Summary
Een model dat het klinische scenario van brandwond en infectie nabootst, is noodzakelijk voor het bevorderen van brandwondenonderzoek. Het huidige protocol demonstreert een eenvoudig en reproduceerbaar rattenbrandinfectiemodel dat vergelijkbaar is met dat bij mensen. Dit vergemakkelijkt de studie van brandwonden en infecties na brandwond voor het ontwikkelen van nieuwe actuele antibioticabehandelingen.
Abstract
Brandinductiemethoden worden inconsistent beschreven in rattenmodellen. Een uniform brandwondmodel, dat het klinische scenario weergeeft, is nodig om reproduceerbaar brandwondenonderzoek uit te voeren. Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode om ~20% totale lichaamsoppervlakte (TBSA) brandwonden van volledige dikte bij ratten te creëren. Hier werd een koperen staaf van 22,89 cm2 (5,4 cm diameter) verwarmd tot 97 °C in een waterbad op het huidoppervlak van de rat aangebracht om de brandwond op te wekken. Een koperen staaf met een hoge thermische geleidbaarheid was in staat om de warmte dieper in het huidweefsel af te voeren om een brandwond van volledige dikte te creëren. Histologieanalyse toont verzwakte epidermis met stollingsschade aan de volledige dikte van de dermis en het onderhuidse weefsel. Bovendien is dit model representatief voor de klinische situaties die worden waargenomen bij gehospitaliseerde brandwondenpatiënten na brandwonden, zoals immuunontregeling en bacteriële infecties. Het model kan de systemische bacteriële infectie door zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën samenvatten. Kortom, dit artikel presenteert een gemakkelijk te leren en robuust rattenbrandmodel dat de klinische situaties nabootst, waaronder immuunontregeling en bacteriële infecties, wat van groot nut is voor de ontwikkeling van nieuwe actuele antibiotica voor brandwonden en infecties.
Introduction
Brandwonden behoren tot de meest verwoestende vormen van trauma, met sterftecijfers die 12% bereiken, zelfs in gespecialiseerde brandwondencentra 1,2,3. Volgens onlangs gepubliceerde rapporten hebben ~ 486.000 brandwondenpatiënten jaarlijks medische zorg nodig in de Verenigde Staten, met bijna 3.500 sterfgevallen 1,2,3,4,5,6. Brandwonden vormen een grote uitdaging voor het immuunsysteem van patiënten en creëren een aanzienlijke open wond, die langzaam geneest, waardoor ze vatbaar zijn voor huid-, long- en systemische kolonisatie met nosocomiale, opportunistische bacteriën. Immuunontregeling in combinatie met de bacteriële infectie is geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij brandwondenpatiënten7.
Een dierlijk brand- en infectiemodel is essentieel voor het bestuderen van de pathogenese van bacteriële infecties na huidbeschadiging en immuunsuppressie geassocieerd met brandwondentrauma. Dergelijke modellen maken het ontwerp en de evaluatie van nieuwe methoden voor de behandeling van bacteriële infecties bij brandwondenpatiënten mogelijk. Ratten en mensen delen vergelijkbare huidfysiologische en pathologische kenmerken die eerder zijn gedocumenteerd8. Bovendien zijn ratten kleiner van formaat, waardoor ze gemakkelijker te hanteren, betaalbaarder en gemakkelijker te verkrijgen en te onderhouden zijn dan grotere diermodellen.
Deze eigenschappen maken ratten een ideaal modeldier om brandwonden en infecties te bestuderen9. Helaas is de techniek voor brandwondinductie inconsistent en vaak minimaal beschreven 10,11,12,13,14. Het huidige protocol is ontworpen om een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare procedure te ontwikkelen voor het creëren van een consistente brandwond van volledige dikte in een rattenmodel dat het klinische scenario simuleert en kan worden gebruikt om immuunsuppressie en bacteriële infectie te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van North Carolina en werden uitgevoerd in overeenstemming met de vastgestelde richtlijnen. Mannelijke en vrouwelijke Sprague Dawley-ratten (250-300 g) van 7-9 weken oud werden gebruikt voor de experimenten. Alle dieren werden gehuisvest in een licht-donkercyclus van 12 uur met vrije toegang tot voedsel en water ad libitum. Werk altijd samen met uw dierenarts over een pijnstillend plan voorafgaand aan de start van het onderzoek.
