Summary
يعد النموذج الذي يحاكي السيناريو السريري لإصابة الحروق والعدوى ضروريا لتعزيز أبحاث الحروق. يوضح البروتوكول الحالي نموذجا بسيطا وقابلا للتكرار لعدوى حرق الفئران يمكن مقارنته بنظيره الموجود في البشر. هذا يسهل دراسة الحروق والالتهابات بعد الحرق لتطوير علاجات المضادات الحيوية الموضعية الجديدة.
Abstract
يتم وصف منهجيات تحريض الحرق بشكل غير متسق في نماذج الفئران. يعد نموذج جرح الحروق الموحد ، الذي يمثل السيناريو السريري ، ضروريا لإجراء أبحاث الحروق القابلة للتكرار. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإنشاء ~ 20٪ إجمالي مساحة سطح الجسم (TBSA) حروق كاملة السماكة في الفئران. هنا ، تم تطبيق قضيب نحاسي 22.89 سم2 (قطر 5.4 سم) تم تسخينه عند 97 درجة مئوية في حمام مائي على سطح جلد الفئران للحث على إصابة الحرق. كان قضيب النحاس ذو الموصلية الحرارية العالية قادرا على تبديد الحرارة بشكل أعمق في أنسجة الجلد لإحداث حرق كامل السماكة. يظهر تحليل الأنسجة البشرة الموهنة مع تلف تجلط الدم إلى المدى الكامل للسمك الكامل للأدمة والأنسجة تحت الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، يمثل هذا النموذج الحالات السريرية التي لوحظت في مرضى الحروق في المستشفى بعد إصابة الحروق مثل عدم التنظيم المناعي والالتهابات البكتيرية. يمكن للنموذج تلخيص العدوى البكتيرية الجهازية بواسطة كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام. في الختام ، تقدم هذه الورقة نموذجا قويا وسهل التعلم لحرق الفئران يحاكي الحالات السريرية ، بما في ذلك عدم التنظيم المناعي والالتهابات البكتيرية ، وهو أمر ذو فائدة كبيرة لتطوير أدوية مضادات حيوية موضعية جديدة لجروح الحروق والالتهابات.
Introduction
تعد إصابات الحروق من بين أكثر أشكال الصدمات تدميرا ، حيث تصل معدلات الوفيات إلى 12٪ حتى في مراكز الحروقالمتخصصة 1،2،3. وفقا للتقارير المنشورة مؤخرا ، ~ 486,000 مريض حروق يحتاجون إلى رعاية طبية سنويا في الولايات المتحدة ، مع ما يقرب من 3,500 حالة وفاة 1,2,3,4,5,6. تفرض إصابة الحروق تحديا كبيرا لجهاز المناعة لدى المرضى وتخلق جرحا مفتوحا كبيرا ، وهو بطيء الشفاء ، مما يجعلهم عرضة للاستعمار الجلدي والرئوي والجهازي ببكتيريا المستشفيات والانتهازية. يرتبط عدم التنظيم المناعي جنبا إلى جنب مع العدوى البكتيرية بزيادة المراضة والوفيات في مرضى الحروق7.
يعد نموذج حرق الحيوانات والعدوى ضروريا لدراسة التسبب في الالتهابات البكتيرية بعد تلف الجلد وقمع المناعة المرتبط بصدمة الحروق. تتيح هذه النماذج تصميم وتقييم طرق جديدة لعلاج الالتهابات البكتيرية لدى مرضى الحروق. تشترك الفئران والبشر في خصائص فسيولوجية ومرضية جلدية متشابهة تم توثيقها مسبقا8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران أصغر حجما ، مما يجعلها أسهل في التعامل معها ، وبأسعار معقولة ، وأسهل في الشراء والصيانة من النماذج الحيوانية الكبيرة.
هذه الخصائص تجعل الفئران حيوانا نموذجيا مثاليا لدراسة الحروق والالتهابات9. لسوء الحظ ، فإن تقنية تحريض الحرق غير متسقة وغالبا ما يتم وصفها بالحد الأدنى10،11،12،13،14. تم تصميم البروتوكول الحالي لتطوير إجراء بسيط وفعال من حيث التكلفة وقابل للتكرار لإنشاء إصابة حروق كاملة السماكة متسقة في نموذج الفئران الذي يحاكي السيناريو السريري ويمكن استخدامه لتقييم قمع المناعة والعدوى البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة نورث كارولينا وتم إجراؤها وفقا لإرشاداتها المعمول بها. تم استخدام ذكور وإناث فئران Sprague Dawley (250-300 جم) الذين تتراوح أعمارهم بين 7-9 أسابيع في التجارب. تم إيواء جميع الحيوانات في دورة 12 ساعة: 12 ساعة من الضوء والظلام مع حرية الوصول إلى الطعام والماء حسب الحاجة. اعمل دائما مع طبيبك البيطري المؤسسي حول خطة مسكنة قبل بدء الدراسة.
