes do experimento de queimadura.
- No dia seguinte, selecione uma única colônia de bactérias cultivadas da placa e, usando um laço de inoculação, raspe-a levemente da placa. Em seguida, coloque-o no tubo de cultura para inocular 10 mL de caldo de Muller Hinton (MHB) e cultive durante a noite a 37 °C em um agitador de incubadora.
- No dia da queimadura e infecção, centrifugar a cultura a 4.000 × g por 5 min. Lave o pellet com solução salina normal (solução de NaCl a 0,9%).
- Ressuspeite o pellet bacteriano em solução salina e dilua até 0,1 OD 600nm (densidade óptica a600 nm). Diluir o inóculo bacteriano tomando 200 μL desta suspensão bacteriana e misturando-o com 800 μL de solução salina para obter o inóculo bacteriano desejado de 2 × 107 UFC/mL.
- Injetar 50 μL de inóculo de P. aeruginosa ou S. aureupreparado na etapa anterior (dose de infecção 1 × 106 UFC) no rato anestesiado 15 min após a queimadura, usando uma agulha 29 G por via subcutânea o mais próximo possível da ferida queimada.
- Depois de infectar a ferida de queimadura, coloque o rato na almofada de aquecimento para recuperação. Uma vez que o animal se recupere (~ 15-20 min), abrigue-o em uma gaiola limpa.
NOTA: Após a lesão por queimadura, abrigue um rato por gaiola. Use pellets de alimentos molhados com água para facilitar a mastigação e coloque-os no chão da gaiola para facilitar o acesso. - Encha os frascos de água na gaiola com água com espinhos de morfina (0,4 mg/mL) para o controle da dor.
NOTA: A morfina oral espelha a situação clínica com pacientes com queimaduras humanas. Este estudo utilizou morfina oral para manter esses experimentos comparáveis a pacientes com queimaduras humanas após consulta com a equipe veterinária em várias ocasiões. Os registros de consumo e peso foram mantidos durante todo o experimento. Use o mesmo sistema de beber durante todos os procedimentos. Outros analgésicos, como a buprenorfina, podem ser administrados por via subcutânea/intraperitoneal, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com os animais. - Preencha a lista de verificação de monitoramento e monitore os animais de perto quanto a angústia ou doença durante toda a duração do experimento.
4. Avaliação da lesão por queimadura
- Avalie a lesão por queimadura cutânea morfologicamente em termos de cor e margem imediatamente após a lesão por queimadura.
- Coloração da pele queimada com hematoxilina e eosina (H & E) para visualizar a estrutura da ferida queimada e o gap epitelial15 (ver etapa 5.6 para o processamento da amostra).
5. Pós-processamento de amostras de ratos e enumeração bacteriana
- Eutanasiar o rato às 24, 48 e 72 h após a queimadura com uma overdose de anestesia.
- Retire amostras de sangue dos ratos através de punção cardíaca e colete-as em um mini tubo de coleta.
- Analise hemogramas completos das amostras de sangue para determinar o efeito da indução de queimaduras no sistema imunológico do hospedeiro.
- Colha pele, tecido subcutâneo, músculo, pulmão e baço no momento da eutanásia.
NOTA: Mantenha uma parte (~ 1 cm × 1 cm; pesando ~ 200-300 mg) da pele para coloração H & E e outra parte para enumeração bacteriana. - Colete os tecidos em um tubo de coleta de 10 mL e coloque-os em solução salina normal no gelo para enumeração bacteriana.
- Normalizar o peso do tecido com solução salina normal e homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de tecido (consulte a Tabela de Materiais).
- Diluir serialmente os homogeneizados teciduais em solução salina normal.
- Placa de 100 μL de homogeneizado não diluído e todas as diluições de cada amostra de tecido em placas de ágar cetrimida para amostras colhidas de ratos infectados com P. aeruginosa.
NOTA: Utilizar placas de ágar manitol para chapear amostras colhidas de ratos infectados com S. aureus. - Incubar as placas a 37 °C numa incubadora durante 16-18 h.
- No dia seguinte, conte as colônias bacterianas nas placas, multiplique pela razão de diluição para obter a contagem de UFC/mL e normalize com o peso do tecido para calcular o tecido UFC/g.
- Empregar software de análise de dados para plotar as contagens bacterianas em diferentes órgãos nos diferentes pontos de tempo de amostragem.