1. Ratten voorbereiden op de brandwond
- Bereid de dieren 24 uur voor op brandwonden 24 uur voorafgaand aan de brandwond.
- Verdoof de rat met 5% isofluraan in 100% zuurstof in een inductiekamer gedurende 5 minuten (stroomsnelheid: 2 L/min) totdat de ademhaling is vertraagd.
- Zodra de rat diep verdoofd is (niet reagerend op teenknijpen op alle ledematen), verplaatst u de rat naar een verwarmingskussen in buikligging en vermindert u de isofluraan tot 1,5% zuurstof voor onderhoud door een neuskegel.
- Om uitdroging van het hoornvlies na anesthesie en tijdens de procedure te voorkomen, brengt u oogglijmiddel aan op de hoornvliezen van beide ogen met behulp van een applicator met katoenpunt.
- Scheer het dorsale gebied van de rat met behulp van een elektrische tondeuse (zie de tabel met materialen) en verwijder zoveel mogelijk haar in een grote rechthoek van de schouderbladen tot aan de basis van de staart (figuur 2A).
- Reinig het geschoren gebied met een tissue gedrenkt in zoutoplossing om de losse haren weg te vegen. Breng ontharingslotion aan op het geschoren gebied met behulp van een applicator met katoenpunt en laat het ~ 3 minuten intrekken.
OPMERKING: Toepassing van de genoemde ontharingslotion gedurende meer dan 3 minuten zal rode uitslag op de huid veroorzaken. - Veeg het gebied twee keer af met een nat gaasspons om de lotion te verwijderen en huidirritatie te voorkomen.
- Schakel de isofluraan uit, verwijder de neuskegel en plaats de rat in de herstelkooi.
OPMERKING: Plaats een verwarmingskussen in de herstelkooi. - Breng het herstelde dier over naar een schone huisvestingskooi voor de brandwondenprocedure van de volgende dag (het kan ~ 10-15 minuten duren voordat de rat herstelt van de anesthesie).
2. Het opwekken van de brandwond bij ratten
- Stel op de dag van de verbranding de temperatuur van het waterbad in op 97 °C en plaats alle vier de koperen staven (elk 420 g; Figuur 1) in het waterbad 1 uur voorafgaand aan het brandexperiment om de staafjes gelijkmatig op te laten warmen.
OPMERKING: De staven moeten in het water worden ondergedompeld. Controleer de nauwkeurigheid van de digitale temperatuurweergave met behulp van een thermometer vóór het experiment. - Verdoof de rat zoals vermeld in rubriek 1.
- Zodra de rat niet reageert op teenknijpen op alle ledematen, plaats hem dan op een verwarmingskussen in buikligging met 1,5% isofluraan in zuurstof voor onderhoud (figuur 2A).
- Injecteer morfine (20 mg/kg lichaamsgewicht) via de intraperitoneale (i.p.) route voor pijnbestrijding6.
- Controleer de temperatuur van het water in het waterbad. Stel de timer in en trek de hittebestendige handschoenen aan.
- Haal een verwarmde koperen staaf uit het waterbad en raak deze gedurende 7 s aan op het dorsumgebied van de rat om de brandwond op te wekken.
OPMERKING: Houd een minimale afstand (10-15 cm) tussen het waterbad en het dier om warmteverlies te minimaliseren en oefen geen druk uit op de staven tijdens het induceren van de verbranding (d.w.z. contact moet worden gehandhaafd door de zwaartekracht). - Breng vier brandwonden aan, met behulp van één staaf per brandplaats, de ene onmiddellijk na de andere om een ongeveer 20% TBSA-brandwond met volledig contact te produceren (figuur 2B).