1. تحضير الفئران لإصابة الحروق
- تحضير الحيوانات لإصابة الحروق قبل 24 ساعة من الحرق.
- تخدير الفئران بنسبة 5٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ في غرفة الحث لمدة 5 دقائق (معدل التدفق: 2 لتر / دقيقة) حتى يتباطأ التنفس.
- بمجرد تخدير الجرذ بعمق (لا يستجيب لقرصة إصبع القدم على جميع الأطراف) ، انقل الجرذ إلى وسادة تدفئة في وضع الانبطاح وقلل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ في الأكسجين للصيانة من خلال مخروط الأنف.
- لمنع جفاف القرنية بعد التخدير وأثناء العملية ، ضع مادة تشحيم العين على قرنيات كلتا العينين باستخدام قضيب ذو رأس قطني.
- حلق المنطقة الظهرية للفأر باستخدام مقص كهربائي (انظر جدول المواد) وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الشعر في مستطيل كبير من لوحي الكتف وصولا إلى قاعدة الذيل (الشكل 2 أ).
- نظف المنطقة المحلوقة بمنديل منقوع في محلول ملحي لمسح الشعر المتساقط. ضعي غسول إزالة الشعر على المنطقة المحلوقة باستخدام قضيب برأس قطني واتركيه لمدة ~ 3 دقائق.
ملاحظة: تطبيق غسول إزالة الشعر المشار إليه لأكثر من 3 دقائق سيؤدي إلى ظهور طفح جلدي أحمر على الجلد. - امسح المنطقة بإسفنجة شاش مبللة مرتين لإزالة المستحضر ومنع تهيج الجلد.
- قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، وإزالة مخروط الأنف ، ووضع الفئران في قفص الانتعاش.
ملاحظة: ضع وسادة تدفئة في قفص الاسترداد. - نقل الحيوان المستعاد إلى قفص سكن نظيف لإجراء الحرق في اليوم التالي (قد يستغرق الأمر ~ 10-15 دقيقة حتى يتعافى الجرذ من التخدير).
2. إحداث إصابة الحروق في الفئران
- في يوم الحرق ، اضبط درجة حرارة حمام الماء على 97 درجة مئوية وضع جميع قضبان النحاس الأربعة (420 جم لكل منها ؛ الشكل 1) في حمام مائي 1 ساعة قبل تجربة الحرق للسماح للقضبان بالتسخين بشكل موحد.
ملاحظة: يجب غمر القضبان في الماء. تحقق من دقة عرض درجة الحرارة الرقمية باستخدام مقياس حرارة قبل التجربة. - تخدير الفئران كما هو مذكور في القسم 1.
- بمجرد أن لا يستجيب الجرذ لقرصة إصبع القدم على جميع الأطراف ، ضعه على وسادة تدفئة في وضع الانبطاح مع 1.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين للصيانة (الشكل 2 أ).
- حقن المورفين (20 ملغ/كغ من وزن الجسم) عبر الطريق داخل الصفاق (i.p.) للتحكمفي الألم 6.
- تحقق من درجة حرارة الماء في حمام مائي. قم بإعداد المؤقت وارتداء القفازات المقاومة للحرارة.
- أخرج قضيبا نحاسيا ساخنا من الحمام المائي ولمسه على المنطقة الظهرية للفأر لمدة 7 ثوان للحث على الحرق.
ملاحظة: حافظ على مسافة لا تقل (10-15 سم) بين الحمام المائي والحيوان لتقليل فقد الحرارة ، ولا تضغط على القضبان أثناء إحداث الحرق (أي يجب الحفاظ على التلامس عن طريق الجاذبية). - ضع أربعة حروق ، باستخدام قضيب واحد لكل موقع حرق ، واحدا تلو الآخر مباشرة لإنتاج ما يقرب من 20٪ من حرق TBSA كامل التلامس (الشكل 2 ب).