- Realize a coloração H&E da pele queimada para visualizar a estrutura da ferida e a lacuna epitelial.
- Usando tesoura e pinça dentada, corte um remendo de pele de 1 cm x 1 cm da área queimada e mergulhe-o em um fixador (formalina tamponada 10% neutra, NBF) por 48 h à temperatura ambiente.
NOTA: Gire o recipiente para garantir que todos os tecidos estejam completamente imersos no fixador, com o volume do fixador 30x o volume do tecido. - Desidratar o tecido cutâneo com etanol a 70% (v/v) por 72 h à temperatura ambiente.
- Processe as amostras desidratadas em blocos de parafina para cortar as seções e corar com H&E15.
- Fotografe digitalmente os slides manchados em um scanner de slides (consulte a Tabela de Materiais) usando uma objetiva de 40x.
- Analise a imagem digitalizada usando software (consulte o Arquivo Suplementar 1 para processamento da imagem para análise; consulte a Tabela de Materiais).
- Examine todos os campos da seção da pele corada para avaliar a condição da epiderme, derme, tecido subcutâneo e músculo esquelético.
- Usando tesoura e pinça dentada, corte um remendo de pele de 1 cm x 1 cm da área queimada e mergulhe-o em um fixador (formalina tamponada 10% neutra, NBF) por 48 h à temperatura ambiente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo aqui apresentado é altamente reprodutível e resultou em uma lesão por queimadura de terceiro grau, de espessura total, em ratos. A ferida da queimadura aparece branca cerosa após a indução da queimadura (Figura 2B). A cor da lesão por queimadura mudou de branca para marrom ao longo de 72 h pós-queimadura (Figura 2B-E).
A análise histológica confirmou queimadura de espessura total (profundidade >2,61 mm às 24 h pós-queimadura; Figura 3B). Em comparação com a pele intacta não queimada, amostras de pele de animais queimados mostraram evidências de lesão em todas as camadas às 24, 48 e 72 h após a queimadura (Figura 3). Além disso, a análise histológica mostrou destruição completa da camada epidérmica e dano à espessura total da derme com envolvimento de gordura subcutânea e músculo esquelético (Figura 3B).
Para avaliar a depuração bacteriana, vários tecidos foram colhidos às 24, 48 e 72 h após infecção por P. aeruginosa e S. aureus. As bactérias foram recuperadas do local da infecção para todos os ratos queimados (Figura 4A,B). Além disso, o número de bactérias recuperadas da pele de ratos queimados foi menor do que o inóculo inicial para P. aeruginosa em 24 h após a infecção, enquanto as amostras de tecido obtidas às 48 e 72 h após queimadura e infecção mostraram um aumento na carga bacteriana (Figura 4A). Em contraste, um aumento de 2 log10 foi observado em todos os momentos para S. aureus na pele em comparação com o inóculo inicial (Figura 4B). Isso sugere que S. aureus foi capaz de estabelecer a infecção por causa de sua replicação ativa nos tecidos e não apenas por causa da imunossupressão induzida pela lesão por queimadura.
Diferentes camadas da pele (ou seja, tecido subcutâneo, músculos e órgãos distais) também foram analisadas para examinar a disseminação bacteriana. O tecido subcutâneo e os músculos apresentaram maior carga bacteriana do que o pulmão e o baço. Tomados em conjunto, esses dados mostram que ratos queimados desenvolvem uma infecção sistêmica 24 h ou 48 h após a inoculação da ferida com P. aeruginosa (Figura 4A) ou S. aureus, respectivamente (Figura 4B). Hemogramas completos também foram obtidos usando um analisador de hematologia (ver Tabela de Materiais) no início do estudo e 72 h após a queimadura. A contagem total de glóbulos brancos diminuiu ao longo do tempo, indicando imunossupressão. A contagem de neutrófilos diminuiu após a queimadura, mas aumentou após a infecção em 72 h em comparação com a linha de base (Tabela 1). No entanto, aumentos na contagem de glóbulos vermelhos e plaquetas foram observados após queimadura e infecção, indicando inflamação sistêmica.