- Na de brandwond reanimeert u het dier door i.p. injectie van ringeroplossing met lactatie (0,1 ml/g lichaamsgewicht).
OPMERKING: Gebruik een voor de lichaamstemperatuur aangepaste ringeroplossing om de ratten te reanimeren. - Schakel de isofluraan uit, verwijder de neuskegel en plaats de rat op de warmtemat voor herstel.
3. Bereiding van bacterieel entmateriaal en infectie
- Streep het ingevroren monster van Pseudomonas aeruginosa PAO1 en Staphylococcus aureus ATCC25923 op Muller Hinton Agar (MHA) platen, 2 dagen voorafgaand aan het brandexperiment.
- Selecteer de volgende dag een enkele kolonie gekweekte bacteriën van de plaat en schraap deze met behulp van een inentlus enigszins van de plaat. Plaats het vervolgens in de kweekbuis om 10 ml Muller Hinton Broth (MHB) te enten en een nacht bij 37 °C in een incubatorschudder te kweken.
- Op de dag van de verbranding en infectie, centrifugeer de cultuur op 4.000 × g gedurende 5 minuten. Was de pellet met een normale zoutoplossing (0,9% NaCl-oplossing).
- Resuspendeer de bacteriële pellet in zoutoplossing en verdun tot 0,1 OD 600nm (optische dichtheid bij600 nm ). Verdun het bacteriële entmateriaal door 200 μL van deze bacteriële suspensie te nemen en te mengen met 800 μL zoutoplossing om het gewenste bacteriële entmateriaal van 2 × 107 CFU / ml te krijgen.
- Injecteer 50 μL P. aeruginosa of S. aureus inoculum bereid in de vorige stap (infectiedosis 1 × 106 CFU) in de verdoofde rat 15 minuten na de brandwond, met behulp van een naald van 29 G subcutaan zo dicht mogelijk bij de brandwond.
- Na het infecteren van de brandwond, plaatst u de rat op het verwarmingskussen voor herstel. Zodra het dier herstelt (~ 15-20 min), plaats het in een schone kooi.
OPMERKING: Na de brandwond, huis één rat per kooi. Gebruik water natvoerkorrels om gemakkelijk te kauwen en plaats ze op de vloer van de kooi voor gemakkelijk bereik. - Vul de waterflessen in de kooi met morfine-spiked water (0,4 mg / ml) voor pijnbestrijding.
OPMERKING: Orale morfine weerspiegelt de klinische situatie met menselijke brandwondenpatiënten. Deze studie gebruikte orale morfine om deze experimenten vergelijkbaar te houden met menselijke brandwondenpatiënten na overleg met het veterinaire personeel bij tal van gelegenheden. Drink- en gewichtslogboeken werden gedurende het hele experiment bijgehouden. Gebruik hetzelfde drinksysteem tijdens alle procedures. Andere analgetica, zoals Buprenorfine, kunnen subcutaan / intraperitoneaal worden toegediend volgens de richtlijnen voor institutionele dierverzorging. - Vul de controlechecklist in en controleer de dieren nauwlettend op angst of ziekte gedurende de gehele duur van het experiment.
4. Evaluatie van het brandwondje
- Evalueer de huidverbranding morfologisch in termen van kleur en marge onmiddellijk na de brandwond.
- Bevlek de verbrande huid met hematoxyline en eosine (H&E) om de wondstructuur en epitheliale spleet15 te visualiseren (zie stap 5.6 voor monsterverwerking).
5. Nabewerking van rattenmonsters en bacteriële inventarisatie
- Euthanaseer de rat op 24, 48 en 72 uur na de verbranding met een overdosis anesthesie.
- Neem bloedmonsters van de ratten via een hartpunctie en verzamel ze in een mini-opvangbuisje.
- Analyseer volledige bloedtellingen van de bloedmonsters om het effect van brandwondinductie op het immuunsysteem van de gastheer te bepalen.
- Oogst huid, onderhuids weefsel, spieren, longen en milt op het moment van euthanasie.