- بعد الحرق ، إنعاش الحيوان عن طريق حقن i.p. من محلول رينغر المرضع (0.1 مل / غرام من وزن الجسم).
ملاحظة: استخدم محلول رنين الرضاعة المعدل بدرجة حرارة الجسم لإنعاش الفئران. - قم بإيقاف تشغيل isoflurane ، وإزالة مخروط الأنف ، ووضع الفئران على حصيرة الحرارة للتعافي.
3. إعداد اللقاح البكتيري والعدوى
- قم بخط العينة المجمدة من Pseudomonas aeruginosa PAO1 والمكورات العنقودية الذهبيةATCC25923 على ألواح Muller Hinton Agar (MHA) ، قبل يومين من تجربة الحرق.
- في اليوم التالي ، حدد مستعمرة واحدة من البكتيريا المزروعة من اللوحة ، وباستخدام حلقة التلقيح ، كشطها قليلا من اللوحة. ثم ضعه في أنبوب الاستزراع لتلقيح 10 مل من مرق مولر هينتون (MHB) واستزراعه طوال الليل عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة.
- في يوم الحرق والعدوى ، أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 4000 × غرام لمدة 5 دقائق. اغسل الحبيبات بمحلول ملحي عادي (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪).
- أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في محلول ملحي وقم بتخفيفها حتى 0.1 OD600nm (الكثافة البصرية عند 600 نانومتر). قم بتخفيف اللقاح البكتيري عن طريق أخذ 200 ميكرولتر من هذا المعلق البكتيري وخلطه مع 800 ميكرولتر من المحلول الملحي للحصول على اللقاح البكتيري المطلوب من 2 × 107 CFU / mL.
- حقن 50 ميكرولتر من لقاح P. aeruginosa أو S. aureus المحضر في الخطوة السابقة (جرعة العدوى 1 × 106 CFU) في الجرذ المخدر بعد 15 دقيقة من الحرق ، باستخدام إبرة 29 G تحت الجلد بالقرب من جرح الحرق قدر الإمكان.
- بعد إصابة جرح الحرق ، ضع الفئران على وسادة التدفئة للتعافي. بمجرد أن يتعافى الحيوان (~ 15-20 دقيقة) ، ضعه في قفص نظيف.
ملاحظة: بعد إصابة الحرق ، قم بإيواء فأر واحد لكل قفص. استخدم كريات الطعام الرطبة بالماء لسهولة المضغ وضعها على أرضية القفص لسهولة الوصول إليها. - املأ زجاجات المياه في القفص بالماء المسنن بالمورفين (0.4 مجم / مل) لإدارة الألم.
ملاحظة: يعكس المورفين الفموي الحالة السريرية مع مرضى الحروق البشرية. استخدمت هذه الدراسة المورفين عن طريق الفم للحفاظ على هذه التجارب قابلة للمقارنة مع مرضى الحروق البشرية بعد التشاور مع الطاقم البيطري في مناسبات عديدة. تم الحفاظ على سجلات الشرب والوزن طوال التجربة. استخدم نفس نظام الشرب خلال جميع الإجراءات. يمكن إعطاء المسكنات الأخرى ، مثل البوبرينورفين ، تحت الجلد / داخل الصفاق وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية الحيوانات. - املأ قائمة مراجعة المراقبة وراقب الحيوانات عن كثب بحثا عن الضيق أو المرض طوال مدة التجربة.
4. تقييم إصابة الحروق
- تقييم إصابة حروق الجلد شكليا من حيث اللون والهامش مباشرة بعد إصابة الحرق.
- قم بتلطيخ الجلد المحروق بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) لتصور بنية جرح الحرق والفجوة الظهارية15 (انظر الخطوة 5.6 لمعالجة العينات).
5. المعالجة اللاحقة لعينات الفئران والتعداد البكتيري
- القتل الرحيم للفأر في 24 و 48 و 72 ساعة بعد الحرق بجرعة زائدة من التخدير.
- سحب عينات الدم من الفئران عن طريق ثقب القلب وجمعها في أنبوب جمع صغير.
- تحليل تعداد الدم الكامل من عينات الدم لتحديد تأثير تحريض الحرق على الجهاز المناعي المضيف.
- حصاد الجلد والأنسجة تحت الجلد والعضلات والرئة والطحال في وقت القتل الرحيم.