Figura 1: Haste de cobre empregada para infligir indução de queimaduras. O peso da haste personalizada é de 420 g com 5,4 cm de diâmetro e 6,4 cm de altura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Vista macroscópica do lado dorsal do rato antes e após a indução da queimadura. (A) Dorso do rato após o barbear, (B) imediatamente após a lesão da queimadura, (C) 24 h após a queimadura, (D) 48 h após a queimadura e (E) 72 h após a queimadura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas das seções transversais coradas por H&E para cada nível de gravidade da queimadura. (A) A histologia da pele simulada de rato mostra uma clara distinção entre as camadas de tecido epiderme, derme e subcutânea. (B) A histologia da pele 24 h pós-queimadura mostra epiderme atenuada com dano coagulativo a toda a espessura da derme e do tecido subcutâneo com profundidade máxima de queimadura de >2,61 mm. (C) Às 48 h pós-queimadura, a profundidade máxima da queimadura foi de 2,35 mm, e (D) às 72 h pós-queimadura, a profundidade máxima de queimadura foi de 2,20 mm. As imagens foram digitalizadas com ampliação de 40x. Barras de escala = 500 μm (A-D). Abreviação: H&E = hematoxilina e eosina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação da carga bacteriana em diferentes órgãos após infecção da ferida queimada. Os ratos foram infectados com 6 log UFC da bactéria através de injeções subcutâneas 15 min após a lesão por queimadura. Pele, tecido subcutâneo, músculo, pulmão e baço foram coletados às 24, 48 e 72 h após a infecção para determinar a progressão da doença sistêmica. Três ratos foram utilizados em cada ponto de tempo. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Abreviação: UFC = unidades formadoras de colônias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de célula | Linha de base (DP médio ±) | 72 h Não infectado (DP médio ±) | 72 h-Infectados (média ± DP) |
| Glóbulos Brancos (109/L) | 16,9 ± 4,9 | 7,1 ± 2,0 | 6,50 ± 5,5 |
| Neutrófilo (109/L); (%) | 4,0 ± 1,1; (24,3 ± 2,8) | 1,4 ± 0,4; (20,2 ± 5,7) | 1,88 ± 1,0; (35,0 ± 12,4) |
| Linfócitos (109/L); (%) | 11.6 ± 4.1; (68,5 ± 1,7) | 4,8 ± 1,7; (66,5 ± 7,6) | 3,54 ± 3,9; (46,4 ± 17,0) |
| Monócitos (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5,4 ± 1,5) | 0,8 ± 0,2; (11,5 ± 1,6) | 1,0 ± 0,6; (17,3 ± 5,5) |
| Glóbulos vermelhos (1012/L) | 7,5 ± 0,3 | 7,1 ± 0,8 | 10,0 ± 1,1 |
| Hemoglobina (g/dL) | 14,3 ± 0,7 | 13,4 ± 1,0 | 18,6 ± 2,0 |
| Plaquetas (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tabela 1: Parâmetros hematológicos antes e após a queimadura e infecção. Abreviação: HCT = hematócrito.
Arquivo Suplementar 1: Etapas para analisar imagens de H & E no Aperio ImageScope. Abreviação: H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vários modelos de queimaduras têm sido apresentados para estudar a fisiopatologia da lesão por queimadura 8,12,16,17. No presente estudo, empregamos um modelo de rato para desenvolver um protocolo simples e reprodutível para induzir uma queimadura de espessura total seguida de infecção bacteriana para simular um trauma de queimadura infectado em pacientes. A escolha do rato como modelo animal para imitar as condições humanas é baseada em um equilíbrio de custo, facilidade de uso, reprodutibilidade e confiabilidade dos dados. O modelo de rato aqui utilizado tem muitas vantagens sobre os demais: é de fácil manuseio e é o modelo de queima mais comumente usado, o que permite comparações em toda a literatura. Apesar de o rato ser amplamente utilizado no ambiente experimental, os tegumentos de ratos e humanos não são histologicamente idênticos18,19. O tegumento do rato é composto pela pele, uma camada gordurosa conhecida como panniculus adiposus, e sob esta camada há uma bainha de tecido conjuntivo solto associado ao tecido adiposo branco e músculo liso formando uma camada conhecida como panniculus carnosus. A última camada está ausente na maior parte do tegumento humano. Isso é significativo, uma vez que suas células musculares lisas promovem uma contração rápida e ampla da ferida20. Além disso, deve-se notar que os mecanismos de cicatrização de feridas de ratos são substancialmente diferentes dos humanos8. Assim, os pesquisadores devem ter isso em mente ao interpretar os resultados do protocolo descrito neste artigo. No entanto, a utilidade do modelo de ratos para o estudo de queimaduras localizadas e sepse pós-queimadura é inquestionável e produziu dados abundantes que são clinicamente confiáveis e transferíveis21. Além disso, os ratos têm mais área de superfície em comparação com outros animais pequenos, o que permite a indução de feridas de queimadura relativamente maiores, tornando-se um bom modelo para estudos de queimaduras clinicamente relevantes.