OPMERKING: Houd een deel (~ 1 cm × 1 cm; met een gewicht van ~ 200-300 mg) van de huid voor H &E-kleuring en een ander deel voor bacteriële inventarisatie. - Verzamel de weefsels in een opvangbuis van 10 ml en plaats ze in een normale zoutoplossing op ijs voor bacteriële opsomming.
- Normaliseer het weefselgewicht met een normale zoutoplossing en homogeniseer de monsters met behulp van een weefselhomogenisator (zie de tabel met materialen).
- Verdun de weefselhomogenaten serieel in normale zoutoplossing.
- Plaat 100 μL onverdund homogenaat en alle verdunningen van elk weefselmonster op cetrimide agarplaten voor monsters verzameld van ratten die besmet zijn met P. aeruginosa.
OPMERKING: Gebruik mannitol agarplaten voor het plating monsters verzameld van ratten besmet met S. aureus. - Incubeer de platen bij 37 °C in een incubator gedurende 16-18 uur.
- Tel de volgende dag de bacteriekolonies op de platen, vermenigvuldig met de verdunningsverhouding om het aantal CFU / ml te krijgen en normaliseer met het gewicht van het weefsel om het CFU / g-weefsel te berekenen.
- Gebruik data-analysesoftware om de bacterietellingen in verschillende organen op de verschillende bemonsteringstijdstippen te plotten.
- Voer H &E-kleuring van verbrande huid uit om de wondstructuur en epitheliale opening te visualiseren.
- Knip met een schaar en een tandtang een huidpleister van 1 cm x 1 cm van het brandwondengebied en dompel deze gedurende 48 uur bij kamertemperatuur onder in een fixatief (10% neutraal gebufferd formaline, NBF).
OPMERKING: Draai de container om ervoor te zorgen dat alle weefsels volledig zijn ondergedompeld in het fixatief, met het volume van het fixatief 30x het weefselvolume. - Droog het huidweefsel uit met 70% (v/v) ethanol gedurende 72 uur bij kamertemperatuur.
- Verwerk de gedehydrateerde monsters in paraffineblokken om de secties te snijden en te kleuren met H &E15.
- Breng de gekleurde dia's digitaal in beeld in een diascanner (zie de Materiaaltabel) met behulp van een 40x-objectief.
- Analyseer de gescande afbeelding met behulp van software (zie Aanvullend bestand 1 voor de verwerking van de afbeelding voor analyse; zie de materiaaltabel).
- Onderzoek alle velden van het gekleurde huidgedeelte om de toestand van de opperhuid, dermis, onderhuids weefsel en skeletspieren te evalueren.
- Knip met een schaar en een tandtang een huidpleister van 1 cm x 1 cm van het brandwondengebied en dompel deze gedurende 48 uur bij kamertemperatuur onder in een fixatief (10% neutraal gebufferd formaline, NBF).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol is zeer reproduceerbaar en resulteerde in een derdegraads brandwond van volledige dikte bij ratten. De brandwond ziet er wasachtig wit uit na brandwondinductie (figuur 2B). De kleur van het brandwond veranderde van wit naar bruin in de loop van 72 uur na de verbranding (figuur 2B-E).
Histologische analyse bevestigde een brandwond van volledige dikte (diepte >2,61 mm 24 uur na verbranding; Figuur 3B). Vergeleken met intacte niet-verbrande huid, vertoonden huidmonsters van brandwondendieren bewijs van letsel in alle lagen op 24, 48 en 72 h na brandwond (figuur 3). Bovendien toonde histologische analyse volledige vernietiging van de epidermale laag en schade aan de volledige dikte van de dermis met betrokkenheid van onderhuids vet en skeletspieren (figuur 3B).