ملاحظة: احتفظ بجزء واحد (~ 1 سم × 1 سم ؛ يزن ~ 200-300 مجم) من الجلد لتلطيخ H& E وجزء آخر للتعداد البكتيري. - اجمع الأنسجة في أنبوب تجميع سعة 10 مل وضعها في محلول ملحي طبيعي على الثلج لتعداد البكتيريا.
- تطبيع وزن الأنسجة بالمحلول الملحي الطبيعي وتجانس العينات باستخدام خالط الأنسجة (انظر جدول المواد).
- تمييع تسلسليا تجانس الأنسجة في المياه المالحة العادية.
- صفيحة 100 ميكرولتر من التجانس غير المخفف وجميع التخفيفات لكل عينة من الأنسجة على ألواح أجار السيتريميد للعينات التي تم جمعها من الفئران المصابة ب P. aeruginosa.
ملاحظة: استخدم ألواح مانيتول أجار لطلاء العينات التي تم جمعها من الفئران المصابة بالمكورات العنقودية الذهبية. - احتضان لوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 16-18 ساعة.
- في اليوم التالي ، عد المستعمرات البكتيرية على الألواح ، واضربها في نسبة التخفيف للحصول على عدد CFU / mL ، وقم بتطبيعها مع وزن الأنسجة لحساب أنسجة CFU / g.
- استخدام برامج تحليل البيانات لرسم الأعداد البكتيرية في الأعضاء المختلفة في نقاط زمنية مختلفة لأخذ العينات.
- قم بإجراء تلطيخ H& E للجلد المحروق لتصور بنية الجرح والفجوة الظهارية.
- باستخدام المقص والملقط المسنن ، قم بقطع رقعة جلدية بحجم 1 سم × 1 سم من منطقة الحرق واغمرها في مثبت (10٪ فورمالين محايد ، NBF) لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بتدوير الحاوية لضمان غمر جميع الأنسجة تماما في المثبت ، مع حجم المثبت 30x حجم الأنسجة. - تجفيف أنسجة الجلد بنسبة 70٪ (v / v) من الإيثانول لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بمعالجة العينات المجففة في كتل البارافين لقطع الأقسام وتلطيخها باستخدام H&E15.
- قم بتصوير الشرائح الملطخة رقميا في ماسح ضوئي للشرائح (انظر جدول المواد) باستخدام هدف 40x.
- تحليل الصورة الممسوحة ضوئيا باستخدام البرنامج (انظر الملف التكميلي 1 لمعالجة الصورة للتحليل؛ انظر جدول المواد).
- فحص جميع مجالات قسم الجلد الملون لتقييم حالة البشرة والأدمة والأنسجة تحت الجلد والعضلات الهيكلية.
- باستخدام المقص والملقط المسنن ، قم بقطع رقعة جلدية بحجم 1 سم × 1 سم من منطقة الحرق واغمرها في مثبت (10٪ فورمالين محايد ، NBF) لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار بدرجة كبيرة وأدى إلى إصابة حروق كاملة السماكة من الدرجة الثالثة في الفئران. يظهر جرح الحرق أبيض شمعي بعد تحريض الحرق (الشكل 2 ب). تغير لون إصابة الحرق من الأبيض إلى البني على مدار 72 ساعة بعد الحرق (الشكل 2B-E).
أكد التحليل النسيجي وجود حرق كامل السماكة (عمق >2.61 مم عند 24 ساعة بعد الحرق. الشكل 3 ب). مقارنة بالجلد السليم غير المحترق ، أظهرت عينات الجلد من الحيوانات المحترقة دليلا على الإصابة عبر جميع الطبقات في 24 و 48 و 72 ساعة بعد إصابة الحرق (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر التحليل النسيجي تدميرا كاملا لطبقة البشرة وتلفا في السماكة الكاملة للأدمة بمشاركة الدهون تحت الجلد والعضلات الهيكلية (الشكل 3 ب).