Diferentes métodos de indução de queimaduras foram publicados, incluindo água fervente16, barra de latão aquecida22, molde de alumínio aquecido17, uma placa quente de temperatura constante colocada sobre hastes de aço inoxidável23 e escaldamento de mais de 45% da superfície corporal24. Um protocolo experimental ideal teria a capacidade de alcançar feridas de queimadura que são consistentes em tamanho e profundidade. No presente estudo, 420 g de hastes de cobre aquecidas em água a 97 °C foram utilizadas para transferir o calor através da condutância direta para induzir a queimadura. Durante a indução da queimadura, as hastes foram tocadas diretamente na superfície da pele sem a aplicação de qualquer pressão externa, pois a condutância de energia térmica de uma estrutura sólida para uma superfície da pele não depende da pressão empregada, mas sim do gradiente de temperatura 25 e da distância entre a estrutura sólida e a pele17,25. Os fatores que determinaram a escolha do metal incluíram a condutividade térmica e a capacidade de resistir à ferrugem e corrosão.
O cobre tem uma alta condutividade térmica (398 W / mK; onde W é calor em Watts, m é área em metros, K é temperatura em kelvin) em comparação com aço inoxidável, alumínio ou latão com 16 W / mK, 225 W / mK e 109 W / mK, respectivamente9. As hastes metálicas de alta condutividade térmica dissipariam a energia térmica mais rapidamente para os tecidos da pele do que as hastes de baixa condutividade térmica e induziriam um nível mais profundo de queimadura dentro da mesma duração de exposição. Além disso, o tamanho e o peso da haste foram alometricamente dimensionados a partir do modelo de queimadura em camundongos 7,26,27 e induzem uma queimadura de TBSA de aproximadamente 20%. Uma haste de 1,9 cm de diâmetro (a área total de queima é de 11,3cm2 em um rato após quatro aplicações) foi dimensionada para 5,4 cm de diâmetro (a área total de queima é de 91,6 cm 2 em um rato após quatro aplicações) para induzir uma queimadura semelhante de ~20%-30% de TBSA em rato (TBSA de um rato de 220 g é de 356,0 cm2)28, considerando que o TBSA de rato é 6x maior que o rato (TBSA de um rato de 20 g é de 61,2 cm2)29. Os resultados demonstram claramente que esse método induziu queimadura de espessura total, e a análise histológica indicou excelente contraste entre os tecidos cutâneos normais e queimados em diferentes momentos pós-queimadura (Figura 3). Esse modelo também foi capaz de captar a imunossupressão, que é observada em pacientes após lesão por queimadura30,31 (Tabela 1).
As infecções bacterianas são uma ameaça importante que compromete o processo de cicatrização de pacientes queimados e, muitas vezes, são a principal causa de morbidade e mortalidade após lesões por queimaduras. Para simular condições semelhantes, o rato foi infectado após uma lesão por queimadura com P. aeruginosa ou S. aureus. Inicialmente, tentamos a aplicação tópica das bactérias, mas a aparência cerosa da superfície da queimadura inibiu a absorção do inóculo bacteriano. Esse modelo também foi capaz de recapitular a progressão sistêmica da doença após infecção bacteriana do local da queimadura, como visto com a carga bacteriana recuperada do pulmão e do baço (Figura 4). Em conclusão, demonstramos um método simples e reprodutível para a criação de queimaduras de espessura total que exibem muitas das características observadas em queimaduras humanas. Este protocolo pode ajudar no estudo de uma ampla variedade de novas terapêuticas tópicas para o tratamento de feridas de queimaduras infectadas. Este modelo também pode ser usado como um modelo custo-efetivo para avaliar diferentes curativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Divisão de Medicina Comparada da Universidade da Carolina do Norte pelo fornecimento e cuidado dos animais. Agradecemos a Lauren Ralph e Mia Evangelista no Núcleo de Serviços de Patologia pela assistência técnica especializada com Histopatologia / Patologia Digital, incluindo seccionamento de tecidos e imagens. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa de pesquisa do Departamento de Defesa (número do Prêmio W81XWH-20-1-0500, GR e TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