Om de bacteriële klaring te evalueren, werden verschillende weefsels geoogst na 24, 48 en 72 uur na infectie met P. aeruginosa en S. aureus. Op de plaats van de infectie werden bacteriën teruggevonden voor alle ratten met brandwonden (figuur 4A,B). Bovendien was het aantal bacteriën dat werd teruggevonden uit de huid van brandwondenratten minder dan het oorspronkelijke entmateriaal voor P. aeruginosa 24 uur na infectie, terwijl weefselmonsters verkregen op 48 en 72 uur na verbranding en infectie een toename van de bacteriële belasting vertoonden (figuur 4A). Daarentegen werd op alle tijdstippen een toename van 2 log10 waargenomen voor S. aureus in de huid in vergelijking met het initiële entmateriaal (figuur 4B). Dit suggereert dat S. aureus in staat was om een infectie vast te stellen vanwege de actieve replicatie in de weefsels en niet alleen vanwege immunosuppressie geïnduceerd door de brandwond.
Verschillende lagen van de huid (d.w.z. onderhuids weefsel, spieren en distale organen) werden ook geanalyseerd om bacteriële verspreiding te onderzoeken. Het onderhuidse weefsel en de spieren vertoonden een hogere bacteriële belasting dan de long en milt. Samen laten deze gegevens zien dat brandwondenratten 24 uur of 48 uur na wondinenting met respectievelijk P. aeruginosa (figuur 4A) of S. aureus een systemische infectie ontwikkelen (figuur 4B). Volledige bloedtellingen werden ook verkregen met behulp van een hematologieanalysator (zie de tabel met materialen) bij baseline en 72 h na brandwond. Het totale aantal witte bloedcellen nam in de loop van de tijd af, wat wijst op immuunsuppressie. Het aantal neutrofielen daalde na verbranding, maar nam toe na infectie na 72 uur in vergelijking met de uitgangswaarde (tabel 1). Echter, verhogingen van het aantal rode bloedcellen en bloedplaatjes werden waargenomen na brandwond en infectie, wat wijst op systemische ontsteking.
Figuur 1: Koperen staaf gebruikt om brandinductie toe te brengen. Het gewicht van de op maat gemaakte hengel is 420 g met een diameter van 5,4 cm en een hoogte van 6,4 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Macroscopisch beeld van de dorsale zijde van de rat voor en na de inductie van de brandwond. (A) Rat dorsum na het scheren, (B) onmiddellijk na brandwond, (C) 24 uur na verbranding, (D) 48 uur na verbranding en (E) 72 uur na verbranding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve afbeeldingen van H&E-gekleurde doorsneden voor elk niveau van brandernst. (A) De histologie van schijnrattenhuid toont een duidelijk onderscheid tussen epidermis, dermis en onderhuidse weefsellagen. (B) Huidhistologie 24 h na verbranding toont verzwakte epidermis met stollingsschade aan de volledige dikte van de dermis en het onderhuidse weefsel met een maximale branddiepte van >2,61 mm. (C) Bij 48 h na verbranding was de maximale branddiepte 2,35 mm en (D) 72 h na verbranding was de maximale branddiepte 2,20 mm. Beelden werden gescand met een vergroting van 40x. Schaalstaven = 500 μm (A-D). Afkorting: H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van bacteriële belasting in verschillende organen na infectie van brandwond. Ratten werden 15 minuten na de brandwond besmet met 6 log CFU van de bacterie via subcutane injecties. Huid, onderhuids weefsel, spieren, longen en milt werden verzameld op 24, 48 en 72 uur na infectie om de progressie van systemische ziekte te bepalen. Op elk tijdstip werden drie ratten gebruikt. (A) Pseudomonas aeruginosa PA01, (B) Staphylococcus aureus ATCC25923. Afkorting: CFU = kolonievormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celtype | Uitgangswaarde (gemiddelde ± SD) | 72 h Niet-geïnfecteerd (gemiddeld ± SD) | 72 h-geïnfecteerd (gemiddeld ± SD) |