لتقييم التخليص البكتيري ، تم حصاد الأنسجة المختلفة في 24 و 48 و 72 ساعة بعد الإصابة ب P. aeruginosa و S. aureus. تم انتشال البكتيريا من موقع العدوى لجميع الفئران المصابة بالحروق (الشكل 4 أ ، ب). علاوة على ذلك ، كان عدد البكتيريا المستعادة من جلد الفئران المحترقة أقل من اللقاح الأولي ل P. aeruginosa في 24 ساعة بعد الإصابة ، في حين أظهرت عينات الأنسجة التي تم الحصول عليها في 48 و 72 ساعة بعد الحرق والعدوى زيادة في العبء البكتيري (الشكل 4 أ). في المقابل ، لوحظت زيادة 2 log10 في جميع النقاط الزمنية للمكورات العنقودية الذهبية في الجلد مقارنة باللقاح الأولي (الشكل 4B). هذا يشير إلى أن المكورات العنقودية الذهبية كانت قادرة على إثبات العدوى بسبب تكاثرها النشط في الأنسجة وليس فقط بسبب كبت المناعة الناجم عن إصابة الحروق.
كما تم تحليل طبقات مختلفة من الجلد (أي الأنسجة تحت الجلد والعضلات والأعضاء البعيدة) لفحص الانتشار البكتيري. أظهرت الأنسجة والعضلات تحت الجلد حمولة بكتيرية أعلى من الرئة والطحال. تظهر هذه البيانات مجتمعة أن الفئران المحترقة تصاب بعدوى جهازية بعد 24 ساعة أو 48 ساعة بعد تلقيح الجرح باستخدام P. aeruginosa (الشكل 4A) أو S. aureus ، على التوالي (الشكل 4B). كما تم الحصول على تعداد الدم الكامل باستخدام محلل أمراض الدم (انظر جدول المواد) عند خط الأساس و 72 ساعة بعد إصابة الحروق. انخفض إجمالي عدد خلايا الدم البيضاء بمرور الوقت ، مما يشير إلى قمع المناعة. انخفض عدد العدلات بعد الحرق ولكنه زاد بعد الإصابة عند 72 ساعة مقارنة بخط الأساس (الجدول 1). ومع ذلك ، لوحظت زيادات في عدد خلايا الدم الحمراء والصفائح الدموية بعد الحرق والعدوى ، مما يشير إلى التهاب جهازي.
الشكل 1: قضيب نحاسي يستخدم لإحداث تحريض الحرق. يبلغ وزن القضيب المصنوع حسب الطلب 420 جم وقطره 5.4 سم وارتفاعه 6.4 سم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: منظر عياني للجانب الظهري للفئران قبل تحريض الحرق وبعده. أ: ظهر الجرذ بعد الحلاقة، ب: مباشرة بعد إصابة الحرق، ج: 24 ساعة بعد الحرق، د: 48 ساعة بعد الحرق، ه: 72 ساعة بعد الحرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية لمقاطع عرضية ملطخة باليد و E لكل مستوى من شدة الحرق. (أ) تظهر أنسجة جلد الفئران الوهمية تمييزا واضحا بين البشرة والأدمة وطبقات الأنسجة تحت الجلد. (ب) تظهر أنسجة الجلد بعد 24 ساعة من الحرق البشرة الموهنة مع تلف تجلط الدم للسمك الكامل للأدمة والأنسجة تحت الجلد مع أقصى عمق للحرق يبلغ >2.61 مم. (ج) عند 48 ساعة بعد الحرق ، كان أقصى عمق للحرق 2.35 مم ، و (د) عند 72 ساعة بعد الحرق ، كان أقصى عمق للحرق 2.20 مم. تم مسح الصور ضوئيا بتكبير 40x. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (A-D). اختصار: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: القياس الكمي للحمل البكتيري في الأعضاء المختلفة بعد إصابة جرح الحرق. أصيبت الفئران ب 6 سجل CFU من البكتيريا عن طريق الحقن تحت الجلد بعد 15 دقيقة من إصابة الحرق. تم جمع الجلد والأنسجة تحت الجلد والعضلات والرئة والطحال في 24 و 48 و 72 ساعة بعد الإصابة لتحديد تطور المرض الجهازي. تم استخدام ثلاثة فئران في كل نقطة زمنية. أ: الزائفة الزنجارية PA01، (ب) المكورات العنقودية الذهبية ATCC25923. اختصار: CFU = وحدات تشكيل مستعمرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع الخلية | خط الأساس (متوسط ± SD) | 72 ساعة غير مصاب (متوسط ± SD) | 72 ساعة مصابة (متوسط ± SD) |