| Witte bloedcellen (109/L) | 16,9 ± 4,9 | 7,1 ± 2,0 | 6,50 ± 5,5 |
| Neutrofiel (109/L); (%) | 4.0 ± 1.1; (24.3 ± 2.8) | 1,4 ± 0,4; (20.2 ± 5.7) | 1,88 ± 1,0; (35.0 ± 12.4) |
| Lymfocyten (109/L); (%) | 11.6 ± 4.1; (68.5 ± 1.7) | 4.8 ± 1.7; (66.5 ± 7.6) | 3,54 ± 3,9; (46.4 ± 17.0) |
| Monocyten (109/L); (%) | 0,9 ± 0,3; (5.4 ± 1.5) | 0,8 ± 0,2; (11.5 ± 1.6) | 1,0 ± 0,6; (17.3 ± 5.5) |
| Rode bloedcellen (1012/L) | 7,5 ± 0,3 | 7,1 ± 0,8 | 10,0 ± 1,1 |
| Hemoglobine (g / dL) | 14,3 ± 0,7 | 13,4 ± 1,0 | 18,6 ± 2,0 |
| Bloedplaatjes (109/L) | 723,3 ± 353,1 | 942,7 ± 43,1 | 1359,0 ± 228,5 |
| HCT (%) | 45,6 ± 3,0 | 39,9 ± 3,7 | 55,7 ± 8,2 |
Tabel 1: Hematologische parameters voor en na het toebrengen en infecteren van brandwonden. Afkorting: HCT = hematocriet.
Aanvullend bestand 1: Stappen voor het analyseren van H&E-afbeeldingen in Aperio ImageScope. Afkorting: H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende brandwondenmodellen zijn gepresenteerd om de pathofysiologie van brandwonden te bestuderen 8,12,16,17. In de huidige studie gebruikten we een rattenmodel om een eenvoudig en reproduceerbaar protocol te ontwikkelen om een brandwond van volledige dikte te induceren, gevolgd door een bacteriële infectie om een geïnfecteerd brandwondentrauma bij patiënten te simuleren. De keuze van de rat als het diermodel om menselijke omstandigheden na te bootsen, is gebaseerd op een balans tussen kosten, gebruiksgemak, reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de gegevens. Het rattenmodel dat hierin wordt gebruikt, heeft veel voordelen ten opzichte van andere: het is gemakkelijk te hanteren en is het meest gebruikte brandmodel, dat vergelijkingen in de literatuur mogelijk maakt. Ondanks dat de rat veel wordt gebruikt in de experimentele setting, zijn ratten en menselijke integumenten niet histologisch identiek18,19. Het omhulsel van de rat bestaat uit de huid, een vetlaag die bekend staat als panniculus adiposus, en onder deze laag bevindt zich een omhulsel van los bindweefsel geassocieerd met wit vetweefsel en gladde spieren die een laag vormen die bekend staat als panniculus carnosus. De laatste laag is afwezig in het grootste deel van het menselijke omhulsel. Dit is van belang, omdat de gladde spiercellen een snelle en ruime wondcontractie bevorderen20. Bovendien moet worden opgemerkt dat de wondgenezingsmechanismen van ratten aanzienlijk verschillen van die van mensen8. Daarom moeten onderzoekers dit in gedachten houden bij het interpreteren van de resultaten van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven. Desondanks is het nut van het rattenmodel voor het bestuderen van gelokaliseerde brandwonden en postburn sepsis onbetwistbaar en heeft het overvloedige gegevens opgeleverd die klinisch betrouwbaar en overdraagbaar zijn21. Bovendien hebben ratten meer oppervlakte in vergelijking met andere kleine dieren, waardoor relatief grotere brandwonden kunnen worden geïnduceerd, waardoor het een goed model is voor klinisch relevante brandwondenstudies.