| خلايا الدم البيضاء (109 / لتر) | 16.9 ± 4.9 | 7.1 ± 2.0 | 6.50 ± 5.5 |
| العدلات (109 / لتر) ؛ (%) | 4.0 ± 1.1 ؛ (24.3 ± 2.8) | 1.4 ± 0.4 ؛ (20.2 ± 5.7) | 1.88 ± 1.0 ؛ (35.0 ± 12.4) |
| الخلايا الليمفاوية (109 / لتر) ؛ (%) | 11.6 ± 4.1 ؛ (68.5 ± 1.7) | 4.8 ± 1.7 ؛ (66.5 ± 7.6) | 3.54 ± 3.9 ؛ (46.4 ± 17.0) |
| وحيدات (109 / لتر) ؛ (%) | 0.9 ± 0.3 ؛ (5.4 ± 1.5) | 0.8 ± 0.2 ؛ (11.5 ± 1.6) | 1.0 ± 0.6 ؛ (17.3 ± 5.5) |
| خلايا الدم الحمراء (1012 / لتر) | 7.5 ± 0.3 | 7.1 ± 0.8 | 10.0 ± 1.1 |
| الهيموغلوبين (جم / ديسيلتر) | 14.3 ± 0.7 | 13.4 ± 1.0 | 18.6 ± 2.0 |
| الصفائح الدموية (109 / لتر) | 723.3 ± 353.1 | 942.7 ± 43.1 | 1359.0 ± 228.5 |
| كليات التقنية العليا (٪) | 45.6 ± 3.0 | 39.9 ± 3.7 | 55.7 ± 8.2 |
الجدول 1: معلمات أمراض الدم قبل وبعد الإصابة بالحروق والعدوى. اختصار: HCT = الهيماتوكريت.
الملف التكميلي 1: خطوات تحليل صور H&E في Aperio ImageScope. اختصار: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تقديم العديد من نماذج الحروق لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الحروق8،12،16،17. في الدراسة الحالية ، استخدمنا نموذجا للفئران لتطوير بروتوكول بسيط وقابل للتكرار للحث على حرق كامل السمك متبوعا بعدوى بكتيرية لمحاكاة صدمة حروق مصابة في المرضى. يعتمد اختيار الجرذ كنموذج حيواني لتقليد الظروف البشرية على توازن التكلفة وسهولة الاستخدام وقابلية التكاثر وموثوقية البيانات. يتميز نموذج الفئران المستخدم هنا بالعديد من المزايا مقارنة بالآخرين: فهو سهل التعامل معه وهو نموذج الحرق الأكثر استخداما ، والذي يسمح بإجراء مقارنات عبر الأدبيات. على الرغم من استخدام الفئران على نطاق واسع في البيئة التجريبية ، إلا أن تكامل الفئران والإنسان ليس متطابقا من الناحية النسيجية18,19. يتكون تكامل الجرذ من الجلد ، وهي طبقة دهنية تعرف باسم panniculus adiposus ، وتحت هذه الطبقة يوجد غمد من النسيج الضام الرخو المرتبط بالأنسجة الدهنية البيضاء والعضلات الملساء التي تشكل طبقة تعرف باسم panniculus carnosus. الطبقة الأخيرة غائبة في معظم التكامل البشري. هذا أمر مهم ، لأن خلايا العضلات الملساء تعزز تقلص الجرح بسرعة ووافرة20. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن آليات التئام الجروح للفئران تختلف اختلافا كبيرا عن آليات البشر8. ومن ثم ، يجب على الباحثين أن يضعوا ذلك في الاعتبار عند تفسير نتائج البروتوكول الموصوف في هذه الورقة. على الرغم من ذلك ، فإن فائدة نموذج الفئران لدراسة إصابات الحروق الموضعية والإنتان بعد الحرق لا جدال فيها وقد أنتجت بيانات غزيرة موثوقة سريريا وقابلة للنقل21. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع الفئران بمساحة سطح أكبر مقارنة بالحيوانات الصغيرة الأخرى ، مما يسمح بتحريض جروح حروق أكبر نسبيا ، مما يجعلها نموذجا جيدا لدراسات الحروق ذات الصلة سريريا.
تم نشر طرق مختلفة لتحريض الحرق ، بما في ذلك الماء المغلي16 ، وقضيب النحاس الساخن22 ، وقالب الألمنيوم الساخن17 ، ولوحة تسخين بدرجة حرارة ثابتة موضوعة فوق قضبان الفولاذ المقاوم للصدأ23 ، وحرق أكثر من 45٪ من سطح الجسم24. سيكون للبروتوكول التجريبي المثالي القدرة على تحقيق جروح حروق متسقة في الحجم والعمق. في الدراسة الحالية ، تم استخدام قضبان نحاسية 420 جم مسخنة في الماء عند 97 درجة مئوية لنقل الحرارة من خلال التوصيل المباشر لتحفيز الحرق. أثناء تحريض الحرق ، تم لمس القضبان مباشرة على سطح الجلد دون تطبيق أي ضغط خارجي ، حيث أن توصيل الطاقة الحرارية من بنية صلبة إلى سطح الجلد لا يعتمد على الضغط المستخدم بل على تدرج درجة الحرارة 25 والمسافة بين الهيكل الصلب والجلد17,25. وشملت العوامل التي حددت اختيار المعدن التوصيل الحراري والقدرة على مقاومة الصدأ والتآكل.
النحاس لديه موصلية حرارية عالية (398 واط / مللي كلفن ؛ حيث W هي الحرارة بالواط ، m هي المساحة بالأمتار ، K هي درجة الحرارة بالكلفن) مقارنة بالفولاذ المقاوم للصدأ أو الألومنيوم أو النحاس الأصفر مع 16 W / mK و 225 W / mK و 109 W / mK ، على التوالي9. ستعمل القضبان المعدنية عالية التوصيل الحراري على تبديد الطاقة الحرارية بشكل أسرع إلى أنسجة الجلد من قضبان التوصيل الحراري المنخفض وتحفز مستوى أعمق من الحرق خلال نفس مدة التعرض. بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس حجم ووزن القضيب بشكل متآلف من نموذج الحرق في الفئران7،26،27 ويؤدي إلى حرق TBSA بنسبة 20٪ تقريبا. تم تحجيم قضيب قطره 1.9 سم (إجمالي مساحة الاحتراق 11.3 سم 2 في فأر بعد أربعة تطبيقات) إلى قطر 5.4 سم (إجمالي مساحة الاحتراق 91.6 سم 2 في فأر بعد أربعة تطبيقات) للحث على حرق TBSA مماثل ~ 20٪ -30٪ في الفئران (TBSA لفأر 220 جم هو 356.0 سم2) 28 ، بالنظر إلى أن TBSA للفأر أكبر 6 مرات من الفأر (TBSA للفأر 20 جم هو 61.2 سم2)29. تظهر النتائج بوضوح أن هذه الطريقة تسببت في حرق كامل السماكة ، وأشار التحليل النسيجي إلى تباين ممتاز بين أنسجة الجلد الطبيعية والمحروقة في نقاط زمنية مختلفة بعد الحرق (الشكل 3). كان هذا النموذج قادرا أيضا على التقاط قمع المناعة ، والذي لوحظ في المرضى بعد إصابة الحروق30,31 (الجدول 1).
تشكل الالتهابات البكتيرية تهديدا مهما يضر بعملية شفاء مرضى الحروق وغالبا ما تكون السبب الرئيسي للمراضة والوفيات بعد إصابات الحروق. لمحاكاة ظروف مماثلة ، أصيب الجرذ بعد إصابة حروق إما مع P. aeruginosa أو S. aureus. في البداية ، جربنا التطبيق الموضعي للبكتيريا ، لكن المظهر الشمعي لسطح الحرق منع امتصاص اللقاح البكتيري. كان هذا النموذج قادرا أيضا على تلخيص تطور المرض الجهازي بعد العدوى البكتيرية لموقع الحرق كما يظهر مع العبء البكتيري المستعاد من الرئة والطحال (الشكل 4). في الختام ، أظهرنا طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لإنشاء حروق كاملة السماكة تظهر العديد من الميزات التي لوحظت في إصابات الحروق البشرية. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في دراسة مجموعة واسعة من العلاجات الموضعية الجديدة لعلاج جروح الحروق المصابة. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج كنموذج فعال من حيث التكلفة لتقييم ضمادات الجروح المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون قسم الطب المقارن في جامعة نورث كارولينا على توفير الحيوانات ورعايتها. نشكر لورين رالف وميا إيفانجليستا في مركز خدمات علم الأمراض للمساعدة الفنية المتخصصة في علم أمراض الأنسجة / علم الأمراض الرقمي ، بما في ذلك تقسيم الأنسجة والتصوير. تم دعم هذا البحث بمنحة بحثية من وزارة الدفاع (رقم الجائزة W81XWH-20-1-0500 ، GR والتلفزيون).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