Verschillende methoden voor brandinductie zijn gepubliceerd, waaronder kokend water16, verwarmde messing staaf 22, verwarmde aluminium sjabloon17, een hete plaat met constante temperatuur geplaatst over roestvrijstalen staven23 en het broeien van meer dan 45% van het lichaamsoppervlak24. Een ideaal experimenteel protocol zou de capaciteit hebben om brandwonden te bereiken die consistent zijn in grootte en diepte. In deze studie werden 420 g koperen staven verwarmd in water van 97 °C gebruikt om de warmte door directe geleiding over te dragen om de verbranding te induceren. Tijdens de brandinductie werden staven direct op het huidoppervlak aangeraakt zonder externe druk uit te oefenen, omdat de thermische energiegeleiding van een vaste structuur naar een huidoppervlak niet afhankelijk is van de gebruikte druk, maar eerder van de temperatuurgradiënt 25 en de afstand tussen de vaste structuur en de huid17,25. De factoren die de keuze van metaal bepaalden, waren thermische geleidbaarheid en het vermogen om roest en corrosie te weerstaan.
Koper heeft een hoge thermische geleidbaarheid (398 W / mK; waarbij W warmte in Watt is, m is oppervlakte in meters, K is temperatuur in kelvin) in vergelijking met roestvrij staal, aluminium of messing met respectievelijk 16 W / mK, 225 W / mK en 109 W / mK,9. Metalen staven met een hoge thermische geleidbaarheid zouden warmte-energie sneller naar de huidweefsels afvoeren dan staven met een lage thermische geleidbaarheid en een dieper niveau van verbranding veroorzaken binnen dezelfde blootstellingsduur. Bovendien werden de grootte en het gewicht van de staaf allometrisch geschaald van het brandmodel bij muizen 7,26,27 en induceert een ongeveer 20% TBSA-verbranding. Een staaf met een diameter van 1,9 cm (totaal brandoppervlak is 11,3 cm 2 in een muis na vier toepassingen) werd geschaald tot 5,4 cm diameter (totaal brandoppervlak is 91,6 cm 2 bij een rat na vier toepassingen) om een vergelijkbare ~ 20% -30% TBSA-verbranding bij ratten te induceren (TBSA van een rat van 220 g is 356,0 cm2)28, gezien het feit dat de TBSA van rat 6x groter is dan de muis (TBSA van een 20 g muis is 61,2 cm2)29. De resultaten tonen duidelijk aan dat deze methode volledige verbranding veroorzaakte, en histologische analyse wees op een uitstekend contrast tussen normale en verbrande huidweefsels op verschillende tijdstippen na de verbranding (figuur 3). Dit model was ook in staat om immuunsuppressie vast te leggen, die wordt waargenomen bij patiënten na brandwonden30,31 (tabel 1).
Bacteriële infecties zijn een belangrijke bedreiging die het genezingsproces van brandwondenpatiënten in gevaar brengen en zijn vaak de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit na brandwonden. Om vergelijkbare omstandigheden te simuleren, werd de rat geïnfecteerd na een brandwond met P. aeruginosa of S. aureus. Aanvankelijk probeerden we topische toepassing van de bacteriën, maar het wasachtige uiterlijk van het brandwondenoppervlak remde de absorptie van het bacteriële entmateriaal. Dit model was ook in staat om systemische ziekteprogressie na bacteriële infectie van de brandwondenplaats samen te vatten, zoals gezien met bacteriële belasting hersteld uit de longen en milt (figuur 4). Kortom, we hebben een eenvoudige en reproduceerbare methode gedemonstreerd voor het creëren van brandwonden van volledige dikte die veel van de kenmerken vertonen die worden waargenomen bij menselijke brandwonden. Dit protocol kan helpen bij het bestuderen van een breed scala aan nieuwe actuele therapieën voor de behandeling van geïnfecteerde brandwonden. Dit model kan ook worden gebruikt als een kosteneffectief model voor het evalueren van verschillende wondverbanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de afdeling Vergelijkende Geneeskunde aan de Universiteit van North Carolina voor de verstrekking en verzorging van dieren. We bedanken Lauren Ralph en Mia Evangelista in de Pathology Services Core voor deskundige technische assistentie met histopathologie / digitale pathologie, inclusief weefselsectie en beeldvorming. Dit onderzoek werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van het Ministerie van Defensie (Award nummer W81XWH-20-1-0500, GR en TV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
References
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M.
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. Physiological Responses to Burning Injury. , Academic Press. (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh's constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N.
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V.
